Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS
8 mai 2018
Nous présentons ici deux nouvelles méthodes, psPACT et mPACT, pour réaliser la transparence optique maximale et l’analyse microscopique ultérieure de la vascularisation des tissus chez le rongeur intact entier CNS.
L’objectif global de ces méthodes psPACT et mPACT est l’élimination rapide de l’ensemble du tissu du SNC sans avoir besoin d’un système d’élimination électrophorétique des tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des modèles de recherche sur les maladies humaines, telles que la maladie d’Alzheimer ou les blessures, la dégénérescence et la tumorigenèse. Le principal avantage de cette technique est que le tissu du SNC de la souris n’est pas endommagé par le nettoyage électrophorétique du tissu, et qu’il est rapidement éliminé par le nettoyage passif modifié.
Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir utilisé le PACT original et la méthode précédente pour le nettoyage du cerveau. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les méthodes psPACT et mPACT sont difficiles à exécuter car cette méthode comporte plusieurs étapes de préparation de l’échantillon. Commencez par préparer la solution cocktail PACT en ajoutant la poudre VA-044 à une solution de 4 % de PFA et 4 % d’acrylamide à une concentration finale de 0,25 %. Après avoir perfusé les tissus avec la solution de PACT, immergez complètement le cerveau et la moelle épinière dans un tube de 50 millilitres contenant une solution de PACT réfrigérée, et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.
24 heures plus tard, transférez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant une solution PACT fraîche et froide, et connectez le capuchon du tube à un système d’hybridation de gel tissulaire, connecté à un réservoir d’azote et réglé à 37 degrés Celsius. Ensuite, allumez le vide et le gaz pendant 10 minutes pour intégrer l’échantillon dans de l’azote gazeux. Pour polymériser l’hydrogel, placez le tube contenant l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant trois heures ou jusqu’à ce que la polymérisation soit terminée.
Après l’incubation, utilisez du papier buvard pour enlever l’hydrogel polymérisé restant entourant les tissus. Ensuite, transférez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant une solution éclaircissante. Placez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé.
En moyenne, il faut environ 20 jours pour que le SNC de la souris atteigne une clarté complète. Commencer psPACT avec le SNC d’une souris perfusée avec 4 % de PFA qui a été post-fixée dans 4 % de PFA à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Lavez le tissu fixé pendant une heure dans du PBS 0,1 molaire.
Après le lavage, transférez le tissu dans la solution A4P0 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, après avoir lavé le mouchoir dans du PBS pendant cinq minutes, immergez-le dans du VA-044 à 0,25 % dans du PBS et incubez à 37 degrés Celsius pendant six à 24 heures. La séparation de l’acrylamide et de l’étape VA-044 suivante évite d’avoir à éliminer les monomères d’hydrogel non polymérisés restants qui entourent le tissu, ce qui peut compromettre l’intégrité finale du tissu après avoir obtenu la transparence avec PACT.
Après l’incubation, transférez les tissus dans une solution fraîche et froide de VA-044. Ensuite, incorporez l’échantillon dans de l’azote gazeux pendant 10 minutes. Transférez le tissu dans une solution éclaircissante.
Ensuite, incubez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé. En moyenne, il faut environ 17 jours pour que le SNC de la souris atteigne une clarté complète. Pour mPACT, suivez le protocole pour psPACT jusqu’à l’étape de clarification de la solution.
Ensuite, immergez complètement la solution de clarification tissulaire contenant 0,5 % d’alpha-thioglycérol, un agent débrunissant, en plus de 8 % de SDS dans 0,1 molaire de PBS. Placez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé. En moyenne, il ne faut que deux semaines au SNC de la souris pour obtenir une clarté complète à l’aide de mPACT.
Dans la présente étude, les échantillons de cerveau de souris traités via le protocole mPACT ont atteint une transparence optique après 14 jours, avant les échantillons traités via les protocoles PACT et psPACT. Les échantillons de SNC entiers de rats éliminés par mPACT ont atteint leur clairance maximale en 20 jours. Les cerveaux de rats adultes seuls, par opposition à l’ensemble du SNC, ont été éliminés avec mPACT en seulement cinq jours.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines avec le SNC entier de la souris si elle est réalisée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences et de l’anatomie pour explorer les maladies physiopathologiques, telles que les lésions tissulaires, les malformations du développement, le cancer et les maladies neurodégénératives dans des modèles de SNC de mammifères.
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Aperçu
Cette étude présente deux méthodologies innovantes, psPACT et mPACT, destinées à améliorer la transparence optique et à faciliter l'analyse microscopique de la vascularisation du système nerveux central (SNC) de rongeurs en entier. Ces techniques visent à rendre rapidement transparents des tissus entiers du SNC sans les endommager, répondant ainsi à des questions clés liées aux modèles de maladies humaines telles que la maladie d'Alzheimer et la tumorigenèse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques de clarification tissulaire
- Imagerie microscopique
Contexte
- L'étude s'appuie sur des méthodes antérieures, en soulignant les limites du blanchiment tissulaire électrophorétique.
- Met l'accent sur la nécessité de procédés de blanchiment rapides et efficaces pour les tissus du SNC de rongeurs.
- Propose des solutions à la fois pour la recherche fondamentale et pour les implications cliniques en neurosciences.
Objectif de l'étude
- Développer et valider les protocoles psPACT et mPACT comme méthodes efficaces de clarification des tissus du SNC.
- Étendre les capacités offertes aux chercheurs étudiant les conditions neuropathologiques.
- Faciliter une meilleure visualisation de la vascularisation tissulaire dans le SNC.
Méthodes utilisées
- Les méthodes impliquent un protocole multiphasé pour préparer et clarifier les tissus du SNC à l'aide de solutions PACT.
- Les modèles biologiques clés comprennent des échantillons de SNC de souris et de rat, avec un accent mis sur l'obtention d'une transparence optique.
- La technique psPACT prend généralement environ 20 jours pour atteindre une clarté complète, tandis que la méthode mPACT peut y parvenir en environ 14 jours.
- Des solutions spécialisées et des environnements d'incubation sont utilisés pour les processus de polymérisation et de clarification.
Résultats principaux
- mPACT offre une réduction significative du temps de clarification tissulaire par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Les échantillons traités avec mPACT ont présenté une transparence optique en un temps plus court, suggérant une efficacité accrue pour les applications de recherche.
- Les techniques se révèlent efficaces pour faciliter l'étude de diverses affections neurologiques.
Conclusions
- La présente étude permet un éclaircissement rapide et efficace des tissus du SNC, améliorant ainsi les capacités de recherche dans le domaine des neurosciences.
- Les méthodologies nouvelles constituent des outils précieux pour explorer les mécanismes des maladies et les lésions tissulaires.
- Les retombées pour la compréhension des maladies neurodégénératives et l'amélioration des études pathologiques grâce à des techniques d'imagerie perfectionnées sont considérables.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
De nouvelles méthodes passives de clarification, telles que psPACT et mPACT, répondent à un goulot d'étranglement critique dans la recherche et le développement en neurosciences en permettant une transparence optique rapide et de haute fidélité de tissus entiers du SNC, sans endommagement électrophorétique. Cette capacité soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les modèles de maladies neurodégénératives, en préservant l'architecture subcellulaire tout en accélérant les délais d'imagerie. Ces techniques renforcent la fiabilité prédictive des études précliniques sur les modèles de la maladie d'Alzheimer, de tumorigenèse et de lésions, grâce à une meilleure visualisation des phénotypes neuropathologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans des modèles du SNC intacts en préservant les structures subcellulaires et les circuits cellulaires pour des études d'engagement des cibles.
- Valeur opérationnelle : Réduit les artefacts liés au traitement des tissus associés à l'élimination électrophorétique, améliorant ainsi la reproductibilité des résultats du criblage phénotypique.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en fournissant des lectures plus claires de la progression des maladies neurodégénératives dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des préparations standardisées et transparentes du SNC, adaptées à l'imagerie haute résolution de biomarqueurs subcellulaires et à la modulation des voies biologiques.
- Valeur opérationnelle : Supprime le besoin d'équipements électrophorétiques spécialisés, réduisant ainsi les obstacles à la mise en œuvre du test au sein des équipes de découverte.
- Extensibilité : mPACT permet d'obtenir une transparence du SNC murin en environ 14 jours, permettant des délais prévisibles pour les campagnes de criblage de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet une transition fluide entre la découverte et la validation préclinique en préservant l'intégrité des tissus pour des études longitudinales de la tumorigenèse et des malformations développementales.
- Réduction des incertitudes mécanistiques : Permet la visualisation de structures subcellulaires dans les tissus pathologiques, réduisant ainsi l'ambiguïté dans l'interprétation des mécanismes cibles.
- Fidélité du modèle de maladie : Assure un éclaircissement CNS cohérent chez les rongeurs (souris/lapin), améliorant la comparabilité entre études en pharmacologie de sécurité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
psPACT et mPACT s'inscrivent dans la continuité entre la découverte précoce et le développement préclinique, en soutenant spécifiquement la validation de cibles jusqu'à l'optimisation des candidats, grâce à des modèles du SNC quantifiables et prêts à être utilisés en imagerie.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses grâce à la cartographie tridimensionnelle de l'expression protéique et de la distribution cellulaire dans des tissus intacts, clarifiant ainsi l'implication des voies dans les modèles de maladie.
- Écrans : Fournit des préparations tissulaires reproductibles et quantitatives qui permettent une évaluation standardisée des effets des composés sur l'architecture du SNC.
- Analytique : Génère des images haute résolution permettant aux équipes de comparer les modifications structurelles entre différentes conditions de traitement avec un meilleur rapport signal/bruit.
- Recherche translationnelle : Préserve la continuité protéomique et structurelle du stade de découverte à celui du développement préclinique, facilitant l'alignement des biomarqueurs dans les modèles de neurodégénérescence et de lésion.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme de clarification du SNC réutilisable, applicable à plusieurs projets d'étude de la neuropathologie, réduisant ainsi le développement redondant de méthodes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à la visualisation de tissus intacts.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité en évitant les paramètres électrophorétiques variables et la dépendance aux équipements.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité des décisions de poursuite ou d'abandon en accélérant la génération de données précliniques pour les candidats ciblant le système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des programmes de neurodégénérescence et d'oncologie grâce à des lectures phénotypiques plus rapides et plus claires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie tissulaire, en chimie des hydrogels et en exécution de protocoles d'incubation pour gérer la préparation étagée des échantillons.
- Dépend d'incubateurs agitateurs, de systèmes de gaz azote et d'environnements contrôlés en température pour les phases de polymérisation et de clarification des hydrogels.
- Exige une standardisation inter-équipes de la préparation des solutions (par exemple, concentrations de VA-044, de SDS) et des contrôles temporels afin d'assurer la reproductibilité entre laboratoires.
- L'adaptation à des tissus non-CNS (par exemple, rein, rate) nécessite une validation des durées de clarification et de la préservation structurale, comme indiqué dans la documentation source.
- Limite pratique : la réussite du protocole dépend d'une exécution méticuleuse en raison du grand nombre d'étapes de préparation, toute déviation risquant une clarification incomplète ou des dommages tissulaires.
