Name: Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Découvrez la génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels par immunisation, fusion cellulaire et criblage ELISA. Cette méthode améliore la sensibilité des immunoessais pour les applications cliniques.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de sciences naturelles de Chine (subvention numéros 81573573, 81473338 et 81503344) et le classique Prescription base équipe de recherche à l’Université de Pékin de médecine chinoise.

Toutes les procédures d’animaux dans cette étude ont été approuvés par le Comité d’examen éthique à l’Université de Pékin de médecine chinoise (agrément numéro 2016BZYYL00109).
Remarque : La souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été immunisés avec conjugués de protéines Haptène-carrier. Lorsqu’il est utilisé seul, une petite molécule (< 1 000 Da) ne peut pas déclencher une réponse immunitaire. Cependant, conjuguant la petite molécule à un résultats de macromolécule porteuse dans la synthèse de l’antigène. Dans ce contexte, la petite molécule est étiquetée un Haptène. Conjugaison de l’Haptène est une stratégie nécessaire et efficace pour la production de mAb. Pour éviter une réaction croisée, deux transporteurs protéiques, telles que l’albumine sérique bovine (BSA) et l’ovalbumine (OVA) ou l’Hémocyanine de patelle (KLH) et BSA, devrait être utilisé comme l’immunogènes (pour la vaccination animale) et les antigènes de revêtement (pour enduire la plaque pour anti-sérum détection). BSA et ovules sont utilisés à titre d’exemple dans le présent protocole.
1. préparation de l’immunogène et revêtement antigène
NOTE : Pour la synthèse de l’antigène artificiel, utilisez le groupe fonctionnel approprié (par exemple, hydroxyle, sulfhydryle carboxyle acide ou amino) comme le bras de côté pour la liaison covalente à la protéine de transporteur. La conjugaison de méthodes incluent le periodate oxydation, la méthode carbodiimide, une réaction d’anhydrides mixtes, une réaction de glutaraldéhyde et la méthode de succinate. Ce protocole utilise naringine (NAR), un glycoside flavanone bien connus, comme un exemple de composé. NAR est un composé de petit (581 Da) présent dans les agrumes ainsi que divers médicaments traditionnels chinois.
<ol><li>Une méthode d’oxydation périodate permet de synthétiser NAR-BSA et NAR-OVA conjugués.<ol>
<li>Dissoudre 50 mg de NAR dans l’eau à une concentration finale de 1 mg/mL,22.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de sodium fraîchement préparé au périodate solution (0,1 M) à 5 mL de la solution de la NAR. Incorporer le mélange à température ambiante pendant 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissoudre 4 mg de BSA et ovules dans 2,0 mL de tampon de carbonate de 50 mM (pH 9,6). Ajouter cette protéine solution le NAR/sodium periodate mélange réactionnel.</li>
	<li>Ajuster le mélange à pH 9 avec la solution 1 M Na2CO3 et mélanger à la température ambiante pendant 6 à 8 heures.</li>
	<li>Dialyser le mélange réactionnel dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une membrane de dialyse (MWCO 10 kDa) pendant 3 jours afin d’échanger les obligations Convertibles.</li>
	<li>Analyser le conjugué de l’Haptène-carrier à l’aide de matrix assisté laser desorption/ionisation temps de vol (MALDI-TOF)-MS.<ol>
<li>Mélanger 1-10 pmol du conjugué avec un 103-replier un excès molaire de l’acide sinapique dans une solution aqueuse contenant de l’acide trifluoroacétique (TFA) de 0,15 %. Sécher le mélange sur une plaque d’échantillon dans l’air.</li>
		<li>Effectuer l’analyse à l’aide d’un MALDI-TOF, spectromètre de masse équipé d’un laser pulsé azote fonctionnant à 337 nm. Acquisition de spectres de masse MALDI ions positifs en mode linéaire dans la gamme de masse (m/z) de 15 000-100 000 comme précédemment décrit22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vaccination
Remarque : Un total de 5 souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été utilisées : 4 pour NAR-conjugue vaccination et 1 pour la vaccination de contrôle (PBS).
<ol><li>Pour la première vaccination, mélanger 50 µg de conjugué (dilué dans 100 µL de PBS) avec un volume égal d’adjuvant complet de Freund (ACF) et émulsionner complètement. Administrer 100 µL de ce mélange pour chaque souris via dorsale injection sous-cutanée.</li>
	<li>Deux semaines plus tard, livrer une dose de rappel de vaccination (100 µL) par injection sous-cutanée avec la même quantité de conjugué mélangé avec adjuvant incomplet (IFA).</li>
	<li>Extrait 200 µL de sang de la veine caudale de chaque souris 7 jours plus tard pour obtenir le sérum.<ol>
<li>Centrifuger le sang à 3 000 x g pendant 10 min. transférer le sérum surnageant dans un nouveau tube.</li>
		<li>Analyser le sérum en utilisant une technique ELISA comme décrit précédemment21. Choisissez la souris avec le plus haut titre de sérum à utiliser pour la fusion cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En préparation de la fusion cellulaire, administrer une immunisation pulsée à la souris choisie par injection intrapéritonéale de 50 µg du conjugué dans 300 µL de PBS sans adjuvant 3 jours avant la fusion. Remarque : Cette étape peut être omise si le titre est assez élevé.</li>
</ol>3. préparation de la Fusion cellulaire
<ol><li>Préparation moyenne de fusion de cellules<ol>
<li>Pour le milieu sélectif de l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (chapeau) : dissoudre le 50 x supplément de médias HAT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS. Remarque : Lorsque les 10 mL de la solution concentrée 50 x sont dilués dans 500 mL de milieu de culture, les concentrations finales de l’hypoxanthine, aminoptérine et thymidine sont 100 µM, 0,4 µM et 16 µM, respectivement.</li>
		<li>Pour les médias de l’hypoxanthine-thymidine (HT) : dissoudre le 50 x supplément de médias HT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS. Les concentrations finales de l’hypoxanthine et la thymidine sont de 100 µM et 16 µM, respectivement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La culture des cellules Sp2/0-Ag14.<ol>
<li>Au moins 7 jours avant la fusion, décongeler rapidement un flacon de liquide azote gelé SP2/0-Ag14 cellules myélomateuses dans l’eau chaude.</li>
		<li>Transvaser la solution de cellule dans 5 mL de milieu de culture fraîche (RPMI-1640) et centrifuger pendant 10 min à 1000 x g.</li>
		<li>Après centrifugation, enlevez le milieu de culture et remettre en suspension les cellules fraîches RPMI-1640 additionné de 10 % sérum fœtal (SVF).</li>
		<li>Transférer les cellules et le milieu dans un ballon jaugé de 25 cm2 et incuber à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2.</li>
		<li>Développez les cellules 3 ou flacons2 4 75 cm avant la fusion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de cellules de couche de conducteur abdominale<ol>
<li>Sacrifier une souris ICR de 12 semaines albinos par dislocation cervicale 1 jour avant la fusion cellulaire et il immergez-la dans 75 % d’éthanol.</li>
		<li>Après avoir enlevé la fourrure de l’abdomen avec une pince hémostatique, désinfecter la zone avec 75 % d’éthanol. Couper la peau extérieure pour exposer la cavité abdominale. Injecter des 3 mL du milieu RPMI 1640 stérile dans l’abdomen et massage de l’abdomen pour détacher des cellules supplémentaires dans la solution. Aspirer la suspension cellulaire de mangeoire dans un tube à centrifuger 15 mL.</li>
		<li>Après centrifugation de la suspension cellulaire pendant 10 min à 1000 x g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules nourricières dans 20 mL de milieu sélectif de chapeau.</li>
		<li>Transférer les cellules dans les plaques de culture de cellules de 96 puits (100 µL/puits). Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la Fusion cellulaire
<ol><li>Après l’élu immunisés souris a été établie pour la fusion cellulaire (voir étape 2,4), administrer une injection intrapéritonéale de l’hydrate de chloral 10 % (anesthésique) et sacrifier la souris immunisées par dislocation cervicale.</li>
	<li>Recueillir le sang supplémentaire du cœur (1 mL) et préparer le sérum comme indiqué au point 2.3.1 à utiliser comme un contrôle positif lors de la sélection des hybridomes.</li>
	<li>Enlever la peau et le tissu musculaire à l’aide de ciseaux pour exposer la rate.</li>
	<li>Isoler la rate avec des pincettes avec soin et laver la rate avec RPMI-1640. Couper la rate en morceaux, puis enfoncez lentement la rate à triturer. Préparer une suspension de cellules de rate en appuyant sur le tissu de la rate à travers une passoire à 800 maille cellules dans un tube à centrifuger 50 mL.</li>
	<li>Laver la suspension de cellules de rate avec milieu RPMI-1640. Récolter les cellules de la rate par centrifugation (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et puis jeter le surnageant. Répétez cette étape de laver trois fois.</li>
	<li>Sortir les cellules myélomateuses cultivées et amplifiés de l’incubateur et doucement robinet/secouer les fioles pour obtenir une suspension de cellules. Lavez cette suspension avec milieu RPMI 1640 deux fois pour enlever la FBS. NOTE : Ceci est une étape essentielle car FBS peut influencer la fusion cellulaire.</li>
	<li>Compter les cellules et ajuster la concentration avant de les mélanger avec les cellules de la rate. Le rapport final des cellules de la rate pour les cellules de myélome doit être de 1:5 à 01:10.</li>
	<li>Mélanger la cellule rate suspension et myélome des cellules. Centrifuger le mélange de cellules (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de 50 % de polyéthylène glycol (PEG) dans les cellules et remuer doucement à 37 ° C pendant 1 min. Laisser reposer pendant 30 s. Remarque : La solution de PEG utilisée dans cette étape doit contenir 50 % (p/v) de polyéthylène glycol 1500 et 10 % (v/v) diméthyl sulfoxyde (DMSO) dans du PBS sans calcium (Ca2 +).</li>
	<li>Ajouter 2 mL de milieu RPMI-1640 pendant 2 min terminer la réaction. Ajouter 2 mL supplémentaire du milieu RPMI 1640 pendant 1 min et puis ajouter 10 mL de milieu RPMI-1640 supplémentaire.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 800 g pendant 10 min. Après avoir jeté le surnageant, ajouter la solution de chapeau et continuent à cultiver des cellules. Puis ajouter 100 µL de la suspension cellulaire dans chaque loge des plaques de couche de mangeoire et incuber les boîtes pendant 7 jours à 37 ° C, 5 % de CO2. Remarque : Dans ces conditions, les cellules de myélome dont mourront tandis que les cellules hybridomes continuera de croître dans le milieu HAT. Après 7 jours, anticorps monoclonal hybridome formera comme un seul groupe de cellules dans le puits, tandis que puits contenant des hybridomes polyclonaux aura plusieurs amas de cellules.</li>
	<li>Aspirer le surnageant pour analyse et remplacer le support par support HT. Remarque : N’oubliez pas de remplacer le milieu HAT avec HT moyen première comme passer directement au milieu sans additifs est préjudiciable à l’hybridome.</li>
</ol>5. indirecte ELISA concurrent (icELISA)
<ol><li>Recouvrir une plaque à 96 puits avec NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/puits) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Bloquer la plaque avec 300 µL de GPBS (PBS contenant la gélatine de 1 % m/v) pendant 1 h à 37 ° C pour empêcher l’adsorption non spécifique.</li>
	<li>Laver la plaque trois fois avec TPB (PBS contenant 0,05 % v/v Tween-20).</li>
	<li>Diluer la NAR en une série de concentrations de méthanol à 10 %. Ajouter 50 µL de ces dilutions à différents puits. Dans les autres puits, ajouter 50 µL de sérum ou d’hybridome surnageante (contenant du mAbs). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 100 μL d’antisouris marqué à la peroxydase IgG dans chaque puits et incuber pendant une 1 heure supplémentaire.</li>
	<li>Après avoir lavé la plaque trois fois avec TPB, ajouter 100 µL de solution de substrat (0,1 M citrate tamponné (pH 4) contenant 0,015 % v/v H2O2 et 2 mg/mL de 3, 3', 5, 5'-tétraméthyl benzidine (TMB)) à chaque puits et incuber pendant 15 min.</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 1 M H2SO4 dans chaque puits.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 450 nm. Choisissez les hybridomes qui sécrétaient les plus fortes concentrations d’anticorps NAR dans leur surnageant pour davantage de préparation.</li>
</ol>6. préparation des hybridomes Monoclonales
<ol><li>Utilisez la méthode de dilution limite pour préparer les hybridomes monoclonales.<ol>
<li>Après avoir retiré le support HT des hybridomes choisis (c.-à-d. ceux positifs pour la sécrétion d’anticorps NAR), remettre en suspension les cellules en milieu RPMI 1640 et les compter.</li>
		<li>Diluer les cellules à une concentration de 1 cellule 2 cellules et 4 cellules / puits dans 100 µL de milieu RPMI 1640 dans une plaque à 96 puits. Incuber les plaques à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 7-10 jours, détecter les anticorps NAR dans la culture surnageante à l’aide du protocole d’icELISA (étape 5). Cellules de transfert depuis les hybridomes qui sont positifs aux anticorps anti-NAR plaques 24 puits, 25 cm2 flacons et fioles2 75 cm pour la culture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cryoconservé les hybridomes monoclonales.<ol>
<li>Récolter les cellules et de les transférer pour tubes de centrifugeuse.</li>
		<li>Après centrifugation des cellules (800 x g, 10 min), retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de congélation moyen (RPMI-1640, sérum de veau foetal de 20 % (FCS) et 10 % DMSO). Transférer les suspensions cellulaires pour cryotubes.</li>
		<li>Stocker les cryotubes dans une glacière thermo-électrique dégradé à-80 ° C pendant 24 h. Puis transférez les cryotubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole pour le succès de la production du mAbs contre naturels produit dérivé de petites molécules. Les étapes essentielles de la procédure ont été exposées, et nous avons démontré l’utilité du présent protocole à l’aide de NAR comme une petite molécule d’exemple. Les spectres de l’exemple, les analyses de réactivité et icELISA résultats tous montrent représentant expérimental et les données de contrôle qui sont obtenues à l’aide de ce protocole. Images d’exemple des hybridomes offrent une repré...

Anticorps monoclonaux (ACM), également connu sous le nom des anticorps mono spécifiques, sont produites à partir d’un seul clone de lymphocyte et sont composés d’anticorps monovalents que tous se lient au même épitope1. Ces dernières années, de nombreux produits naturels provenant de plantes médicinales ont été utilisés dans le traitement de diverses maladies2. En effet, les nombreux petits composés moléculaires initialement dérivés de produits naturels sont maintenant appliquées comme des médicaments de première ligne, tels que de l’artémisinine pour le paludisme et paciltaxel (taxol) pour cancer2,3. L’étude des produits naturels a rapidement progressé, en grande partie en raison de l’énorme développement et l’optimisation des techniques d’analyse classiques, y compris la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse (MS). Cependant, il y a encore quelques limitations associées à ces méthodes, telles que leurs protocoles complexes de prétraitement et les coûts connexes en ce qui concerne le temps, du travail et des compétences et instruments requis4.
Récemment, les analyses axées sur le mAb immuno-enzymatique (Elisa) ont été appliquées pour analyser qualitativement et quantitativement les aliments et produits naturels. En fait, cette méthode a été appliquée pour l’analyse des échantillons biologiques et des tests cliniques et a été montrée pour être précise, sensible et hautement efficace tout en évitant aussi les étapes de prétraitement fastidieux associés à d’autres analyses5, 6.
Lors de l’utilisation de tests Elisa axée sur le mAb pour étudier les produits naturels complexes, préparation des anticorps monoclonaux est une des étapes essentielles. Malheureusement, le mAbs spécifiques aux petits composants bioactifs présents dans ces types de substances6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sont souvent limitées par rapport aux antigènes protéiques. Pour contourner ce problème, nous avons développé un protocole pour générer précisément mAbs contre petits composés. Le protocole présenté ici comprend la synthèse de l’antigène artificiel, immunisation de souris, fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte et la préparation de l’hybridome monoclonale.
Notamment, notre groupe de recherche a été étudier la formation du mAbs contre petits composés bioactifs des médecines traditionnelles chinoises et développer leurs applications pour des années. Dans nos études en cours, nous avons développé des ACM contre baicaline16, puerarin17, acide glycyrrhizique18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121et beaucoup d’autres petites molécules. Nos protocoles d’ELISA basés sur ces mAbs ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour évaluer les propriétés pharmacocinétiques de ces petites molécules ainsi que leurs interactions avec d’autres composés bioactifs. En outre, à l’aide de ces ACM, nous avons également développé méthodes de chromatographie d’immunoaffinité pour la séparation des analogues structuraux, y compris les épimères. Récemment, nous avons préparé un immunoessai écoulement latéral à l’aide de notre mAb anti-puerarin qui a ensuite été utilisé pour la détection rapide, sur place de ce composé. Nos résultats indiquent que nos analyses mAb sont des outils indispensables et commodes pour l’étude de la biologie et la qualité de composés dérivés du naturel-produit, en particulier celles utilisées dans les médecines traditionnelles chinoises.

<table><tbody><tr><td>800 mailles (40 &mu ; M nylon) filtre&nbsp ;</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture 24 puits</td><td>NUNC</td><td>119567</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Fiole</td><td>Labserv</td><td>310109016</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine(TMB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>860336 1G</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Fiole</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture 96 puits</td><td>NUNC</td><td>117246</td><td></td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>passoire à cellules</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>tube à centrifuger 15 mL</td><td>Tube à</td> centrifuger <td>430645</td><td></td>Corning</tr><tr><td>50 mL</td><td>Cryotubes 430828</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>, 1 mL&nbsp ;</td><td>Cultivateur Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DRP-9082&nbsp ;</td><td>Membrane</td> de dialyse Samsung <td></td></tr><tr><td>(10kDa)</td><td>Heng Hui</td><td>45-10000D</td><td></td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>DH105-10</td><td></td></tr><tr><td>balance électronique&nbsp ;</td><td>BS124-S&nbsp ;</td>Plaques ELISA <td>Sartorius</td><td></td></tr><tr><td>, 96 puits</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>éthanol, 96 %</td> <td>Sinopharm Chemical Sérum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr> sérum de <tr><td>veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute ; s adjuvant,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBM2183V</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute ; s adjuvant, incomplet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBL0210V</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>AMRESCO</td><td>9764-500g</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur réfrigérant à gradient</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de média HAT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0262-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-souris conjugué HRP</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr> HT supplément de <tr><td>média</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0137-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>IX73</td><td>Olympus&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>patelle en trou de serrure hémocyanine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF-MS&nbsp ;</td><td>Axima-CFR&nbsp ; plus&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Axima&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTex</td><td>ELX-800&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>souris</td><td>Vital River&nbsp ;</td><td>BALB/c</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumine</td><td>Pékin BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline& Solution de streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10 mL</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 25 mL</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>lait écrémé</td><td>applygen</td><td>P1622</td><td></td></tr><tr><td>periodate de sodium</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Allemagne</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1 000 & micro ; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

L’analyse des composants bioactifs présents dans les aliments et produits naturels est devenu un quartier populaire d’étude dans de nombreux domaines, y compris traditionnelle sécurité/toxicologie chinoise médecine et de la nourriture. Plusieurs des techniques classiques d’analyse nécessitent des équipements coûteux ou des compétences. Notamment, les dosages immuno-enzymatiques (Elisa) sont devenus une méthode nouvelle pour l’analyse des aliments et des produits naturels. Cette méthode est basée sur médiée par les anticorps de détection des composants cible. Cependant, comme de nombreux éléments bioactifs dans les produits naturels sont de petite taille (< 1 000 Da) et ne pas provoquer une réponse immunitaire, la création d’anticorps monoclonaux (ACM) contre eux est souvent difficile. Dans ce protocole, nous fournir une explication détaillée des étapes requises pour générer des ACM contre les molécules cibles ainsi que celles nécessaires pour créer les associés indirects concurrentiel (ic) ELISA pour l’analyse rapide de ce composé dans des échantillons multiples. La procédure décrit la synthèse de l’antigène artificiel (c.-à-d., le conjugué de l’Haptène-carrier), fusion cellulaire, vaccination, préparation d’hybridome monoclonale, caractérisation du Lam et l’application par ELISA de la mAb. Le conjugué de l’Haptène-carrier a été synthétisé par le sodium periodate méthode et évaluées par MALDI-TOF-MS. Après l’immunisation, les splénocytes ont été isolés chez la souris immunisée avec le titre d’anticorps plus élevé et fusionné avec l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) - lignée de cellules d’un myélome de souris sensibles Sp2/0 - Ag14 utilisant un polyéthylène glycol (PEG)-méthode de base. Les hybridomes sécrétant mAbs réagissant à l’antigène cible ont été criblés par icELISA de spécificité et de la réactivité croisée. En outre, la méthode de dilution limite a été appliquée pour préparer les hybridomes monoclonales. Le mAbs final ont été davantage caractérisé par icELISA et ensuite utilisé dans une application par ELISA pour la détection rapide et commode de l’Haptène exemple (naringine (NAR)) en produits naturels.

Génération des hybridomes monoclonales
Le poids moléculaire du conjugué Haptène-carrier a été confirmé par analyse de MALDI-TOF-MS. Comme le poids moléculaire de BSA et de la NAR sont connus, le nombre de petites molécules conjuguées avec BSA pourrait être calculé. La figure 1 montre les résultats spectrales représentatifs de la NAR-BSA22, ...

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Les anticorps monoclonaux sont connus sous le nom d’anticorps mono-spécifiques qui sont produits à partir d’un seul clone de lymphocyte B et des anticorps monovalents qui se lient à la même épitope. Récemment, l’ELISA monocoque à base d’anticorps est devenue notre plate-forme émergente pour l’analyse qualitative ou quantitative des aliments ou des produits naturels. Cette méthode est une méthode précise, sensible et efficace sans étapes fastidieuses de prétraitement.C’est donc l’essentiel pour les échantillons biologiques et les futures applications cliniques. La préparation des MABs de TCM est une étape essentielle dans les études sur les caractéristiques complexes du système de la formule TCM. Nous avons développé un protocole pour générer des mWB contre les petits composés moléculaires, y compris la synthèse artificielle d’antigène, la vaccination de souris, et la fusion cellulaire.L’hapten est relié à la protéine porteuse pour synthétiser l’antigène artificiel. Les antigènes artificiels et les adjuvants complets sont mélangés et émulsifiés. La souris a été vaccinée par injection sous-cutanée.Sortez la rate de la souris immunisée et faites une suspension unicellule. Mélanger les

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une méthode de génération d’anticorps à partir de cellules de mammifères en introduisant des vecteurs plasmidiques avec des gènes à chaîne lourde et légère. Ces vecteurs interagissent avec la polyéthylénimine et pénètrent dans les cellules en formant des polyplexes ; Plus tard, ils sont traduits en protéines individuelles et assemblés en anticorps complets, qui sont sécrétés dans le milieu extracellulaire.

Génération d’anticorps monoclonaux recombinants à partir de cultures de cellules de mammifères

La vidéo montre une technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène. Des vecteurs d’expression eucaryotes codant pour les chaînes lourdes et légères d’anticorps, clonés à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène isolés, sont introduits dans des cellules de mammifères à l’aide de polyplexes. Une fois à l’intérieur des cellules, ces vecteurs subissent une traduction, et les peptides à chaîne lourde et légère qui en résultent...

Technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène

La synthèse d’anticorps monoclonaux humains est la première étape des études visant à démêler les mécanismes physiopathologiques des réponses immunitaires médiées par les auto-anticorps. Nous avons mis au point un protocole pour générer des anticorps monoclonaux d’immunoglobuline G (IgG) humaines recombinantes à partir de lymphocytes B triés dans le sang, y compris l’isolement de lymphocytes B, le clonage d’anticorps et la synthèse in vitro.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Un protocole optimisé est présenté pour la génération d’anticorps monoclonaux basé sur la technologie des hybridomes. Les souris ont été immunisées avec un immunoconjugué. Les cellules de la rate ont été fusionnées par PEG et une impulsion électrique avec des cellules myélomateuses immortelles. Les cellules d’hybridome productrices d’anticorps ont été sélectionnées par THA et par criblage ELISA spécifique de l’antigène.

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

La protéine d’anticorps recombinante exprimée dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les anticorps monoclonaux produits à l’aide de la technologie traditionnelle de l’hybridome peut reconnaître et se lier à la protéine porcine aminopeptidase N (APN).

Production d’anticorps monoclonaux ciblant l’aminopeptidase N dans l’épithélium de la muqueuse intestinale porcine

Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l'immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l'administration par voie intrapéritonéale.

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Un test parasite de sauvetage et de la transformation des cellules infectées...

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Les conditions de stockage des produits plaquettaires créent un environnement idéal pour que les contaminants bactériens se multiplient à des niveaux dangereux.  Le but de cette étude était d’utiliser un test de formation de colonies pour évaluer un processus de réduction des agents pathogènes à base de riboflavine contre une contamination bactérienne à titre élevé dans les produits plaquettaires humains.

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne

Découvrez la génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels par immunisation, fusion cellulaire et criblage ELISA. Cette méthode améliore la sensibilité des immunoessais pour les applications cliniques.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

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