Name: Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Découvrez les méthodes psPACT et mPACT pour la clarification rapide du système nerveux central entier chez la souris et le rat. Ces protocoles permettent une analyse microscopique détaillée sans dommage électrophorétique.

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Ce travail a été soutenu par le projet cerveau Corée 21 avec pour la Science médicale, Université de Yonsei. En outre, ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (FRO-2017R1D1A1B03030315).

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par le Comité d’éthique de recherche appropriées à la faculté de médecine de l’Université de Yonsei. Tous les animaux sont sacrifiés selon les orientations de la Comité de protection des animaux de laboratoire à la faculté de médecine de l’Université de Yonsei.
1. préparation des réactifs
ATTENTION : Paraformaldéhyde (PFA), acrylamide et sodium dodecyl sulfate (SDS) sont irritants toxiques et doivent donc être manipulés sous une hotte avec les équipements de protection individuelle appropriés (PPE, blouse, gants, lunettes de protection).
<ol><li>solution à 4 % d’acrylamide (A.A) (A4P0) : ajouter 20 mL de solution de 40 % d’acrylamide à 180 mL de 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS).</li>
	<li>0,25 % VA-044 solution : ajouter 0,5 g de 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride (VA-044) poudre à 200 mL de 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS). Tandis que la poudre VA-044 peut être conservée à température ambiante, il doit être stocké à 4 ° C après solubilisation dans du PBS. Pour de meilleurs résultats, préparer uniquement la quantité de solution requise pour l’expérience.</li>
	<li>Solution cocktail Pacte : ajouter 10 g de l’acrylamide à 225 mL de solution de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % et régler le volume à 200 mL avec 4 % PFA. Avant utilisation, ajouter 100 mg de poudre de VA-044 à 40 mL du mélange dans un tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Pacte de solution tampon de compensation : ajouter 40 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 350 mL de PBS de 0,1 M et régler le volume de 500 mL avec du PBS de 0,1 M. Pour mPACT clearing solution, ajouter 0,5 % α-thioglycérol au Pacte de solution tampon de compensation.</li>
	<li>Les souris utilisées dans cette étude étaient des souris mâles BALB 2 semaines ; les rats utilisés dans cette étude étaient SD-rats mâles âgés de 2 semaines.</li>
</ol>2. anesthésie et la chirurgie de Perfusion
ATTENTION : PFA et acrylamide sont irritants toxiques et donc doivent être manipulés sous une hotte avec épi approprié.
<ol><li>Anesthésier l’animal dans une pièce exempts de micro-organismes pathogènes avec 30 mg/kg de zoletil à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 26. Surveiller l’animal pendant 5-10 min.</li>
	<li>Une fois que l’animal ait atteint un plan chirurgical de l’anesthésie, utilisez la méthode de réponse orteil-pincée pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. Confirmer l’absence de réaction. Remarque : Les étapes suivantes impliquant la souris et le rat chirurgie suivent un protocole similaire utilisé dans une précédente étude11.</li>
	<li>Faire une incision de 5 à 6 cm sous la cage thoracique, à travers le tégument et la paroi abdominale.</li>
	<li>Utiliser des ciseaux courbés, émoussé à pratiquer une incision dans la membrane, palpant la région thoracique pour localiser le site d’incision au préalable.</li>
	<li>Prolonger l’incision sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale.</li>
	<li>Soigneusement supplanter les poumons. Faire une coupe à travers la cage thoracique jusqu'à la clavicule. À l’aide de ciseaux iris, faire une petite incision à l’extrémité postérieure du ventricule gauche. Insérer une aiguille de calibre 18-pointe arrondie ou d’olive perfusion dans l’aorte ascendante, passant par le ventricule coupé.</li>
	<li>Fixer l’aiguille et éviter les fuites en pinçant le coeur avec une pince hémostatique. Alternativement, utiliser une pince hémostatique modifiée afin de serrer l’aorte autour de la pointe de l’aiguille.</li>
	<li>Faire une grande incision dans l’oreillette droite, en veillant à assurer un minimum de dommages à l’aorte. Le rat est maintenant prêt pour perfusion.</li>
</ol>3. toute Perfusion et la Dissection du Rat
ATTENTION : PFA et acrylamide sont irritants toxiques et donc doivent être manipulés sous une hotte avec épi approprié.
Remarque : Les étapes suivantes de toute perfusion sont un semblable à un protocole utilisé dans une étude antérieure par Woo et al. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Fixer l’oreillette droite du coeur à une aiguille de calibre 18, en prenant soin de n’introduit ne pas de bulles d’air.</li>
	<li>Rapidement et uniformément à l’aide d’une seringue de 50 mL, pompe de 50 mL de solution de PBS 0,1 M froide contenant de l’héparine (10 unités/mL).</li>
	<li>Connectez l’aiguille de calibre 18 au tube de la pompe péristaltique.</li>
	<li>Lavez avec 200 mL de solution de PBS 0,1 M froide contenant de l’héparine (10 unités/mL) à une vitesse de circulation de 10 mL/min.</li>
	<li>Difficulté avec 250 mL de solution PFA froide 4 % à une vitesse de circulation de 10 mL/min. Le rat doit être raide à ce stade.</li>
	<li>Collecter et stocker la solution restante de la PFA à l’élimination.</li>
	<li>Du Pacte, pour perfuse les tissus avec une solution de cocktail de Pacte réfrigérée 4 % PFA, 4 % d’acrylamide, et 0,25 % VA-044 poudre avec une aiguille de calibre 18 et retirez la tête et la colonne vertébrale. Exposer le crâne en faisant une incision médiane du cou au nez. Cette étape de perfusion supplémentaire n’est pas nécessaire pour les méthodes psPACT et mPACT ; après fixation, immédiatement isoler la tête et la colonne vertébrale et exposer le crâne.</li>
	<li>Exposer la base du crâne en enlevant toute cou résiduel et les muscles de la colonne vertébrale.</li>
	<li>Utiliser des pinces-gouges et ciseaux à se pour décoller du crâne. Retirer le cerveau et la moelle épinière.</li>
	<li>Stocker les tissus chez 4 % PFA à 4 ° C ; les tissus peuvent être stockés pendant 1 semaine.</li>
</ol>4. Hydrogel monomère Infusion et la polymérisation du SNC Rat et souris
ATTENTION : Acrylamide, SDS, α-thioglycérol et PFA sont irritants et donc doivent être manipulés sous une hotte et avec PEE approprié.
<ol><li>
Pacte (Passive Technique de compensation)
	<ol>
<li>Isoler et de la culture de la CNS entier (cerveau et moelle épinière) de rats et de souris fixes dans un tube de 50 mL contenant une solution de cocktail de Pacte réfrigérée de 4 % PFA, 4 % d’acrylamide et 0,25 % de poudre de VA-044 et conserver à 4 ° C pendant 24 h. veiller à ce que le tissu est complètement immergé dans le s olution.</li>
		<li>Incorporer l’échantillon en azote gazeux pour 10 min à l’aide d’un tissu gel système d’hybridation raccordé à un réservoir d’azote : définir le système à 37 ° C. Transfert de tissus dans un tube de 50 mL contenant frais froid (4 ° C) Pacte solution cocktail et se connecter avec le capuchon du tube, puis allumez l’aspirateur.</li>
		<li>Pour polymériser l’hydrogel, placer le tube contenant l’échantillon dans un incubateur à agitation (150 tr/mn, 37 ° C) pendant 3 h, ou jusqu'à ce que la polymérisation est terminée.</li>
		<li>À l’aide de papier buvard (voir la Table des matières), retirez l’hydrogel polymérisée reste les tissus environnants.</li>
		<li>Transférer le tissu dans un tube de 50 mL contenant une solution de compensation (8 % SDS dans du PBS de 0,1 M, pH 8,0).</li>
		<li>Placer l’échantillon dans un incubateur à agitation mis à 37 ° C et 150 tr/min, jusqu'à ce que le tissu a été effacé. En moyenne, il faut environ 20 jours pour la souris CNS pour atteindre la pleine clarté.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (Technique de compensation Passive distincts de processus)
	<ol>
<li>Isoler le CNS entier (cerveau et moelle épinière) avec coupe-OS et ciseaux de PFA-correction des souris et des rats sur un banc propre.</li>
		<li>Transfert de tissus dans un tube de 50 mL contenant 4 % PFA et conserver à 4 ° C pendant 24 h. s’assurer que le tissu est complètement immergé dans le fixateur.</li>
		<li>Laver le tissu fixe pendant 1 h dans du PBS de 0,1 M et puis les transférer vers la solution A4P0 (4 % d’acrylamide dans du PBS de 0,1 M). Magasin à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Laver le tissu pendant 5 min dans du PBS de 0,1 M.</li>
		<li>Plongez le tissu dans 0,25 % VA-044 dans du PBS de 0,1 M. Stocker à 37 ° C pendant 6 à 24 heures et puis les transférer vers la nouvelle solution VA-044/PBS de 0,25 %.</li>
		<li>Incorporer l’échantillon en azote gazeux pour 10 min à l’aide d’un tissu gel hybridation système (voir la Table des matières) raccordé à un réservoir d’azote : transférer des tissus dans un tube de 50 mL contenant frais froid (4 ° C) solution de 0,25 % de VA-044/PBS et se connecter avec le capuchon du tube. Allumez l’aspirateur.</li>
		<li>Transférer le tissu à clearing solution (8 % SDS dans du PBS de 0,1 M, pH 8,0).</li>
		<li>Incuber l’échantillon dans un incubateur à agitation mis à 37 ° C et 150 tr/min, jusqu'à ce que le tissu a été effacé. En moyenne, il faut environ 17 jours pour souris CNS pour atteindre la pleine clarté.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (mis à jour le passif Clearing Technique)
	<ol>
<li>Isoler le CNS entier (cerveau et moelle épinière) avec coupe-OS et ciseaux de PFA-correction des souris et des rats sur un banc propre.</li>
		<li>Suivez les étapes 4.2.2 - 4.2.8 du protocole psPACT.</li>
		<li>Transférer le tissu à la solution de compensation. Notez que, contrairement à des protocoles de Pacte et psPACT, mPACT nécessite une solution de compensation composée de 0,5 % α-thioglycérol en plus de 8 % SDS dans du PBS de 0,1 M, pH 8,0. Α-thioglycérol est un agent non-brunissage qui aide à effacer les tissus plus rapidement et efficacement. S’assurer que le tissu est complètement immergé dans la solution.</li>
		<li>Placer l’échantillon dans un incubateur à agitation mis à 37 ° C et 150 tr/min, jusqu'à ce que le tissu a été effacé. En moyenne, il faut environ 2 semaines pour souris CNS pour atteindre la pleine clarté.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. indice de réfraction correspondant et Immunostaining des CNS défrichée
Remarque : njantes (axée sur les Nycodenz de la Solution indice de réfraction correspondant) se compose de 0,8 g/mL Nycodenz poudre dissous dans 30 mL de tampon base (0,01 % d’azide de sodium et Tween-20 dans du PBS de 0,1 M, pH 8,0). Il est recommandé que la solution est placée dans un 37 ° C, secouant incubateur permettant de solvatation correcte de la poudre.
<ol><li>Incuber les tissus dans 0,1 % Triton X-100 dans du PBS de 0,1 M pendant 2 h, puis se bloquent avec 2 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS de 0,1 M pendant 6 h.</li>
	<li>Laver les sections trois fois dans le PBST (0,1 % Tween-20 dans du PBS de 0,1 M) pendant 2 h. tache sections avec des anticorps primaires (dans ce cas, un anticorps anti-lapin PECAM-CD31, dont les vaisseaux sanguins des taches) durant 2 jours.</li>
	<li>Tacher les sections avec des anticorps secondaires (dans ce cas, un chèvre anti-lapin IgG Cy3 fluorescent conjugué) à 2 % de BSA durant 2 jours.</li>
	<li>Laver les étiquettes tissus trois fois dans du PBST pendant 2 h et magasin dans 15 mL njantes pendant 2 à 10 jours.</li>
	<li>Pour imagerie, changer tissus marqués d’une petite quantité de jantes nsur la vaisselle de vitroplants de 35 – ou 60 mm. Fixer avec du silicone autour du bord inférieur du plat.</li>
	<li>Ajouter 1,5 à 2 mL de frais njantes.</li>
</ol>6. traitement de l’image
<ol><li>Acquisition d’images de tissus défrichées avec tuile de numérisation à l’aide d’un grossissement de 10 x microscopewith confocale à balayage laser (voir Table des matières). Pour du tissu Cy3 marquée, utilisez longueurs d’onde de 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que les méthodes d’extraction passive, non-électrophorétique employées dans Pacte amélioré de manière significative la consistance obtenue avec tissu précédent compensation des méthodes telles que clarté2,3,4,7 , 8, la technique porte encore plusieurs lacunes, les plus pressants dont sont la longueur du temps nécessaire pour atteindre les tissus maximale...

Des objectifs fondamentaux de l’enquête scientifique et clinique consiste à atteindre une compréhension complète de la structure de l’organe et la fonction ; Toutefois, la nature extrêmement complexe d’organes chez les mammifères sert souvent de barrière pour atteindre pleinement cet objectif1. CLARTÉ (lipides claire-échangé hybridé Acrylamide rigide compatible avec l’imagerie violets-hYdrogel)2,3,4, qui prévoit la construction d’un hybride d’hydrogel axée sur l’acrylamide de tissus intacts, réalise espace optique de divers organes, y compris le cerveau, le foie et la rate, tout en préservant leur intégrité structurale5. CLARTÉ a ainsi permis de non seulement visualisation, mais aussi l’occasion de disséquer finement les réseaux cellulaires complexes et morphologies de tissus sans la nécessité pour le sectionnement.
Afin de réaliser le dégagement de tissu, clarté emploie des méthodes électrophorétiques pour éliminer la teneur en lipides de l’échantillon à portée de main. Alors que la clarté a été notée pour produire des hybrides de tissu-hydrogel physiquement stable, des études ont montré que son utilisation des méthodes de compensation (etc.) tissu électrophorétique donne des résultats variables en termes de qualité de tissus, y compris le brunissement, épitope dommage, et protéine perte5,6. Pour résoudre ces problèmes, les protocoles modifiés tels que le Pacte (Technique PAssive de clarté), qui remplace le traitement ETC avec une technique de délipidation fonction passive, ionique-détergent, ont été développés7,8,9. Malgré la réalisation d’une plus grande cohérence dans les résultats, cependant, Pacte exige plus de temps pour obtenir l’autorisation maximale. En outre, aucune de ces techniques ont encore été appliqué à la forme de CNS entier, ou dans des modèles plus grands rongeurs comme les rats et les cobayes.
La présente étude vise à pallier ces lacunes en proposant de nouvelles méthodes, psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), pour faciliter le dégagement rapide de la CNS entier et des organes internes à la souris et le rat modèles10. Plus précisément, psPACT traite les tissus à 4 % d’acrylamide et 0,25 % VA-044 en deux étapes distinctes au cours de la formation de l’hydrogel ; mPACT essentiellement basée sur les mêmes étapes, mais complète la solution de compensation basée sur SDS avec 0,5 % α-thioglycérol comme un réactif de clés. Les deux techniques d’exploiter les systèmes circulatoires systémiques et céphalo-rachidien endogènes pour réduire considérablement le temps nécessaire pour produire la clairance optique. Comme une preuve de principe, nous montrent l’utilisation de la microscopie confocale à analyser les tendances des vaisseaux sanguins dans les tissus dégagé10.

<table><tbody><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Solution d’éclaircissement</td></tr>, <tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>solution nRIMS</td></tr><tr>,<td>solution d’acrylamide à 40 %,</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymérisation (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&acute ;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dichlorhydrate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymérisation (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Solution d’élimination (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>solution nRIMS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno-coloration</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immuno Coloration</td></tr><tr><td>héparine</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>PECAM-CD31</td><td>anticorps Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td></td></tr><tr><td>Conjugué fluorescent anti-IgG Cy3 de chèvre anti-lapin-IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immunocoloration</td></tr> 4<tr><td> % Paraformaldéhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, polymérisation</td></tr><tr><td>20X Saline tamponnée au phosphate (pH 7,4)</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Tampon</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Transfert de solution</td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Tube de clarification</td></tr><tr><td>35 mm Boîte de culture cellulaire</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imagerie</td></tr><tr><td>Boîte confocale</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imagerie</td></tr><tr><td>1 mL seringue</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anesthésier&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue de 50 mL</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymérisation (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM papier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Papier buvard pour l’élimination du gel</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imagerie</td></tr><tr><td>ZEN lite Logiciel</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imagerie</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Système d’hybridation de gel tissulaire</td></tr></tbody></table>

roman passif méthodes de compensation pour la production rapide de transparence optique dans tout le tissu cns

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Depuis la mise au point de clarté, une bioelectrochemical technique de compensation qui permet pour la cartographie en trois dimensions de phénotype au sein des tissus transparents, une multitude de méthodes de compensation roman notamment cubique (l’imagerie cérébrale claire et dégagée cocktails et analyse computationnelle), SWITCH (contrôle systémique du temps de l’interaction) et la cinétique des produits chimiques, carte (grossie analyse du protéome) et Pacte (technique de clarté passive), ont été établis afin d’accroître la boîte à outils existant pour l’analyse microscopique des tissus biologiques. La présente étude vise à améliorer et optimiser la procédure initiale de Pacte pour une gamme de tissus de rongeurs intacts, y compris l’ensemble du système nerveux central (CNS), les reins, rate et des embryons de souris tout. Appelé psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), ces nouvelles techniques fournissent des moyens très efficaces de cartographie des circuits de cellules et la visualisation des structures subcellulaires dans les tissus normaux et pathologiques intacts. Dans le protocole suivant, nous fournissons un aperçu détaillé, étape par étape sur comment réaliser le dégagement maximal tissu avec atteinte minimale à leur intégrité structurale via psPACT et mPACT.

Génération d’un modèle transparent de la CNS tout en utilisant des techniques de compensation passive optimisée
Optique apurement des souris et le rat des tissus de CNS entiers a été réalisée rapidement en utilisant diverses techniques de compensation passive (Figure 1). Un schéma du tissu de compensation au fil du temps est illustré dans la Figure 2 a....

Nous présentons ici deux nouvelles méthodes, psPACT et mPACT, pour réaliser la transparence optique maximale et l’analyse microscopique ultérieure de la vascularisation des tissus chez le rongeur intact entier CNS.

Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

L’objectif global de ces méthodes psPACT et mPACT est l’élimination rapide de l’ensemble du tissu du SNC sans avoir besoin d’un système d’élimination électrophorétique des tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des modèles de recherche sur les maladies humaines, telles que la maladie d’Alzheimer ou les blessures, la dégénérescence et la tumorigenèse. Le principal avantage de cette technique est que le tissu du SNC de la souris n’est pas endommagé par le nettoyage électrophorétique du tissu, et qu’il est rapidement éliminé par le nettoyage passif modifié.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir utilisé le PACT original et la méthode précédente pour le nettoyage du cerveau. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les méthodes psPACT et mPACT sont difficiles à exécuter car cette méthode comporte plusieurs étapes de préparation de l’échantillon. Commencez par préparer la solution cocktail PACT en ajoutant la poudre VA-044 à une solution de 4 % de PFA et 4 % d’acrylamide à une concentration finale de 0,25 %. Après avoir perfusé les tissus avec la solution de PACT, immergez complètement le cerveau et la moelle épinière dans un tube de 50 millilitres contenant une solution de PACT réfrigérée, et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.24 heures plus tard, transférez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant une solution PACT fraîche et froide, et connectez le capuchon du tube à un système d’hybridation de gel tissulaire, connecté à un réservoir d’azote et réglé à 37 degrés Celsius. Ensuite, allumez le vide et le gaz pendant 10 minutes pour intégrer l’échantillon dans de l’azote gazeux. Pour polymériser l’hydrogel, placez le tube contenant l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant trois heures ou jusqu’à ce que la polymérisation soit terminée.Après l’incubation, utilisez du papier buvard pour enlever l’hydrogel polymérisé restant entourant les tissus. Ensuite, transférez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant une solution éclaircissante. Placez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé.En moyenne, il faut environ 20 jours pour que le SNC de la souris atteigne une clarté complète. Commencer psPACT avec le SNC d’une souris perfusée avec 4 % de PFA qui a été post-fixée dans 4 % de PFA à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Lavez le tissu fixé pendant une heure dans du PBS 0,1 molaire.Après le lavage, transférez le tissu dans la solution A4P0 et incubez à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, après avoir lavé le mouchoir dans du PBS pendant cinq minutes, immergez-le dans du VA-044 à 0,25 % dans du PBS et incubez à 37 degrés Celsius pendant six à 24 heures. La séparation de l’acrylamide et de l’étape VA-044 suivante évite d’avoir à éliminer les monomères d’hydrogel non polymérisés restants qui entourent le tissu, ce qui peut compromettre l’intégrité finale du tissu après avoir obtenu la transparence avec PACT.Après l’incubation, transférez les tissus dans une solution fraîche et froide de VA-044. Ensuite, incorporez l’échantillon dans de l’azote gazeux pendant 10 minutes. Transférez le tissu dans une solution éclaircissante.Ensuite, incubez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé. En moyenne, il faut environ 17 jours pour que le SNC de la souris atteigne une clarté complète. Pour mPACT, suivez le protocole pour psPACT jusqu’à l’étape de clarification de la solution.Ensuite, immergez complètement la solution de clarification tissulaire contenant 0,5 % d’alpha-thioglycérol, un agent débrunissant, en plus de 8 % de SDS dans 0,1 molaire de PBS. Placez l’échantillon dans un incubateur à agitation réglé à 37 degrés Celsius et 150 tr/min jusqu’à ce que le tissu soit dégagé. En moyenne, il ne faut que deux semaines au SNC de la souris pour obtenir une clarté complète à l’aide de mPACT.Dans la présente étude, les échantillons de cerveau de souris traités via le protocole mPACT ont atteint une transparence optique après 14 jours, avant les échantillons traités via les protocoles PACT et psPACT. Les échantillons de SNC entiers de rats éliminés par mPACT ont atteint leur clairance maximale en 20 jours. Les cerveaux de rats adultes seuls, par opposition à l’ensemble du SNC, ont été éliminés avec mPACT en seulement cinq jours.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines avec le SNC entier de la souris si elle est réalisée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences et de l’anatomie pour explorer les maladies physiopathologiques, telles que les lésions tissulaires, les malformations du développement, le cancer et les maladies neurodégénératives dans des modèles de SNC de mammifères.

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Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

Les techniques de clarification optique révolutionnent la façon dont les tissus sont visualisés. Dans ce rapport, nous décrivons les modifications apportées au protocole CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) qui donne des résultats plus cohérents et moins coûteux.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

ACT-PRESTO (clarté technique pression actif transfert efficace et stable liée de macromolécules dans les organes) permet la compensation rapide des tissus, efficace, mais peu coûteux et à la pénétration rapide des anticorps dans les tissus compensés par diffusion passive ou accouchement assisté à la pression. En utilisant ce procédé, une large gamme de tissus peut être effacé, immunomarquées par des anticorps multiples et le volume imagé.

ACT-PRESTO: Dégagement de tissus biologiques et méthodes immunomarquage pour Volume Imaging

La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

La morphologie dendritique neuronale sous-tend souvent la fonction. En effet, de nombreux processus pathologiques qui affectent le développement des neurones se manifestent par un phénotype morphologique. Ce protocole décrit une méthode simple et puissante pour analyser les tonnelles dendritiques intactes et leurs épines associées.

Imagerie et quantification de dendrites neuronales intactes via CLARITY Tissue Clearing

Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.

Une méthode de nettoyage des tissus pour l’imagerie neuronale des échelles mésoscopiques aux échelles microscopiques

Les sphéroïdes tumoraux sont de plus en plus utilisés pour évaluer les interactions cellule tumorale-microenvironnement et la réponse thérapeutique. Le présent protocole décrit une méthode robuste mais simple pour l’imagerie à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux 3D en utilisant un nettoyage optique rapide.

Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - H 2O2 - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.

Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle

Ce protocole combine la clarification optique et l’immunomarquage pour l’imagerie confocale à volume complet d’organoïdes rétiniens entiers. Il préserve la structure 3D, permettant une visualisation détaillée des principales voies neuronales, améliorant l’étude de la maturation rétinienne, l’organisation spatiale et ses applications potentielles dans la modélisation des maladies et la médecine personnalisée.

Visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire

Les techniques de clarification optique, telles que l’absorption de solutions de molécules, réduisent temporairement la diffusion de la lumière pour améliorer l’imagerie biologique et offrir des stratégies d’imagerie in vivo biocompatibles et réversibles pour les organes profondément intégrés. Ce protocole présente des procédures expérimentales détaillées ainsi qu’un traitement d’image avancé pour obtenir une imagerie dynamique de haute qualité pour la dynamique en temps réel chez les animaux...

Clairance optique transitoire à l’aide de molécules absorbantes pour l’imagerie ex vivo et in vivo

Découvrez les méthodes psPACT et mPACT pour la clarification rapide du système nerveux central entier chez la souris et le rat. Ces protocoles permettent une analyse microscopique détaillée sans dommage électrophorétique.

Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS

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