Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer et d’exploiter un dispositif microfluidique pour la collecte de données de diffraction des rayons X par cristallisation des protéines à température ambiante. Le principal avantage de cette technique est que la cristallisation à l’intérieur de la puce minimise la perturbation mécanique des cristaux de protéines. Ces puces transparentes aux rayons X sont faciles à produire, peuvent être montées directement sur les goniomètres de la plupart des lignes de faisceau synchrotron et permettent d’utiliser efficacement les cristaux disponibles lors de la collecte de données de diffraction des rayons X.

Tout d’abord, placez un moule maître de la conception de la puce à rayons X dans une boîte de Pétri de 10 centimètres recouverte de papier d’aluminium. Mélangez environ 30 grammes au total de base et d’agent de durcissement PDMS dans un rapport de 10 pour un, et versez le PDMS sur le master à une hauteur de quatre millimètres. Dégazez le PDMS dans un dessiccateur sous vide pendant cinq minutes et soufflez de l’air pour éliminer les bulles d’air restantes à la surface du PDMS.

Faites durcir le PDMS dans un four à 70 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, décollez délicatement le moule PDMS durci du maître. Utilisez un scalpel pour couper l’excès de PDMS.

Avant la fabrication de la puce à rayons X, assurez-vous que l’espace de travail est aménagé de manière à permettre un accès facile à tous les équipements et composants nécessaires pendant la coulée de moules époxy. Pour commencer la fabrication de la puce, diluez les précurseurs d’une résine époxy à deux composants avec de l’éthanol jusqu’à une concentration massique finale d’éthanol de 40 % en poids. À l’aide d’un mélangeur vortex, mélangez de la résine époxy et de l’éthanol.

Dégazez le moule PDMS dans un dessiccateur sous vide pendant 30 minutes pour vous assurer que le PDMS peut ensuite absorber les petites bulles d’air de la résine époxy. Découpez un morceau de feuille de polyimide de 70 millimètres sur 70 millimètres d’épaisseur et enroulez-le autour d’une lame de verre de 75 millimètres sur 50 millimètres. Collez les bords de la feuille à l’arrière de la glissière pour former une surface plane et rigide en polyimide.

Traitez la feuille de polyimide à dos coulissant avec du plasma d’oxygène pendant 20 secondes. Ensuite, incubez la feuille dans une solution aqueuse à 1 % en volume d’APTS ou de GPTS pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Pendant la silanisation, mélangez soigneusement les solutions de précurseurs de résine époxy à l’aide d’une petite spatule.

Transférez le moule PDMS dégazé du dessiccateur sous vide sur une surface plane. Séchez la feuille de polyimide silanisé avec de l’air sous pression ou de l’azote gazeux. Appliquez rapidement une gouttelette du mélange de résine sur chaque microstructure du moule.

Placez la feuille de polyimide à dos glissant face vers le bas sur la résine époxy et appuyez fermement sur la glissière. Recouvrez l’ensemble d’une feuille de plastique et d’une feuille de métal. Placez des poids sur la tôle pour appliquer une pression allant jusqu’à 1,4 newton par centimètre carré à l’assemblage.

Après 15 minutes, séparez délicatement la lame de verre de la feuille de polyimide à motif époxy et essuyez la feuille de polyimide jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Remettez le papier d’aluminium, la feuille de métal et les poids sur le dessus. Laissez l’époxy durcir à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, retirez les poids, la tôle et la feuille de plastique. Décollez délicatement la feuille de polyimide à motifs du moule PDMS. Traitez la feuille à motifs au plasma pendant 20 secondes et silanisez la feuille à motifs avec APTS ou GPTS, comme décrit précédemment.

Silaniser une feuille de polyimide vierge avec l’autre solution de silane dans les mêmes conditions. Séchez les deux feuilles avec de l’air sous pression. Ensuite, appliquez une goutte d’eau déminéralisée sur une surface propre, sèche et plane.

Découpez des structures de copeaux individuelles sur une feuille de polyimide et placez la feuille de polyimide à motifs côté époxyde vers le haut sur la goutte d’eau, puis lissez soigneusement la feuille jusqu’à ce qu’elle soit complètement plate. Placez la deuxième feuille de polyimide sur la feuille à motifs avec la face silanisée vers le bas. Lissez doucement à la main la deuxième feuille d’un coin à l’autre pour expulser les bulles d’air et coller les feuilles de polyimide ensemble.

Pour commencer à fabriquer les ports d’accès, il suffit de découper dans une dalle PDMS durcie de quatre millimètres un bloc de taille suffisante pour couvrir tous les ports de la puce à rayons X en polyimide sans couvrir le compartiment de cristallisation. Traiter au plasma, silaniser et sécher la puce de polyimide et le bloc PDMS. Appuyez sur le bloc traité sur la puce au-dessus des ports.

Couvrez la puce avec une feuille de plastique, une lame de verre propre et une feuille de métal. Appliquez une pression de 1,4 newton par centimètre carré pendant une heure. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie de 0,75 millimètre pour percer les trous d’entrée et de sortie là où ils sont marqués dans la conception de la puce.

Scellez l’arrière de la puce avec du ruban isolant électrique en film polyimide. Ensuite, diluez une solution mère à 9 % en poids de matériau de revêtement fluoropolymère transparent à 0,45 % en poids avec un solvant fluoré. Connectez une aiguille de calibre 27 de 5/8 de pouce à la seringue.

Ajustez le tube en polytétrafluoroéthylène sur l’extrémité de l’aiguille. Chargez la solution de fluoropolymère dans une seringue Luer lock d’un millilitre. Connectez l’autre extrémité du tube à la sortie de la puce à rayons X.

Injectez la solution de fluoropolymère dans la puce jusqu’à ce que tous les canaux soient remplis, et éliminez l’excès de solution de fluoropolymère à l’aide d’une seringue remplie d’air. Placez la puce remplie avec le côté plat vers le bas sur une plaque chauffante à 190 degrés Celsius. Chauffez la puce pendant cinq minutes pour faire évaporer le solvant, recouvrant ainsi les canaux avec le fluoropolymère.

Avant la procédure de cristallisation, filtrez la solution protéique choisie avec un filtre de 0,2 micron. Centrifuger la solution pendant 15 minutes à 16, 100 fois g et 20 degrés Celsius, et récupérer le surnageant pour les expériences de cristallisation. Pour commencer la procédure de cristallisation, combinez des volumes égaux d’une solution protéique et de son précipitant.

Prélevez environ 20 microlitres de ce mélange dans une seringue. Utilisez une aiguille de calibre 27 de 5/8 de pouce et un tube en PTFE pour connecter la seringue à l’entrée de la puce à rayons X. Connectez une seringue d’huile fluorée à la sortie de la même manière.

Tout en surveillant la puce au microscope, remplissez la solution de cristallisation par l’entrée dans la puce avec la disposition parallèle. Injectez suffisamment d’huile fluorée pour séparer les compartiments de cristallisation dans la puce. Ensuite, bloquez les orifices d’entrée et de sortie avec des trombones ou d’autres bouchons étroits.

Stockez la puce dans les conditions de cristallisation appropriées. La formation cristalline peut maintenant être observée au microscope ou par des mesures de diffusion dynamique de la lumière. Lorsque vous êtes prêt pour la collecte de données, utilisez du ruban adhésif double face pour fixer la puce à rayons X à un adaptateur imprimé en 3D pour le goniomètre à plaques.

Montez l’adaptateur de puce sur le goniomètre à plaque au niveau de la ligne de faisceau synchrotron. Collecter et analyser les données de diffraction. La microscopie à champ clair a été utilisée pour quantifier le taux d’évaporation de l’eau des chambres de cristallisation de la puce de feuille de polyimide.

La diffusion dynamique de la lumière a pu détecter la nucléation initiale des cristaux de thaumatine dans une puce PDMS sur une lame de verre de géométrie équivalente, ce qui a permis d’optimiser les conditions de cristallisation. 10 motifs de diffraction ont été collectés à partir de chacun des 83 cristaux de thaumatine cultivés dans une puce de polyimide avec une rotation d’un degré pendant chaque image. L’ensemble de données a été divisé en cinq sous-ensembles de données par trame, et la décroissance de l’intensité de la puissance de diffraction normalisée au fil du temps a ensuite été évaluée.

Au quatrième ensemble de données, la puissance de diffraction avait diminué à moins de 50 %Les valeurs du facteur R de mesure des sous-ensembles de données ont augmenté au fil du temps, indiquant que les cristaux ont subi des dommages causés par le rayonnement pendant la collecte des données. Cela a été attribué aux radicaux libres générés lors de l’exposition aux rayons X, dégradant les cristaux voisins dans le même compartiment. Les cristaux bipyramidaux de thaumatine avaient une large distribution d’orientations dans la puce à rayons X.

Les cristaux de glucose isomérase orthorhombique ont également montré une large distribution d’orientations lorsqu’ils étaient cultivés dans une puce de polyimide. Cependant, les cristaux de thiorédoxine avaient principalement des orientations dans les plans xy, xz et yz, potentiellement en raison de leur forme allongée. En général, ces puces sont très robustes et ont un faible bruit de fond en rayons X.

Cette méthode de fabrication convient donc à d’autres techniques d’imagerie par rayons X, telles que la diffusion des rayons X aux petits angles. Cette procédure peut être facilement adaptée à vos besoins expérimentaux. Par exemple, la conception de la puce peut être modifiée en ajustant les dimensions des compartiments individuels ou le nombre total de compartiments par puce.

Nous nous sommes particulièrement concentrés sur la conception d’un flux de travail qui ne nécessite pas d’équipements coûteux, tels que des outils spécialisés ou des pompes microfluidiques. Après avoir regardé cette vidéo et lu le manuscrit, vous devriez avoir une bonne compréhension de la cristallisation dans la puce, de la surveillance du processus de cristallisation et de l’enregistrement et de l’analyse des données de diffraction en utilisant l’approche de la puce. Une fois maîtrisée, cette technique permet de fabriquer par lots des puces microfluidiques à partir d’un master PDMS en trois heures environ sans nécessiter une salle blanche dédiée.