Bouillon Microdilution In Vitro Screening : une méthode simple et rapide pour détecter les nouveaux composés antifongiques

L’objectif global de cette méthode est d’évaluer l’activité de composés antifongiques potentiels, en utilisant une modification du test de sensibilité à la microdilution en bouillon, utilisé dans les laboratoires cliniques. Cette méthode est utilisée pour évaluer l’activité fongique de composés naturels ou synthétiques, l’un des premiers tests dans le développement de thérapies antifongiques. Nous fournissons des instructions pour un premier dépistage de nouveaux antifongiques utilisant de petits volumes dans un court laps de temps, en particulier si les expériences sont réalisées avec automatisation.

La démonstration de la procédure sera assurée par Daniel Zamith-Miranda, post-doctorant dans mon laboratoire. Commencez cette procédure en cultivant les souches fongiques pour l’essai comme décrit dans le protocole textuel. Le lendemain, récupérez les cellules en centrifugeant les tubes coniques à 1200 G, pendant cinq minutes à température ambiante.

Jetez le surnageant, ajoutez dix millilitres de PBS dans chaque tube et remettez les cellules en suspension. Centrifugez à nouveau à 1200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez le lavage et la centrifugation PBS deux fois de plus.

Après le troisième lavage, remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu RPMI 1640 à double concentration. En fonction de la turbidité de la suspension cellulaire, préparer un millilitre d’une dilution de un à 100 ou d’un à 1000 de chaque souche dans un tube de microcentrifugation. Aliquat dix microlitres de cette dilution, placez-le dans une chambre d’hémocytomètre et comptez au microscope le nombre total de cellules dans les quatre quadrants d’angle.

Après avoir calculé la densité de chaque suspension de cellules, préparez les suspensions de cellules mères dans un milieu RPMI 1640 à double concentration. Préparez 4 000 cellules par millilitre pour les souches de C. albicans et 20 000 cellules par millilitre pour les souches de C. neoformans. Les peptides lypholisés sont stockés dans des aliquats pour une utilisation unique à moins 20 degrés Celsius, et ne sont dissous dans de l’eau désionisée qu’avant chaque expérience.

La concentration peptidique doit être le double de la concentration finale la plus élevée testée dans l’essai. Des antifongiques de référence sont également préparés. Le dosage antifongique est effectué en trois exemplaires et en microplaques de polystyrène à 96 puits.

En utilisant une dilution en série en deux fois de chaque peptide et antifongique de contrôle, et un volume final de 50 microlitres par puits. L’étape la plus cruciale du protocole est les dilutions en série, soyez donc très prudent lors des prochaines étapes pour éviter toute erreur qui compromettrait l’ensemble de votre analyse. À l’aide d’une pipette, ajoutez 100 microlitres de peptide antifongique à la concentration double de la concentration finale la plus élevée souhaitée dans les colonnes un à trois de la rangée A.À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres d’eau stérile dans les autres puits des rangées B à H.Retirez 50 microlitres des puits avec la concentration la plus élevée.

Transférez dans les puits correspondants de la concentration suivante et homogénéisez en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Répétez la dilution en série jusqu’à ce que les puits avec la concentration la plus faible soient atteints, et jetez 50 microlitres de ces puits. Laissez les colonnes 11 et 12 des rangées A, B et C avec seulement de l’eau pour les témoins à blanc ou les témoins à croissance négative.

Ajouter 50 microlitres de l’inoculum ajusté à double concentration dans le milieu RPMI 1640 à chaque puits des colonnes un à trois, plus la colonne 11. La concentration finale pour C. albicans sera de 2 000 cellules par millilitre. La concentration finale de C. neoformans sera de 10 000 cellules par millilitre.

Préparez des contrôles de croissance négatifs en mélangeant 50 microlitres d’eau et 50 microlitres d’inoculum ajusté sans l’antifongique. Préparez des contrôles à blanc en combinant 50 microlitres d’eau et 50 microlitres de milieu sans cellules. Chargez les commandes dans les puits appropriés.

Observez tous les puits à l’aide d’un microscope optique inversé, puis incubez les plaques à 37 degrés avec agitation à 200 tr/min. Après la période d’incubation, observez à nouveau tous les puits pour vérifier les changements de morphologie, ainsi que pour vérifier les signes de contamination. Acquérez une image de chaque plaque à l’aide d’un appareil photo numérique.

Dans cet essai représentatif, trois peptides antimicrobiens, ou AMP, avec des concentrations allant de 100 micromolaires à sept huit micromolaires, ont été évalués pour leur activité antifongique contre C. neoformans. Un témoin de croissance et un blanc ont été inclus. Tout puits avec un milieu clair similaire aux puits blancs est considéré comme un résultat positif, tandis que tout puits avec une turbidité analogue aux puits de contrôle de croissance négative est considéré comme négatif.

Étant donné que la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, est définie comme la concentration minimale de composés antimicrobiens qui inhibe complètement la croissance fongique visible à la fin de la période d’incubation, 25 micromolaires sont considérées comme la CMI pour l’AMP1. Et, 12 virgule cinq micromolaires, la CMI pour AMP2. L’AMP3 devra être réévalué, car le champignon s’est développé à toutes les concentrations testées.

De la même manière, trois peptides distincts testés contre C. albicans, inculpés de 50 micromolaires est le CMI pour AMP1. Six micromolaires est la CMI d’AMP2 et 25 micromolaires est la CMI d’AMP3. Un exemple de mauvais résultat, probablement dû à un pipetage inadéquat pendant l’étape de dilution, est illustré par les colonnes cinq à sept de la rangée C de cette plaque, où des différences de croissance de C. neoformans sont présentes entre les répétitions.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures, plus le temps de croissance fongique, si elle est exécutée correctement. N’oubliez pas d’être conscient des caractéristiques physico-chimiques de ces molécules testées. Ensuite, utilisez des solvants appropriés comme contrôle au cas où ils seraient nécessaires, et utilisez toujours les cellules dans la même phase de croissance.

Après cette procédure, d’autres méthodes pourraient être effectuées, telles que le test de destruction temporelle, l’utilisation de colorants de viabilité et les tests ST60 pour répondre à des questions supplémentaires, comme si le composé a un effet fongicide ou fungistatique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la micrologie médicale pour explorer plusieurs sources de composés naturels ou synthétiques à la recherche de composés antifongiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de démarrer une culture fongique, de préparer les cellules pour le test, d’effectuer les dilutions en série et de lire les résultats après avoir incubé les souches fongiques avec nos composés testés.

N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes fongiques peut être extrêmement dangereux. Et une préparation telle que le port d’un équipement de protection individuelle, le travail à l’intérieur d’une cagoule de sécurité biologique et l’utilisation de pratiques de sécurité appropriées doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.