Microscopie à cohérence optique plein champ pour l’analyse histologique des caractéristiques stromales dans les greffes de cornée

Cette méthode peut améliorer le dépistage et la sélection des tissus cornéens donneurs dans les banques oculaires, améliorer les résultats de la greffe de cornée. Le principal avantage de cette technique est sa capacité d’évaluation à haute résolution et le fait que la cornée reste immergée dans une chambre fermée remplie de support de stockage tout au long de l’acquisition d’images, diminuant ainsi tout risque potentiel de contamination. Maelle Vilbert, titulaire d’un doctorat de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, placez la cornée immergée dans le milieu de stockage dans le porte-échantillon avec l’épithélium vers le haut. Placez un couvercle de silice propre fourni avec le porte-échantillon sur le dessus de la cornée. Ensuite, fermez le support en tournant doucement sa base jusqu’à ce que l’échantillon soit légèrement aplati et immobilisé sous la glissière de couverture, fournissant une surface d’imagerie relativement uniforme.

Prenez des précautions pour éviter toute bulle d’air. Appliquez une couche épaisse de gel ophtalmique ou optique sur le couvercle comme milieu d’immersion. Initialisez l’appareil en allumant l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’appareil.

L’éclairage d’une LED verte à l’avant de l’appareil indique que l’appareil est sous tension. Assurez-vous que l’étape d’imagerie est dégagée, à l’exception du plateau mobile. Cliquez ensuite sur OK dans le logiciel d’acquisition pour initialiser les moteurs à l’invite.

Pour configurer l’appareil, entrez un exemple d’identificateur dans le champ désigné et obligatoire. Et si vous le souhaitez, entrez un exemple de description et une description de l’étude. Ensuite, cliquez sur Acquérir l’image macro pour créer un instantané de l’exemple qui peut ensuite être utilisé à des fins de positionnement latéral et de navigation.

Une fois satisfait, validez l’image à l’invite en cliquant sur Oui. Après quoi, l’appareil déplacera le plateau d’échantillonnage sous l’objectif et effectuera un réglage automatique. Assurez-vous que l’objectif du microscope est bien immergé dans le gel optique avant de continuer.

Préparez l’acquisition en accédant à l’onglet Explorer. Avant d’acquérir une pile d’images, naviguez vers le centre de la cornée via le joystick ou la sélection manuelle à l’écran. Variez la profondeur d’imagerie via la rotation du joystick, le réglage du curseur ou la saisie manuelle du clavier dans l’interface utilisateur graphique.

Ajustez ensuite la valeur moyenne à 40 pour une imagerie cornéenne optimale. Entrez la valeur de la surface cornéenne ou l’emplacement de la première image dans le champ de profondeur. Sélectionnez ensuite l’onglet Acquérir pour acquérir des images.

Sélectionnez et définissez l’espacement des tranches correspondant à la résolution axiale du périphérique. Entrez la valeur d’épaisseur cornéenne sous Nombre de tranches. Passez en revue les paramètres et le temps d’acquisition.

Et lorsque vous êtes satisfait, appuyez sur OK pour lancer l’acquisition. Lors de l’acquisition, évitez tout contact avec la table sur laquelle le microscope est positionné. Pour évaluer l’épaisseur de la couche stromale et de Bowman, mesurer les distances des sections transversales cornéennes.

Par exemple, ajoutez cinq points également espacés sur la coupe transversale comme décrit dans le manuscrit du texte. Tracez une ligne entre deux points de distance connue en fonction du champ de vision par défaut. Ensuite, accédez à l’onglet Analyser et sélectionnez Définir l’échelle.

Entrez la distance et l’unité de longueur connues dans les champs appropriés. Définissez sur 1024 pixels ou 780 micromètres et cliquez sur OK. Tracez une ligne entre deux points de distance inconnue et lisez la longueur ou la distance mesurée directement à partir de la barre d’état. Notez la moyenne et le coefficient de variation.

Cliquez sur l’onglet Image et sélectionnez Reslice Z sous Piles pour déterminer la densité des kératinocytes. Cela additionnera les images stromales en face par groupes de sept pour produire des tranches d’épaisseur comparable. Pour une analyse plus approfondie, incluez toutes les coupes de visage disponibles pour le stroma antérieur, 15 images pour le stroma antérieur, cinq images pour le stroma moyen et cinq images pour le stroma postérieur.

Sur chaque image exposée, sélectionnez une région d’intérêt de 300 x 300 micromètres. Pour améliorer la visualisation du noyau, inversez l’image à l’aide de l’option Inverser sous l’onglet Modifier. Ajustez le contraste et la luminosité en cliquant sur l’onglet Image et en accédant à Luminosité-Contraste.

Pour compter manuellement les noyaux de cellules, accédez à Plugins et accédez à Compteur de cellules sous l’onglet Analyser. Appuyez sur Initialiser, puis sélectionnez un type de compteur. Ensuite, comptez les noyaux cellulaires en cliquant sur les caractéristiques ovales sombres dans l’image inversée, en considérant ceux qui atterrissent sur une bordure d’image uniquement pour deux des quatre côtés de l’image.

La cornée du donneur humain sélectionné a été gonflée après stockage dans un milieu de culture d’organes, ce qui a donné un modèle physiopathologique de la cornée œdémateuse et a empêché l’acquisition d’images sur toute l’épaisseur cornéenne en raison de la profondeur de pénétration limitée. Le transfert vers un milieu de culture d’organes complété par de la dextrine, a réduit l’enflure et a donné des cornées de donneurs d’épaisseur normale. Les cornées malades ont été reconnues par des changements morphologiques et des caractéristiques stromales typiques, y compris une diminution de l’épaisseur stromale variable ou de la couche de Bowman.

L’évaluation de la densité kératinocytaire et de la réflectivité stromale a également contribué à l’analyse histologique et à la différenciation des tissus cornéens normaux des tissus cornéens pathologiques avec la microscopie par cohérence optique plein champ, ce qui dépasse les capacités des systèmes cliniques de tomographie par cohérence optique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse histologique qualitative et quantitative du stroma cornéen permettant de différencier la maladie des tissus cornéens humains normaux.