Name: Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Découvrez une approche en deux étapes pour étudier l'organogenèse chez l'embryon d'oiseau en combinant culture in vitro et greffe in ovo sur membrane chorioallantoïdienne. Cette méthode permet d'explorer les stades précoces et tardifs de formation des organes.

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Les auteurs sont reconnaissants envers António Cidadão, Isabel Alcobia et Leonor Parreira pour la lecture critique du manuscrit, à Padma Akkapeddi pour la narration vidéo, et de Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé de système vidéo et de Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubation de caille fécondés et œufs de poule
<ol><li>Incuber caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) et des oeufs de poulet (Gallus gallus) fécondé pendant 3 à 8 jours, respectivement.<ol>
<li>Placer les oeufs avec la chambre à air (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans un incubateur humidifié à 38 ° C.</li>
		<li>Utiliser des oeufs de caille environ 20 et 40 œufs de poule pour réaliser cette expérience. NOTE : Ces chiffres devraient être doublés lors de l’établissement de cette procédure pour la première fois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolement des cailles région embryonnaire contenant le territoire présomptif des Rudiments du thymus et la glande parathyroïdes
Remarque : Effectuez des oeufs des procédures de manipulation en conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux.
<ol><li>Préparer un bol en verre de borosilicate grand environs 3/4 rempli d’une solution froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Ouvrir un oeuf de caille après 3 jours d’incubation en tapant la coquille et découpe d’une ouverture circulaire sur le côté opposé de son extrémité arrondie avec des ciseaux courbes. Soigneusement, enlever des morceaux de coquilles et transférer l’embryon dans le bol en verre bac à froid.</li>
	<li>Maintenez l’embryon de caille (q) à l’E3 (qE3) (la scène de caille correspondant au HH-stade 21 du poulet) avec l’aide de pinces fines. Faites une coupe dans la membrane vitelline enveloppant le jaune d’oeuf à l’aide de ciseaux courbes. Continuer à couper autour et à l’extérieur de la circonférence des vaisseaux extra embryonnaire.</li>
	<li>Transfert de l’embryon dans un petit bol environ 3/4 de bac à froid à l’aide de pinces fines. Laver soigneusement l’embryon du jaune restant attaché.</li>
	<li>Utiliser une écumoire pour transférer l’embryon à un verre de 100 mm boîte de Pétri avec base noire (voir Table des matières) contenant 10 mL de PBS froid.</li>
	<li>Placer le plat de Pétri sous un stéréomicroscope. Remarque : À partir de ce moment, effectuez les procédures de microchirurgie sous un stéréomicroscope pour grossissement progressif. Comme source d’illumination, il est conseillé d’utiliser des lumières LED intégrées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.</li>
	<li>Tenez l’embryon vers le bas de la plaque avec les broches insectes minces. Placez les quatre broches formant une forme carrée dans la région extra embryonnaire.</li>
	<li>Retirer les membranes extra embryonnaires de la région céphalique avec l’aide de pinces fines et y placer une goupille de cinquième. Remarque : Si l’embryon est correctement positionné, puis la vésicule otique, le tube de coeur et le 1st, 2èmeet 3rd arcs pharyngiens (Fe) doivent être visibles.</li>
	<li>Disséquer la région embryonnaire d’intérêt, c'est-à-dire, le 3rd et 4th de région arc pharyngien (3/4PAR), à l’aide de ciseaux œil Wecker.<ol>
<li>Commencer à couper longitudinalement et parallèlement à l’axe de l’embryon, entre la zone de tube neural/somite et le PAs.</li>
		<li>Retirez le tube de coeur positionnée sur le ventre en le coupant. Garder les ciseaux dans la même position, faire tourner la boîte de Pétri pour repositionner l’embryon selon la direction de la coupe.</li>
		<li>Couper entre les 2ème et 3rd PAs et en dessous de la 4ème PA</li>
		<li>Détacher les membranes restantes de la 3/4PAR avec l’aide de pinces fines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirer les tissus isolés (les 3/4PAR) et le transfert à un plat en verre 3/4 bac à froid à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 2 mL. Remarque : Ci-après, les tissus peuvent être cultivées in vitro jusqu'à 48 heures ou être immédiatement greffés sur la CAM d’un embryon de poulet à E8.</li>
	<li>Garder le plat en verre contenant les 3/4PAR isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro .</li>
</ol>3. essai in Vitro organotypique avec : Culture de la région embryonnaire contenant le territoire présomptif des Rudiments du thymus et la glande parathyroïdes
<ol><li>Préparer le milieu de culture avec RPMI-1640 additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. NOTE : Les réactifs pharmacologiques solubles peuvent être ajoutés au milieu (par exemple, LY-411.575 (Ly) et di-benzazépine ou cyclopamine et vismodegib, pour inhiber l’encoche et Hedgehog (Hh), signalisation, respectivement. Pour ce test, utilisez 50-200 nM de Ly ou de 5 à 15 µM de Di-benzazépine pour inhiber la signalisation Notch dans les 3 / 4PAR. Utilisez 20 µM de cyclopamine ou 10 µM de vismodegib pour inhiber la signalisation de Hh dans le 3/4PAR5.</li>
	<li>Préparer la culture in vitro de l’explant 3/4PP dans une plaque 6 puits.<ol>
<li>Remplir un puits de la plaque 6 puits avec 5 mL de milieu de culture. Placer un Insert Membrane en Polycarbonate de 24 mm (voir Table des matières) sur le puits à l’aide de pinces fines.</li>
		<li>Sous le stéréomicroscope, transférer l’explant 3/4PAR du verre plat à la surface de la membrane en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Placez les explants avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale, au contact de la membrane. Ajouter des explants jusqu'à sept par insertion de la membrane. Passez à l’étape 3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativement, la culture des explants en flottant de membranes filtrantes.<ol>
<li>Préparer un plat de Pétri avec 5 mL de milieu de culture de 35 mm. Avec l’aide de pinces fines, flotteur une membrane filtre (voir la Table des matières) et garder une surface sèche au contact de l’air.</li>
		<li>Sous le stéréomicroscope, transférer l’explant 3/4PAR du verre plat dans le filtre à membrane en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Placez les explants avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale, au contact de la membrane. Ajoutez jusqu'à 8 explants par membrane filtrante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer soigneusement les explants préparés en étapes 3.2 et 3.3 dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2à humidifié.</li>
	<li>Après une incubation de 48 h, sortir la plaque 6 puits et le 35 mm boîte de Pétri de l’incubateur.<ol>
<li>Recueillir les explants cultivés de l’insertion de la membrane de la plaque 6 puits.<ol>
<li>Ajouter PBS à température ambiante (RT) à l’insertion de la membrane.</li>
			<li>Détacher les explants de la membrane en la rinçant vigoureux à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 2 mL.</li>
			<li>Avec l’aide de la spatule et pince fine, transférer les explants cultivés dans un plat de verre 3/4 remplis de PBS à température ambiante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>De même, recueillir les explants cultivés du filtre à membrane flottante dans la boîte de Pétri de 35 mm.<ol>
<li>Transférer le filtre à membrane avec une pince fine à nouveau Pétri 35 mm rempli avec du PBS à température ambiante.</li>
			<li>Détachez les explants de la membrane filtrante en vigoureux pipetage en utilisant une pipette stérile en plastique de 2 mL.</li>
			<li>Avec l’aide de pinces fines, décharge le filtre à membrane exempte d’explant après que confirmant qu’aucun des explants sont restés attachés à elle.</li>
			<li>Avec une spatule et pince fine, transférer les explants dans un plat de verre rempli de PBS à température ambiante.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les explants cultivés avec une spatule à 1 mL de réactif pour l’ARN total et utiliser pour les études de l’expression génique. Mise en garde : L’exposition à ce réactif (voir Table des matières) peut être un danger grave pour la santé. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriées. Suivez les instructions de manipulation et de lire les fiches de données de sécurité fournies par le fabricant.</li>
	<li>Sinon, la greffe des tissus cultivés sur CAM d’embryons de poulet à E8. Procédez à l’étape 4.</li>
</ol>4. préparation de la came
<ol><li>Sortir les oeufs de poule avec 8 jours de développement embryonnaire de l’incubateur. Remarque : Les œufs ont été incubés avec chambre à air face vers le haut à 38 ° C dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Couvrir l’extrémité arrondie de l’oeuf avec un ruban en plastique transparent pour éviter les morceaux de la coque de tomber dans la chambre à air. Appuyez sur la coquille et coupez une ouverture circulaire dans l’oeuf avec des ciseaux courbes. La chambre à air doit être visible.</li>
	<li>Enlever avec précaution la membrane blanche de la chambre à air avec une pince fine. CAM est alors visible et accessible pour la transplantation de tissu ectopique. Remarque : N’utilisez pas de PBS pour hydrater le CAM, avant ou après la transplantation, puisque PBS favorise le glissement et l’égarement des explants. Si la membrane se dessèche, jeter l’oeuf.</li>
</ol>5. greffage des Explants cultivés sur la CAM
<ol><li>Créer des petites lésions vasculaires/blessures dans les petits navires de la came avec un microscalpel dans un support. Remarque : Utilisez la pointe d’une pipette Pasteur pour enlever le sang par capillarité dans le cas d’un saignement excessif.</li>
	<li>Utilisez une spatule et pince fine pour transférer les explants cultivés dans la région blessée de la came.</li>
	<li>Couper un morceau de papier filtre légèrement plus grand que l’explant et placez-le sur le dessus de l’explant. Remarque : Le papier filtre contribue à l’emplacement de l’explant de suivi après son développement dans la came. Il permet également, livraison de drogue quotidienne de l’explant au cours du développement de in ovo , si nécessaire (voir point 5.6).</li>
	<li>Fermer la fenêtre de l’oeuf avec du ruban adhésif en plastique transparent et l’identifier à l’aide d’un crayon de charbon de bois. Remarque : Le ruban en plastique protège l’embryon de déshydratation au cours de la période d’incubation.</li>
	<li>Incuber les œufs manipulé pendant 10 jours dans un incubateur humidifié à 38 ° C. Procédez à l’étape 6.</li>
	<li>Étape facultative : Administration de médicaments quotidienne au cours de la période d’incubation.<ol>
<li>Pour accéder au filtre, partiellement soulever la bande en plastique. Ajouter 100 µL de solution médicamenteuse, goutte à goutte, sur le papier. Refermer la fenêtre et placez l’oeuf dans l’incubateur humidifié à 38 ° C. Remarque : Pour ce test, la dose de 20 µM de cyclopamine nuira à Hh signalisation lors dans ovo développement5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. la Formation des organes ectopique dans la came après 10 jours de In Ovo Development
<ol><li>Après 10 jours d’incubation, sortir le œuf de l’incubateur et retirer soigneusement le ruban en plastique.</li>
	<li>Couper la CAM autour de la région de filtre à l’aide de ciseaux courbes et transfert l’explant dérivé de CAM avec filtre papier pour un petit verre bol environ 3/4 de bac à froid.</li>
	<li>Avec l’aide de pinces fines transférer l’explant dérivé de CAM à une boîte de Pétri de 100 mm avec base noire contenant 10 mL de PBS. Retirez doucement le papier filtre et l’excédent de membrane à l’aide de Wecker oeil ciseaux et pinces fines.</li>
	<li>Transférer l’explant-CAM à la solution de fixation (3,7 % PFA dans du PBS) avec une écumoire. Euthanasier les embryons de poulet sans les retirer de l’oeuf en faisant une coupe précise dans la région du cou de l’embryon à l’aide de grands ciseaux.</li>
	<li>Évaluer la formation des organes dans les sections de paraffine des explants dérivé de CAM par immunohistochimie et histologie conventionnelle.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un aspect crucial pour le succès de cette méthode est la qualité de la caille et de poulet oeufs. Étant donné que les périodes d’incubation longue, particulièrement au cours de l’essai in ovo , une bonne qualité des œufs de poule améliore la viabilité tarifs (jusqu'à 90 %) à la fin de la procédure. Pour ce faire, tester les oeufs provenant de fournisseurs différents. Incuber les œufs non manipulés pendant de longues périodes (jusqu'à 16-17 jours) et contrôler leur développement. Pour être considéré comme un lot ...

Embryons aviaires ont été largement utilisées dans les études de biologie du développement séminal. Les principaux avantages du modèle aviaire incluent la possibilité d’ouvrir le œuf, l’accès relativement facile à l’embryon et la capacité d’exécuter micromanipulation. Quelques exemples comprennent le système classique caille-poulet chimère pour l’étude des cellules sort1, application des facteurs de croissance spécifiques à l' embryon2et la croissance des structures cellulaires ectopiques dans le CAM1,3, 4.
Pour obtenir de nouvelles connaissances en étapes distinctes de la formation des organes, nous avons récemment mis au point une méthode qui combine les techniques de greffage avec in vitro la manipulation des tissus embryonnaires5. L’approche en deux étapes permet à la discrimination et l’exploration de deux et fin-début de l’organogenèse, qui sont souvent limités en raison des tissus hautement dynamique et complexe des interactions2. En outre, l’absence de marqueurs de tissu-spécifique adaptés limite souvent l’utilisation de génétiquement modifiés6de modèles animaux. Cette nouvelle méthode de l’approche en deux étapes surmonte largement ces limites.
Pour étudier le début de la formation des organes, dans la première étape, territoire embryonnaire caille comprenant le rudiment de l’éventuel organe est isolé et cultivé dans un système in vitro organotypique pendant 48 h. Durant cette période, la modulation pharmacologique des voies de signalisation spécifiques peut être effectuée en ajoutant des drogues dans le milieu de culture5,7. En outre, des tissus cultivés soient collectées à tous les stades de la croissance in vitro et sondés pour expression génétique (à l’aide de méthodes telles que qPCR, puces, etc.).
Dans la deuxième étape, les 48 h-cultivées tissus sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet (c) à jour embryonnaire (E) 8 (cE8) (Hamburger et Hamilton (HH)-met en scène 33-35)8. La came se comporte comme un fournisseur vasculaire de nutriments et permet aux gaz échanges1,3,4 tissus greffés permettant son développement en ovo pour des périodes plus longues. Cette étape expérimentale est particulièrement bien adaptée pour étudier les derniers stades de l’organogenèse, comme organes entièrement formées peuvent être obtenus après 10 jours de ovo développement5,9,10,11 . Analyse morphologique est facilement réalisée par histologie conventionnelle pour confirmer la formation des organes appropriés et origine donneur de cellules peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques d’espèce (c.-à-d., MAb caille périnucléaire (QCPN)). Au cours de la période d’incubation de CAM, greffes peuvent être également cultivés en présence d’agents pharmacologiques et recueillies à n’importe quel stade de développement pour évaluer la progression de l’organogenèse.
L’approche en deux étapes, décrit ici en profondeur, a déjà travaillé en Figueiredo et al. 5 d’envisager l’élaboration de primordium commun aviaire parathyroïde/thymus. En conséquence, les particularités inhérentes des territoires embryonnaires et stades de développement impliqué dans l’organogénèse du thymus et des glandes parathyroïdes seront présentés ci-dessous.
Le thymus et l’épithélium des glandes parathyroïdes, bien que fonctionnellement distinctes, dérive de l’endoderme des sachets pharyngées (PP)12. Aviaire, l’épithélium des ces organes sont originaires de la troisième et quatrième PP endoderme (3/4PP)12, tandis que chez les mammifères l’épithélium thymique dérive de la 3PP et l’épithélium des glandes parathyroïdes dérive de la 3PP et 3/4PP en souris et humains, respectivement13,14.
Une des premières étapes dans la formation de ces organes est l’émergence du thymus discrète et domaines parathyroïdiennes dans le primordium commun. Dans le poulet, ces domaines peuvent être identifiés par hybridation in situ , avec des marqueurs moléculaires spécifiques, à E4.515. Comme développement produit, ces rudiments d’orgue individualiser et séparent du pharynx, alors qu’une mince capsule mésenchymateuse, formée par des cellules neurales de crête, qui les entoure (à E5 ; 27 HH-stage). Plus tard, on l’épithélium thymique est colonisé par des cellules progénitrices hématopoïétiques (à E6.5 ; HH-stage 30)12.
Comme dans les études de caille-poulet classiques1,12, l’approche en deux étapes est particulièrement utile pour étudier la formation des organes hématopoïétiques/lymphoïdes, à savoir le thymus5. Comme la caille explantation, avec le rudiment de l’orgue, est greffée dans l’embryon de poulet avant la colonisation des cellules progénitrices hématopoïétiques, un thymus chimérique est formé avec poulet hématogène progéniteurs infiltrer un homologue épithéliales thymiques caille. Cette méthode est, par conséquent, un outil utile pour étudier la contribution des cellules hématopoïétiques dans le développement du système lymphoïde/hémato aviaire.

<table><tbody><tr><td>Œufs de poule fécondés (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Ferme avicole&nbsp ;</td></tr><tr><td>Oeufs de caille fécondés (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Ferme avicole&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PP de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PP de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Plats en pyrex de 60 x 20 mm</td><td>Groupe Duran</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Plats en pyrex</td><td>Groupe Duran</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Insert de membrane en polycarbonate.</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Puits de 24 mm avec insert de membrane en polycarbonate à pores de 0,4 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtre à membrane</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Filtre à membrane Isopore</td></tr><tr><td>Plaques de culture à 6 puits</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675 boîte de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bols</td><td></td><td></td> en pyrex <td>du supermarché&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>Pipette en plastique 2 mL</td></tr><tr><td>Pipette pasteur en verre</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp ; Papier filtre qualitatif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Papier filtre</td></tr><tr><td>Ruban</td><td></td><td></td> plastique transparent <td>de supermarché&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cytokératine (pan ; acide et basique, cytokératines de type I et II), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de cyclopamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Inhibiteur pharmacologique de la signalisation Hh</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN Anticorps Études</td><td>développementales Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp ;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomère 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Pour préparer la base dorsale de la boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Inhibiteur pharmacologique de la signalisation Notch</td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>réactif pour l’isolement total de l’ARN</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td> à <td>outils pour les sciences fines</td><td>11251-30&nbsp ;</td><td>Pinces fines</td></tr><tr><td>Ciseaux Bonn extra-fins, incurvés</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Ciseaux courbes</td></tr><tr><td>Épingles à insectes&nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatule&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Cuillère de transplantation</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria Nickeled Pin Pin</td><td>Holder Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Holder</td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td>Microscope <td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>Réf. DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la formation des organes dans le modèle aviaire : le thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

L’embryon aviaire, comme modèle expérimental, a été primordial pour séminales découvertes en biologie du développement. Parmi plusieurs approches, la formation des chimères de caille-poulet et l’utilisation de la membrane chorio-(CAM) pour soutenir le développement de tissus ectopiques remontent au siècle dernier. De nos jours, la combinaison de ces techniques classiques avec des méthodologies récentes in vitro offre des perspectives nouvelles pour explorer davantage la formation des organes.
Nous décrivons ici une approche en deux étapes afin d’étudier et de tard-début de l’organogenèse. Brièvement, la région embryonnaire contenant le territoire présomptif de l’orgue est isolée à partir d’embryons de caille et cultivés in vitro dans un système organotypique (jusqu'à 48 h). Des tissus cultivés sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet. Après 10 jours en ovo développement, organes entièrement formées sont obtenus à partir des tissus greffés. Cette méthode permet également la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques et manipulation génétique des tissus tout au long des étapes du développement in vitro et in ovo . En outre, des tissus peuvent être collectées à toute fenêtre de temps pour analyser leur profil d’expression génétique (à l’aide de la PCR quantitative (qPCR), puces, etc.) et leur morphologie (évalué avec immunochimie et histologie conventionnelle).
La procédure expérimentale décrite peut servir comme un outil pour suivre la formation des organes à l’extérieur de l’embryon aviaire, depuis le début de l’organogenèse entièrement formé et les organes fonctionnels.

Ce qui précède décrit Détails du protocole une méthode qui permet à l’enquête des deux et fin-début de l’organogenèse, souvent limitée par des interactions cellulaires et moléculaires complexes.
Cette méthode a été précédemment employée dans Figueiredo et al. 5 à élucider le rôle de Notch et Hh signalisation dans le développement de primordium commun aviaire parathyroïde/thymus.
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Cet article fournit une approche de mise à jour du système classique caille-poulet chimère pour étudier la formation des organes, en combinant les nouvelles procédures expérimentales in vitro et in ovo .

Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir une approche en deux étapes pour étudier les stades précoces et tardifs de l’organogenèse en combinant la manipulation in vitro de tissus embryonnaires avec des techniques de greffe in ovo à l’aide du modèle aviaire. Dans cette méthode, le territoire embryonnaire comprenant le rudiment de l’organe prospectif est isolé et cultivé dans un système organotypique pendant 48 heures. En imitant le développement normal, cette approche in vitro permet d’accéder facilement aux territoires embryonnaires sans avoir besoin de marqueurs moléculaires spécifiques, et permet la manipulation expérimentale des premiers stades de développement de la formation des organes qui reposent sur des modifications spatiales hautement dynamiques et des interactions tissulaires complexes.Ensuite, des tissus cultivés sont greffés sur la membrane chorioallantoïdienne d’un embryon de poulet. La membrane chorioallantoïde se comporte comme un fournisseur vasculaire de nutriments et permet des échanges gazeux vers les tissus greffés, permettant son développement in ovo. Cette étape est particulièrement bien adaptée à l’étude des stades tardifs de l’organogenèse, car les organes entièrement formés peuvent être obtenus après 10 jours de développement in ovo.De plus, des agents pharmacologiques peuvent être administrés tout au long du développement in vitro et in ovo, permettant la modulation des voies de signalisation d’une manière spécifique au stade de développement. En fin de compte, les tissus en développement peuvent être collectés à n’importe quelle fenêtre temporelle pour évaluer la progression de l’organogenèse et être analysés pour l’expression des gènes et les caractéristiques morphologiques. En suivant la formation des organes en dehors de l’embryon aviaire, cette méthode peut aider à élucider des questions clés en biologie du développement, telles que l’identification des signaux impliqués dans les différentes étapes de la formation des organes.Cette procédure expérimentale sera illustrée par l’étude de l’organogenèse du thymus et des glandes parathyroïdes. Chez les oiseaux, les épithéliums de ces organes dérivent d’un primordium endodermique commun des troisième et quatrième poches pharyngées et émergent comme des domaines discrets vers le quatrième jour embryonnaire chez la caille et le quatre/cinq chez le poulet. Au fur et à mesure du développement, les rudiments de l’organe s’individualisent et se séparent du pharynx.Plus tard dans le développement, l’épithélium thymique est colonisé par des cellules progénitrices hématopoïétiques. La méthode présentée ici commence par l’isolement du territoire embryonnaire de la caille contenant le territoire présumé de ces organes, c’est-à-dire la région pharyngée contenant les troisième et quatrième arcs au troisième jour embryonnaire. Les œufs de caille fécondés ont été incubés avec la chambre à air vers le haut pendant trois jours à 38 degrés centigrades dans un incubateur humidifié.Pour commencer, retirez les œufs de caille de l’incubateur. Effectuer des procédures de manipulation des œufs dans des conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et d’instruments et de matériaux stérilisés. Préparez un grand bol en Pyrex rempli de PBS froid.Avec des ciseaux incurvés, ouvrez l’œuf de caille en tapotant la coquille et en découpant une ouverture circulaire sur le côté opposé de la chambre à air. Versez soigneusement l’embryon dans le plat. Tenez l’embryon à l’aide d’une pince fine et, à l’aide des ciseaux incurvés, faites une incision dans la membrane vitelline entourant l’empiècement.Coupez autour et extérieurement à la circonférence des vaisseaux embryonnaires supplémentaires dans un mouvement continu. Transférez l’embryon dans un petit bol avec du PBS froid. Ensuite, à l’aide d’une écumoire, transférez l’embryon dans une boîte de Pétri en Pyrex à base noire contenant du PBS froid.Sous un microscope stéréoscopique, tenez l’embryon au bas de la plaque à l’aide de fines épingles à insectes. Placez quatre broches formant une forme carrée dans la région embryonnaire supplémentaire. Avec des pinces, retirez les membranes embryonnaires supplémentaires de la région céphalique et placez-y une cinquième épingle.Maintenant, l’embryon est correctement positionné et la vésicule otique, le tube cardiaque et les premier, deuxième et troisième arcs pharyngés sont visibles. Commencez à disséquer la région d’intérêt qui est la troisième et la quatrième région de l’arc pharyngé à l’aide de ciseaux à œil de Wecker. Faites une coupe longitudinale et parallèle à l’axe de l’embryon entre la zone des somites et du tube neural et les arcs pharyngés.Retirez ensuite le tube cardiaque positionné ventralement en le coupant. Gardez les ciseaux dans la même position, faites pivoter la boîte de Pétri pour repositionner l’embryon selon la direction de la coupe. Pour finir, coupez entre le deuxième et le troisième arc pharyngé et au-dessous du quatrième arc pharyngé.Aspirez les tissus isolés et transférez-les dans une boîte en verre remplie de PBS froid à l’aide d’une pipette en plastique stérile. Conservez-le sur de la glace pendant la préparation du test in vitro. Remplissez un puits d’une plaque à six puits avec 5 ml de milieu de culture et placez une membrane en polycarbonate sur le puits.Sous le stéréomicroscope, transférez l’explant en le faisant glisser doucement à l’aide d’une spatule et d’une pince de la boîte en verre à la surface de la membrane. Alternativement, les explants peuvent être cultivés dans des filtres à membrane flottants. Pour cette procédure, préparez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec 5 ml de milieu de culture.Utilisez une pince pour faire flotter le filtre à membrane en gardant une surface sèche en contact avec l’air. Comme précédemment, transférez l’explant du plat en verre à la surface de la membrane par glissement doux. Les explants doivent être placés avec la face ventrale vers le haut et la face dorsale en contact avec la membrane.Ajouter jusqu’à huit explants par filtre à membrane. Placez soigneusement la plaque à six puits et la boîte de Pétri contenant les explants dans un incubateur humidifié à 37 degrés centigrades avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après une période d’incubation de 48 heures, retirez la plaque et la boîte de Pétri de l’incubateur.Pour recueillir les explants cultivés de la plaque à six puits, ajoutez du PBS à température ambiante dans l’insert de la membrane. Détachez les explants cultivés de la membrane par un rinçage vigoureux à l’aide d’une pipette en plastique stérile. À l’aide d’une spatule et d’une pince, transférez les explants cultivés dans un plat en verre rempli de PBS à température ambiante.De même, récupérez les explants cultivés du filtre à membrane flottante. Dans ce cas, transférez le filtre à membrane avec une pince dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS à température ambiante. Détachez les explants du filtre à membrane par un pipetage vigoureux.Déchargez le filtre à membrane sans explants après avoir vérifié qu’aucun explant n’y reste attaché. À l’aide d’une spatule et d’une pince, transférez soigneusement les explants dans 1 mL de réactif d’isolement de l’ARN total pour effectuer des études d’expression génique. Les explants cultivés peuvent également être cultivés in ovo pour concurrencer la formation des organes.Préparez d’abord la membrane chorioallantoïdienne. Pour cela, retirez de l’incubateur les œufs de poule avec huit jours de développement. Les œufs ont été incubés avec la chambre à air vers le haut dans un incubateur humidifié à 38 degrés centigrades.Couvrez l’extrémité émoussée de l’œuf avec du ruban adhésif en plastique transparent pour éviter que des morceaux de coquille ne tombent dans la chambre à air. Tapotez la coquille et découpez une ouverture circulaire dans l’œuf avec des ciseaux incurvés. La chambre à air doit devenir visible.Retirez lentement la membrane blanche de la chambre à air à l’aide d’une pince. La membrane chorioallantoïde est alors visible et accessible pour la greffe de tissu ectopique. Ne pas utiliser le PBS pour hydrater la membrane chorioallantoïde avant ou après la transplantation car le PBS favorise le glissement et le mauvais positionnement des explants.Commencez par effectuer de petites lésions vasculaires dans les plus petits vaisseaux de la membrane. Pour cette procédure, utilisez un microscalpel dans un support. En cas de saignement excessif de la plaie, prélever le sang par capillarité à l’aide de la pointe d’une pipette Pasteur.Transférez l’explant sur la zone blessée de la membrane à l’aide d’une spatule et d’une pince. Coupez un morceau de papier filtre d’une taille légèrement supérieure à celle de l’explant et placez-le sur l’explant. Le papier filtre aide à suivre l’emplacement de l’explant après son développement dans la membrane chorioallantoïdienne.Si nécessaire, le papier filtre permet également l’administration quotidienne du médicament à l’explant pendant le développement in ovo. Scellez la fenêtre à œufs avec du ruban adhésif transparent et identifiez-la à l’aide d’un crayon à fusain. Le ruban en plastique protège l’embryon de la déshydratation pendant la période d’incubation.Incuber l’œuf manipulé dans un incubateur humidifié à 38 degrés centigrades. Après 10 jours d’incubation, récupérez l’œuf et retirez délicatement le ruban en plastique. Coupez la membrane chorioallantoïdienne autour de la région du filtre à l’aide de ciseaux incurvés et transférez l’explant avec du papier filtre dans un petit bol en Pyrex rempli de PBS froid.À l’aide d’une pince, transférez l’explant dans une parabole de 100 millimètres à base noire remplie de PBS. Retirez délicatement le papier filtre et l’excédent de membrane à l’aide de ciseaux à œil et de pinces Wecker. Avec l’écumoire, transférez les greffons dans une solution fixatrice et évaluez la formation des organes dans les coupes de paraffine par histologie conventionnelle, immunohistochimie.Voici la conception expérimentale utilisée pour explorer les premiers stades de la formation du thymus et de la parathyroïde. À titre d’exemple, l’expression de gènes connus pour être impliqués dans le développement de la région de l’arc pharyngé a été évaluée au cours du développement normal par PCR quantitative en temps réel. Les transcrits des trois gènes Tbx1, Six1 et Bmp4 ont été détectés dans des tissus fraîchement isolés et après 48 heures de culture.Pour étudier les rôles des voies de signalisation Notch et Hedgehog, des inhibiteurs pharmacologiques ont été ajoutés au milieu de culture au cours du développement in vitro. Les niveaux d’expression des trois gènes ont été significativement réduits dans la troisième et la quatrième région de l’arc pharyngé cultivées pendant 48 heures en présence d’inhibiteur de Notch par rapport aux conditions contrôlées. À l’inverse, seuls les transcrits de Bmp4 ont été significativement réduits dans les tissus cultivés lorsque la signalisation Hedgehog a été bloquée.Pour étudier les derniers stades de l’organogenèse du thymus et de la glande parathyroïde, les tissus cultivés ont été greffés sur la membrane chorioallantoïde et laissés doubler pendant dix jours supplémentaires. L’analyse morphologique des organes a été réalisée par histologie conventionnelle et immunohistochimie. Les greffons ont montré un thymus chimérique entièrement formé avec des cellules d’épithélium thymique dérivées de cailles et des cellules lymphoïdes d’origine donneuse de poulet.De plus, les épithéliums thymiques et paratyphoïdes ont montré des caractéristiques morphologiques normales après la détection de la cytokératine. L’épithélium thymique présentait une architecture réticulaire tandis que les cellules parenchymateuses parathyroïdiennes étaient de forme globulaire, disposées en grappes et entourées de nombreux capillaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’approche en deux étapes du développement in vitro et in ovo à l’aide du modèle aviaire pour étudier le rôle des voies de signalisation impliquées dans les différentes étapes de la formation des organes.

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