Name: Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Apprenez à isoler et cultiver des microglies de rongeurs dans un milieu sans sérum pour préserver leur morphologie ramifiée. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellulaires dans le SNC.

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Ce travail a été soutenu par le Christopher et Dana Reeve Foundation International Consortium de recherche sur la moelle épinière, le Dr Miriam et Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondation de JPB, l’Institut Novartis de la recherche fondamentale, contributions généreuses de Vincent et Stella Coates et la Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l’Université de Stanford, conformes aux politiques et lois étatiques et nationales. Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur la protection des animaux de laboratoire.
NOTE : Toutes les compositions de solution et le tampon sont fournies dans la Table des matières.
1. Préparez une boîte de Pétri CD11b Immunopanning (jour 0)
NOTE : Préparer 1 plat d’immunopanning pour chaque cerveau de rat juvénile 1-2.
<ol><li>Ajouter 25 mL de 50 mM Tris solution à pH 9,5 à un plat de Pétri de 15 cm.</li>
	<li>Ajouter chèvre anti-souris IgG (chaînes de H + L) au plat pour une concentration finale de 6 µg/mL. Agiter la plaque pour répartir uniformément.</li>
	<li>Incuber le plat pendant 1-3 h à 37 ° C.</li>
	<li>Plats de rincer trois fois avec SPD++ (tampon phosphate salin (PBS) avec Ca2 + et Mg2 +), puis remplacez par une solution de tampon contenant 1 µg/mL d’anticorps OX42 de panoramique. Laisser les plats du jour au lendemain à la température ambiante sur une surface plane.</li>
</ol>2. tissu Collection (jour 1)
Remarque : Ce protocole devrait prendre environ 3-4 h.
<ol><li>Avant de commencer, s’assurer que toutes les solutions sont stériles et réfrigérés sur la glace. Réfrigérer tous les instruments sur la glace et stériliser avec de l’éthanol avant leur utilisation.</li>
	<li>À la suite des procédures réglementaires appropriées, sacrifier un rat de laboratoire juvéniles par asphyxie de dioxyde de carbone. Remarque : Par ailleurs, les jeunes animaux peuvent être sacrifiés avec une dose létale de kétamine/xylazine (100-200 µL de 24 mg/mL kétamine, xylazine 2,4 mg/mL). La kétamine/xylazine doit être utilisé si les animaux sont moins de 14 jours d’âge. Si vous utilisez plusieurs animaux, extraire le tissu d’un animal et placez-le dans préalablement réfrigérées SPD++ sur la glace avant de procéder à des animaux ultérieures.</li>
	<li>Pincer un hindpaw et veiller à ce problème de blocage complet de l’animal avant de continuer.</li>
	<li>Transcardially perfuse l’animal avec 10-30 mL de tampon de perfusion glacée à l’aide d’une aiguille 27½-G jusqu'à ce que le tampon soit limpide. Remarque : Le Volume de tampon de Perfusion variera selon la taille/âge de l’animal.</li>
	<li>Immédiatement après la perfusion, sortez la tête de l’animal. En provenance de la moelle épinière du condyle occipital, découpez chaque côté avec des ciseaux de dissection, être attention à ne pas endommager le cerveau. Après avoir coupé avec soin chaque côté, couper un côté le long du pariétal et les os frontal vers l’os nasal. Avec une pince soigneusement tirer vers l’arrière la partie supérieure du crâne, rapidement enlever le cerveau (ou structures de CNS d’intérêt) et placer dans préalablement réfrigérées SPD++ sur glace.</li>
	<li>Répétez pour tous les animaux restants. Remarque : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire dans de bonnes conditions stériles.</li>
</ol>3. mécanique Dissociation (jour 1)
<ol><li>Après que tous les cerveaux ont été recueillis, hacher un cerveau en morceaux3 1 mm dans une boîte de Pétri sur la glace avec une lame de bistouri froid et transférer dans un homogénéisateur dounce glacée avec 5-7 mL de tampon de douncing glacée. Dissocier un cerveau à la fois.</li>
	<li>Dissocier le tissu à l’aide de traits douces et incomplètes de 10-20 avec un ample dounce homogénéisateur. Prendre soin de ne pas écraser directement le tissu au bas de l’homogénéisateur, mais au contraire poussent le tissu à travers l’espace entre les côtés du piston et l’homogénéisateur.</li>
	<li>Retirez le piston afin d’éviter l’introduction de bulles d’air. Laisser des morceaux de tissu mal dissociées se déposer au fond de l’homogénéisateur et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique réfrigéré de 50 mL.</li>
	<li>Remplacer le volume enlevé avec un tampon douncing fraîches et répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour un total de 3-4 tours, ou jusqu'à ce que tous les tissus a été dissocié. Répétez l’opération pour chaque cerveau.</li>
</ol>4. la myéline enlèvement (jour 1)
Remarque : Suppression de la myéline est utilisée pour l’isolement des microglies provenant d’animaux plus vieux que P12.
<ol><li>Mesurer le volume de la suspension cellulaire dans le tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette 25 mL, puis ajouter le tampon douncing glacée pour ajuster le volume total à 33,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de tampon de séparation de la myéline (MSB) à la suspension cellulaire et mélanger soigneusement en renversant le tube plusieurs fois. Cela se traduira par une concentration finale de 23 % de la MSB dans un volume de 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules pendant 15 min à 500 x g à 4 ° C avec freinage lent. Remarque : La centrifugeuse devrait prendre environ 1,5 à 2 min à décélérer. Cela va générer une couche supérieure de la myéline et débris de cellules mortes, un surnageant quelque peu confu et un plus petit granulé qui est enrichie de cellules vivantes.</li>
	<li>Enlever la couche supérieure de la myéline/débris et le surnageant avec une pipette. Prendre soin lorsque vous retirez la couche supérieure pour s’assurer qu’une grande partie de celle-ci est enlevée que possible.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 12 mL de tampon de panoramique. Doucement, triturer la suspension cellulaire pour briser tout amas de cellules qui pourraient subsister.</li>
</ol>5. Immunopanning (jour 1)
<ol><li>Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les gros débris ou amas de cellules.</li>
	<li>Rincer le plat panoramique OX42-couché trois fois avec SPD++. Ne laissez pas la plaque complètement sec entre les lavages.</li>
	<li>Décanter le dernier lavage SPD++ et appliquer la suspension de cellules filtrées sur le plat panoramique. Doucement agiter la plaque pour distribuer les cellules, puis incuber la plaque sur une surface plane à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer. Incuber pas plus de 20 min ou cellules deviendra très difficiles de se remettre de la capsule.</li>
	<li>Rincer le plat panoramique avec SPD++ 10 fois pour enlever les cellules non adhérentes. La microglie sera solidement fixé à la plaque, donc agiter la plaque avec chaque rinçage à garantir l’élimination des autres cellules non adhérentes.</li>
	<li>Décanter le dernier lavage SPD++ et remplacez par 15 mL SPD++ et 200 μL trypsine (solution mère de 1,25 %).</li>
	<li>Incuber le plat pour ≤ 10 min à 37 ° C, avec 10 % de CO2 à trypsinize. Remarque : Ne pas continuer plus longtemps que 10 min ou microglie deviendra difficile à enlever.</li>
	<li>Après 10 min de la trypsinisation, microglie sera toujours collée à la plaque. Décanter la trypsine/SPD++ et laver délicatement 2 x avec SPD++ pour enlever la trypsine, remplacer avec 12 mL de milieu de culture des microglies glacee (MGM).</li>
	<li>Lieu panoramique plat sur la glace pendant 2 min afin d’affaiblir l’interaction cellulaire/substrat et assurez-vous que le plat est plat pour éviter les zones du plat panoramique ne se dessèchent pas.</li>
	<li>Pipetter vigoureusement avec un contrôleur 10 mL de pipette et pipette à haute vitesse pour récupérer des cellules du plat panoramique. Dessiner une grille 16 x 16 avec le flux de liquide de la pipette pour essayer de supprimer toutes les cellules.</li>
	<li>Vérifier les cellules au microscope au grossissement de X 20 pour s’assurer que les cellules ont détaché de la plaque. Taches de marque sur le dessus de la capsule où les cellules sont toujours coincés et répéter pipetage dans ces domaines.</li>
	<li>Recueillir les suspension cellulaire et l’aliquote 3 à 4 mL du surnageant par tube conique de 15 mL. Tournez pendant 15 min à 500 x g à 4 ° C avec freinage lent. Remarque : La microglie dans un petit volume de filature permet la récupération maximale des cellules.</li>
	<li>Aspirer le surnageant, en laissant 0,5 mL de la MGM avec le culot cellulaire.</li>
	<li>Resuspendre chaque culot dans MGM restant et les cellules de tous les tubes de la piscine.</li>
	<li>Compter les cellules avec hémocytomètre.</li>
	<li>Cellules de la plaque comme décrit dans les étapes 6 - 7 selon l’application.</li>
	<li>Cellules de culture à 37 ° C, avec 10 % de CO2. Remarque : Les cellules peuvent être la culture pour jusqu'à 3-4 semaines avec des changements réguliers de médias ou une semaine sans changement de médias.</li>
</ol>6. repérer le revêtement des plaques de Culture de tissus/lamelles couvre-objet (jour 1)
<ol><li>Plaque 15 µL de revêtement de collagène IV directement au centre d’une plaque de culture de tissu enduit 24 puits anionique/cationique (voir Table des matières pour plus de détails) et incuber à 37 ° C, avec 10 % de CO2pendant 15 minutes.</li>
	<li>Après avoir compté un hémocytomètre cellules diluées à 2,3 x 105/ml au MGM. Aspirer la tache de collagène IV et immédiatement plaque 15 µL de suspension cellulaire à cet endroit ; Cela vous donnera 3. 5 x 103 cellules/spot. Incuber pendant 5-10 min à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pour permettre aux cellules d’adhérer, ajouter 500 µL de CO2 -équilibrés contenant milieu de croissance TGF-β2/IL-34/cholestérol (TIC) doucement dans le puits.</li>
	<li>Si le placage sur les lamelles, premier manteau lamelles de verre stériles avec 10 µg/mL stratagème-D-lysine (PDL) en H2O pendant 1 h à RT, laver 3 fois avec H2O et laissez sécher dans un capot sous la lumière UV. Une fois que les lamelles soient secs, procéder avec placage spot sur les lamelles comme décrit dans l’étape 6.2.</li>
</ol>7. placage pour l’isolement de l’ARN/protéines
<ol><li>Jour 1, manteau toute la zone d’un 24 puits anionique/cationique enduit plaque de culture tissulaire avec revêtement de collagène IV et incuber pour 10 min - 1 h à 37 ° C, avec 10 % de CO2, puis retirez et immédiatement plaque 3-5 x 104 cellules/puits dans CO2 équilibrés Médias TIC.</li>
	<li>Au jour 2, effectuer un changement de support de 50 % pour chacun bien le jour après la préparation. Les cellules mortes ont tendance à regrouper dans le centre du puits, afin de prendre médias de là.</li>
	<li>Effectuer un changement de support de 50 % tous les 2-3 jours afin de maintenir les cultures. Si le milieu change introduire une variable non désirée pour les cultures, les cellules peuvent survivre pendant environ 1 semaine sans aucun changement de médias, par opposition à plus de 3 semaines avec un entretien régulier.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Parce que les cellules microgliales servent de cellules immunitaires sentinelles du SNC, ils sont très sensibles aux changements environnementaux ; par conséquent, grand soin est nécessaire pour minimiser les réactions inflammatoires dans les cellules au cours de leur isolement et de culture8. Ceci est accompli dans le présent protocole par le biais de vitesse et de température. Chaque fois que possible réduit considérablement l’activation, donc toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 4 ° C...

Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements3,4. Changements dans la morphologie des microglies et la fonction sont omniprésents dans les blessures de CNS aiguës et chroniques et la microglie pièce modifiée morphologie, localisation et l’expression de médiateurs inflammatoires dans un large éventail d’États de maladie1. Des études génétiques humains indiquent que les mutations qui modifient le risque de maladies neurodégénératives sont souvent principalement ou exclusivement exprimées par la microglie dans le SNC intact, pointant vers un rôle critique pour la microglie dans la pathogenèse de la maladie ou la progression5 . Compte tenu de leur importance dans les blessures et les maladies, favoriser la compréhension de la biologie de la microglie est hautement prioritaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Nombreuses avancées essentielles à la compréhension de la biologie des microglies ont surgi en extrapolant des techniques et mécanismes découverts dans les études d’autres populations de macrophage, y compris les méthodes de culture, profils d’expression génique et définitions de fonctionnelle / morphologiques États. Bien que généralisée macrophage fonctions souvent se dérouler de façon surprenante dans le paysage de la CNS, les microglies sont elles-mêmes hautement spécialisé, présentant une morphologie ramifiée et une signature d’expression de gène unique qui les distingue des autres tissus macrophages6. La microglie ont une lignée qui se distingue de la plupart des autres macrophages tissulaires ; ils colonisent le système nerveux central au cours d’une vague embryonnaire précoce de l’hématopoïèse primitif et se renouvellement tout au long de la vie, indépendamment des contributions de l’hématopoïèse définitive7. La signature d’expression de gène de pleine maturité des microglies adulte n’est pas atteint jusqu'à la deuxième semaine après la naissance8. Les signaux environnementaux des tissus environnants jouent un rôle majeur en dictant des macrophages de tissu-spécifiques caractéristiques6, qui dans le système nerveux central comprend une exposition limitée à facteurs hématogène accordée par la barrière hémato - encéphalique9.
Un obstacle pour comprendre pleinement microgliales contributions à l’homéostasie du CNS et de la maladie est la difficulté de récapitulant les propriétés spécialisées des microglies mature vu en vivo avec cellules purifiées in vitro. Plusieurs méthodes ont été développées pour isoler et culture microglie intacte, mais la plupart des approches dépendent de sérum à l’appui de la survie des cellules. Nous avons montré que l’addition de sérum, qui est un réactif par nature variable contenant une vaste gamme de molécules bioactives, est particulièrement problématique lorsque travailler avec les cellules microgliales parce qu’elle encourage une morphologie amiboïde, augmente la prolifération, et phagocytose accrue9 a souvent vu dans vivo quand microglie sont exposés à des facteurs de diffusion hématogène après la rupture de la barrière hémato - encéphalique. Par ces mesures, exposés au sérum de cellules ressemblent à des microglies de blessures ou de maladies, mais ces altérations sont réduites quand les microglies sont cultivées en milieu défini contenant du CSF-1 (ou IL-34), le TGF-β, cholestérol et sélénite.
Ce protocole fournit des détails pour la culture des microglies rat juvénile dans des conditions sans sérum, associés à des travaux récemment publiés9. Ce protocole a été simplifié pour les rats de jour après la naissance 21-30 (P21 - P30), mais peut être adapté pour isoler la microglie de rats et de souris de n’importe quel âge, bien que le rendement et la viabilité globale variera selon l’espèce et l’âge de l’animal. Rendement maximal et viabilité optimale est obtenue lors de l’utilisation des microglies légèrement immatures (~ P9), avec des rendements et de la viabilité s’amenuisant progressivement à un peu plus faibles chez les animaux adultes. Microglies peuvent aussi être isolé chez des souris, mais nous avons trouvé que des cellules de rat montrent des rendements significativement plus élevée, la viabilité et complexité des morphologies ramifiés, comparativement aux cellules de la souris dans les cultures sans sérum. Animaux âgés de plus de P50 n’ont pas été évalués avec ce protocole. Cette procédure d’isolement d’immunopanning a été optimisée afin de minimiser les variations des profils transcriptionnelle microgliales lors de l’isolation et de maximiser la viabilité des cellules en aval. En utilisant ces techniques et les formulations de médias, des cultures primaires de haute-viabilité peuvent être maintenues pendant des semaines. Cultivées dans ces conditions la microglie présentent une morphologie très ramifiée impliquant rapide et la rentrée des processus et relativement faible taux de prolifération. Nous mettre en évidence l’importance du sérum-exposition sur ces propriétés et discuter des points forts et les faiblesses de cette méthode par rapport à d’autres approches.

<table><tbody><tr><td>Rat : Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>souris anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panoramique : 1:1 000 ; Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Chèvre polycoloniale anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Lapin polyclonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-souris 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-chèvre 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Coloration : 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (détergent dans la coloration ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’héparane</td><td>Galen Fournitures de laboratoire</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptone à partir de solides de lait</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta ; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol de la laine ovine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Cayman Chemicals&nbsp ;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoïque (Gondoïque) Acide</td><td>Cayman Chemicals&nbsp ;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/ Streptomycine</td><td>Gibco Cat</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl cystéine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (haute teneur en glucose)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Plaques&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Stock reagents&nbsp ; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution : 10 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td></td><td></td><td>Reconstitution : 5 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Sélénite</td><td></td><td></td> de sodium <td>Reconstitution : 2,5 mg/mL en H2O Concentration utilisée : 1:25 000 Conservation : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Collagène IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -80&deg ; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitution : 2 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution : 200 &mu ; g/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -80&deg ; C</td></tr><tr>Cholestérol <td></td><td></td><td>de laine ovine</td><td>Reconstitution : 1,5 mg/mL dans 100 % éthanol Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr>Sulfate <td></td><td></td><td>d’héparane</td><td>Reconstitution : 1 mg/mL dans H2O Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Acide oléique/Acide</td><td></td><td></td> gondoïque <td>Reconstitution : Gondoïque : 0,001 mg/mL ; Oléique : 0,1 mg/mL dans de l’éthanol à 100 % Concentration utilisée : 1:1 000 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr>Reconstitution<td>de l’héparine</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/mL dans PBS Concentration utilisée : 1:100 Stockage : -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp ; Recette de</td> tampon <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>perfusion</td><td>: 50 &mu ; g/mL d’héparine dans DPBS++ (PBS avec Ca++ et Mg+ +) Commentaires : À utiliser en cas de</td></tr><tr><td>tampon</td><td></td><td></td> de cuisson glacial <td>Recette : 200 &mu ; L de DNaseI à 0,4 % dans 50 mL de DPBS++ Commentaires : À utiliser en cas de cuisson glaciale</td></tr><tr><td>Recette</td><td></td><td></td><td>: 2 mg/mL de peptone provenant de solides de lait dans</td></tr> un <tr><td>milieu de croissance microgliale (MGM)</td><td></td><td></td> <td>DPBS++Recette : DMEM/F12 contenant 100 unités/mL de pénicilline, 100 &mu ; g/mL de streptomycine, 2 mM de glutamine, 5 &mu ; g/mL de N-acétylcystéine, 5 &mu ; g/mL d’insuline, 100 &mu ; g/mL d’apo-transferrine et 100 ng/mL de sélénite de sodium Commentaires : Utilisez du MGM glacé pour retirer la microglie du plat d’immnopanning.</td></tr><tr><td>Recette d’enrobage</td><td></td><td></td> de collagène IV <td>: MGM contenant 2 &mu ; g/mL de collagène IV</td></tr><tr><td>Recette de tampon</td><td></td><td></td> de séparation de la myéline <td>: 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL de 10x PBS sans Ca++ et Mg++, 9 &mu ; L 1 M CaCl2, 5 &mu ; L 1 M MgCl2 Commentaires : Bien mélanger après l’ajout de&nbsp ; CaCl2 et MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Milieux de croissance contenant du cholestérol (TIC)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Recette : MGM contenant 2 ng/mL de TGF-b2 humain, 100 ng/mL d’IL-34 murin, 1,5 &mu ; g/mL de cholestérol de laine ovine, 10 &mu ; g/mL de sulfate d’héparane, 0,1 &mu ; g/ml d’acide oléique, et 0,001 &mu ; g/ml d’acide gondoïque Commentaires : Assurez-vous d’ajouter du cholestérol aux milieux chauffés à 37 &deg ; C et ne pas ajouter plus de 1,5 &mu ; g/mL ou il précipitera. Ne filtrez pas les milieux contenant du cholestérol. Équilibrez les milieux TIC avec 10 % de CO2 pendant 30 minutes à 1 heure avant de les ajouter aux cellules pour assurer un pH optimal.</td></tr></tbody></table>

isolement et culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

La microglie représentent 5 à 10 % de toutes les cellules du système nerveux central (SNC) et sont plus en plus attirant l’attention en raison de leurs contributions au cours de développement, l’homéostasie et la maladie. Bien que les macrophages ont été étudiés en détail pour des décennies, des fonctionnalités spécialisées des microglies, les macrophages tissulaires-résident du SNC, sont restés en grande partie mystérieuse, en partie à cause de limitations dans la capacité de récapituler des microglies mature biens immobiliers à la culture. Ici, nous montrons une procédure simple et directe pour l’isolement rapide de pure microglie du cerveau mature rongeur. Nous décrivons également les conditions de culture sans sérum qui prennent en charge des niveaux élevés de viabilité microgliales au fil du temps. Cultivées dans ces conditions de milieu défini la microglie pièce complexes processus ramifiés et comportement dynamique de surveillance. Nous illustrons quelques effets de l’exposition de sérum sur des microglies culture et examiner comment ces cultures sans sérum comparent à la fois exposés au sérum de cultures ainsi que la microglie in vivo.

Ce protocole décrit une méthode de culture haute pureté ramifiée microglie de jeunes rats. Résultats similaires peuvent être obtenus utilisant des animaux immatures, périnatales et adultes, tel que discuté ci-dessous. Étant donné que l’isolement de cellules comprendre souvent des nuances subtiles et nombreuses possibilités pour les cellules à mourir, nous avons utilisé points de contrôle de contrôle de la qualité pour aider à déterminer le succès à différentes étapes. En général, nous avo...

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

L’objectif global de ce protocole de culture cellulaire est de générer des cultures microgliales très pures de rongeurs en développement ou adultes, qui peuvent être maintenues sans exposition au sérum. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences liées à la morphologie de la microglie, à la cétose fibreuse et à l’interaction de la microglie avec d’autres types de cellules du SNC. Le principal avantage de ce protocole est que la microglie peut être rapidement isolée des tissus de rongeurs de tout âge et cultivée sans exposition au sérum.Pour enlever le cerveau, coupez le condyle occipital de la moelle épinière d’un animal des deux côtés avec des ciseaux de dissection, en faisant attention de ne pas endommager le cerveau. Ensuite, coupez la peau le long du haut du crâne et coupez un côté le long de l’os pariétal et frontal vers l’os nasal. Tirez délicatement le haut du crâne vers l’arrière avec une pince, retirez rapidement le cerveau et placez-le dans du DPBS pré-refroidi sur de la glace.Répétez la procédure pour tous les animaux restants. Une fois que les cerveaux ont été collectés dans du DPBS froid, coupez chaque cerveau en morceaux d’un millimètre cube dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une lame de scalpel froide et transférez-les dans un homogénéisateur de dénonciation glacé avec cinq à sept millilitres de tampon de douncing glacé. Ensuite, utilisez un homogénéisateur de dénonciation mal ajusté pour dissocier le tissu avec 10 à 20 mouvements doux et incomplets.Veillez à ne pas écraser directement le tissu au fond de l’homogénéisateur. Au lieu de cela, poussez le tissu à travers l’espace entre les côtés du piston et l’homogénéisateur. Il est important d’homogénéiser lentement le tissu avec plusieurs cycles de gonflement pour préserver la viabilité de la microglie.Ensuite, retirez délicatement le piston pour éviter d’introduire des bulles d’air. Laissez les morceaux de tissu mal dissociés se déposer au fond de l’homogénéisateur et transférez le surnageant dans un nouveau tube conique réfrigéré de 50 millilitres. Par la suite, remplacez le volume retiré par un tampon de gonflage frais et répétez la procédure de dissociation pendant un total de trois à quatre tours, ou jusqu’à ce que tous les tissus aient été dissociés.Dans cette procédure, ajoutez un tampon de douncing glacé dans le tube conique de 50 millilitres contenant la suspension cellulaire et ajustez le volume total à 33,5 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de MSB à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Cela se traduira par une concentration finale de 23 % de MSB dans un volume de 43,5 millilitres.Après cela, centrifugez les cellules pendant 15 minutes à 500 x g à 4 degrés Celsius avec freinage lent. Ensuite, retirez la couche supérieure de myéline et de débris et le surnageant à l’aide d’une pipette. Lorsque vous retirez la couche supérieure, veillez à ce qu’elle soit enlevée autant que possible.Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 12 millilitres de tampon de casserole. Triturez doucement la suspension cellulaire pour briser les amas de cellules restants. Dans cette étape, faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 70 micromètres pour éliminer les gros débris ou les amas de cellules.Rincez trois fois le plat de cuisson revêtu d’OX42 avec du DPBS. Ne laissez pas la plaque sécher complètement entre les lavages. Videz le dernier lavage DPBS et appliquez la suspension cellulaire filtrée sur le plat de cuisson.Faites tourner doucement la plaque pour répartir les cellules. Ensuite, incubez la plaque sur une surface plane à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer. N’incubez pas plus de 20 minutes ou les cellules deviendront très difficiles à récupérer du plat.Ensuite, rincez 10 fois le plat de cuisson avec du DPBS pour éliminer les cellules non adhérentes. La microglie sera fermement attachée à la plaque, alors faites tourner la plaque à chaque rinçage pour assurer l’élimination des autres cellules non adhérentes. Videz le dernier lavage DPBS et remplacez-le par 15 millilitres de DPBS et 200 microlitres de trypsine.Pour trypsiniser les cellules, incubez la boîte pendant moins de 10 minutes ou égale à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes de trypsinisation, la microglie sera toujours collée à la plaque. Versez le mélange et lavez doucement la plaque deux fois avec du DPBS pour éliminer la trypsine.Ensuite, remplacez par 12 millilitres de MGM glacé. Par la suite, placez la coupelle sur de la glace pendant deux minutes pour aider à affaiblir l’interaction entre les cellules et le substrat et assurez-vous que la boîte est plate pour éviter que certaines zones de la boîte ne se dessèchent. Après cela, pipetez vigoureusement avec une pipette de 10 millilitres et un contrôleur de pipette à grande vitesse pour récupérer les cellules de la boîte de cuisson.Dessinez une grille de 16 par 16 avec le jet de liquide de la pipette pour essayer de retirer toutes les cellules. Il est important de trouver un équilibre entre la récupération cellulaire globale et la santé de votre culture. Le pipetage répété du surnageant cellulaire contre la boîte de cuisson entraînera une réduction de la viabilité de votre culture.Vérifiez les cellules au microscope à un grossissement de 20x pour vous assurer qu’elles se sont détachées de la plaque. Marquez les endroits sur le dessus de la parabole où les cellules sont coincées et répétez le pipetage dans ces zones. Prélevez la suspension cellulaire et allouez trois à quatre millilitres de surnageant dans chaque tube conique de 15 millilitres.Faites-le tourner pendant 15 minutes à 500 x g à quatre degrés Celsius avec freinage lent. Après 15 minutes, aspirez le surnageant, en laissant 0,5 millilitre de MGM avec la pastille cellulaire. Ensuite, remettez en suspension chaque pastille dans le MGM restant et retirez les cellules de tous les tubes.Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Maintenant, plaquez 15 microlitres de collagène IV directement au centre d’une plaque de culture tissulaire à revêtement cationique anionique de 24 puits et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluez-les à 2,3 x 10 à cinq par millilitre de MGM.Aspirez le collagène IV et déposez immédiatement 15 microlitres de suspension cellulaire à cet endroit pour obtenir 3,5 x 10 aux trois cellules par point. Ensuite, incubez pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules d’adhérer. Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de TIC équilibré en CO2 dans le puits.Si vous placez des lamelles sur des lamelles, enduisez d’abord les lamelles en verre stérile avec 10 microgrammes par millilitre de PDL dans de l’eau pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez-les trois fois à l’eau et laissez-les sécher dans une hotte sous une lumière UV avant de procéder au placage sur les lamelles de couverture. Afin de démontrer l’isolement et la culture réussis de microglies très pures, nous avons isolé des microglies de rats P21 et cultivé ces cellules dans des TIC ou des TIC supplémentés avec 10 % de FCS pendant huit jours.Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec des marqueurs microgliaux et des marqueurs de prolifération. Les cellules cultivées dans les TIC présentent une morphologie ramifiée, de faibles niveaux de prolifération et l’expression de marqueurs microgliaux. En comparaison, les cellules cultivées dans des TIC supplémentés avec 10 % de FCS sont également colorées pour les marqueurs microgliaux, mais présentent des niveaux élevés de prolifération et de morphologie amiboïde, propriétés souvent observées dans les microglies activées.En plus de la coloration des marqueurs cellulaires, le RNA-Seq sur des cellules fraîchement isolées peut fournir un outil puissant et sensible pour évaluer le profil ARN des cellules et peut aider à informer la pureté de départ des cultures. Le micropannage CD11b entraîne généralement un faible pourcentage de neutrophiles CD11b positifs et de transfert de monocytes, en plus d’une microglie CD11b positive. Ces cellules mourront dans les TIC après quelques jours, mais peuvent compliquer l’analyse de points temporels antérieurs.Voici une vidéo en accéléré de la microglie du rat P21 après 14 DIV dans TIC. Après deux semaines, les cultures sans sérum présentent un comportement de surveillance dynamique avec des extensions et des rétractions rapides du processus dans toute la boîte. Voici une vidéo en accéléré de la microglie du rat P21 après cinq DIV dans le TIC avant et après l’exposition au sérum de veau fœtal.Un changement morphologique rapide est évident après l’exposition au sérum. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en quatre à cinq heures, s’il est exécuté correctement. Suite à cette procédure, d’autres tests pour surveiller la phagocytose, la chimiotaxie, la survie, la libération de cytokines, les réponses transcriptionnelles aux stimuli, peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires sur la fonction de la microglie.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler rapidement les microglies des tissus de rongeurs adultes et de les cultiver dans des conditions sans sérum.

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Neurosciences

Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules...

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Cette vidéo présente une méthode d’isolement et de culture de microglie à partir de cerveaux de rats. Il s’agit de séparer la microglie d’autres cellules neuronales et non neuronales à l’aide de plaques recouvertes d’un anticorps monoclonal spécifique de la microglie.

Isolement et culture de la microglie à partir de cerveaux de rats à l’aide de milieux sans sérum

Cette vidéo présente une technique d’élimination sélective de la microglie à partir d’une culture neuronale primaire de rat. Les neurones granulaires cérébelleux sont traités avec un antimétabolite pour éliminer les cellules gliales proliférantes. De plus, ils sont traités avec des agents ciblant les lysosomes pour épuiser la microglie de la culture.

Élimination sélective de la microglie d’une culture de neurones granulaires cérébelleux de rat

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Apprenez à isoler et cultiver des microglies de rongeurs dans un milieu sans sérum pour préserver leur morphologie ramifiée. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellulaires dans le SNC.

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

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