Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et en biochimie, telles que la façon dont l’assemblage dynamique des protéines et des complexes protéiques contrôle les voies de signalisation et le comportement cellulaire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons isoler spécifiquement deux protéines en interaction, tout en excluant les protéines individuelles non complexées et les partenaires de liaison concurrents. Bien que nous utilisions cette méthode pour donner un aperçu de la dimérisation réceptive de la tyrosine kinase dans le cancer du sein, elle peut également être appliquée à tout autre contexte physiologique ou maladie.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé que le nanocorps GFP reconnaissait l’épitope tridimensionnel de la GFP et d’autres protéines fluorescentes. Pour commencer, ajoutez 150 nanogrammes de vecteur d’entrée, 150 nanogrammes de vecteur de destination et huit microlitres de tampon TE dans un tube de 0,2 millilitre. Ajoutez ensuite deux microlitres de recombinase et de ZiMex, et centrifugez brièvement les deux.

Incuber la réaction pendant une heure à température ambiante, puis ajouter un microlitre de solution de protéinase K et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Ensuite, décongelez des cellules capables de résister aux chocs thermiques sur de la glace. Et transférez 50 microlitres des cellules dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 millilitres.

Ajoutez un microlitre de produit de réaction dans les cellules et mélangez doucement. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace. Ensuite, choquez les cellules dans un bain d’eau à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes avant de les remettre dans la glace.

Ajoutez un millilitre de milieu LB dans les cellules. Et incubez l’échantillon en agitant pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, placez la transformation sur une plaque de gélose de 10 centimètres avec de l’ampicilline et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour commencer la purification plasmidique, ajoutez de l’ampicilline et 100 millilitres de milieu LB dans une grande fiole conique. Ensuite, utilisez une boucle d’inoculation pour prélever une seule colonie de la plaque de gélose. Immergez la boucle d’inoculation dans un milieu LB et mélangez brièvement, puis couvrez le haut du ballon avec du papier d’aluminium et incuberez-le pendant la nuit, à 37 degrés Celsius en agitant.

À partir de là, purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de purification d’ADN plasmidique Maxiprep standard, avant de procéder à la transfection. Tout d’abord, ensemencez les cellules HEK 293T dans des boîtes de 10 centimètres, contenant 10 millilitres de DMEM. Diluez ensuite 2,5 microgrammes de chaque vecteur de complémentation de fluorescence bimoléculaire dans 500 microlitres de tampon de transfection.

Ajoutez 10 microlitres de réactif de transfection et agitez le mélange pendant 10 secondes. Ensuite, centrifugez brièvement les échantillons et incubez-les à température ambiante pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite le mélange de transfection d’ADN goutte à goutte dans le plat.

Ensuite, incubez les échantillons pendant huit à 24 heures. Préparez un tampon de lyse cellulaire et un tampon de lyse cellulaire complété comme indiqué dans le protocole texte. Ensuite, lavez deux fois les cellules avec du PBS glacé.

Aspirez le PBS et ajoutez un millimètre de tampon de lyse cellulaire complété par congélation. Ensuite, placez le plat sur de la glace et incubez pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pour retirer les cellules et transférez-les dans un micro-tube à centrifuger réfrigéré.

Centrifugez le tube à 18 000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, pour éliminer les débris cellulaires, puis transférez le surnageant clair dans un nouveau tube de micro-centrifugation. Lavez un volume approprié de billes d’agarose dans un millilitre de PBS, puis centrifugez les billes à 300 fois la gravité et retirez soigneusement le surnageant. Ajoutez ensuite 20 microlitres de billes d’agarose à chaque échantillon.

Et incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures, avec rotation de bout en bout. Centrifugez les billes à 300 fois la gravité et lavez-les trois fois dans un tampon de lyse cellulaire. Ensuite, mettez à nouveau en suspension les billes lavées dans 50 microlitres de tampon d’échantillon dilué.

Enfin, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant deux à trois minutes. Dans cette étude, la méthode BiCAP est utilisée pour observer une interaction positive pour plusieurs types de protéines environ 16 heures après la co-transfection de HEK293T cellules. La microscopie confocale est utilisée pour observer la dimérisation de la RTKERBB2 au niveau de la membrane plasmique et la liaison de l’ubiquitine à la ligase E3 UBR5.

Après purification par affinité avec le nanocorps GFB, seules la protéine de contrôle Venus sur toute sa longueur, ainsi que les protéines marquées V1 et V2 en interaction peuvent être détectées dans l’échantillon de co-transfection. Lors de cette procédure, n’oubliez pas d’optimiser le placement de l’étiquette de complémentation de fluorescence bimoléculaire et de l’extrémité C-terminale ou N-terminale de votre protéine d’intérêt. Ceci est nécessaire pour observer une interaction protéine/protéine positive.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la technique BiCAP et de la façon de l’appliquer à l’interaction protéique qui vous intéresse. À la suite de cette procédure, de nombreuses techniques de caractérisation en aval pourraient être utilisées, comme ChIPseek pour répondre à des questions supplémentaires, telles que la dimérisation des facteurs de transcription contrôle la liaison à l’ADN.