Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer les niveaux d’endoréduplication dans les tubercules de pomme de terre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la morphologie des tubercules de pomme de terre, telles que le stade de développement au cours duquel les tissus des tubercules subissent une endoréduplication. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des résultats beaucoup plus clairs par rapport aux préparations typiques de cytométrie en flux.

Parker Laimbeer fera la démonstration de la procédure. Un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après avoir préparé les solutions et les tampons conformément au protocole textuel, stérilisez en surface les tubercules de pomme de terre en les immergeant dans de l’éthanol à 71 % pendant au moins cinq minutes.

Retirez les matières végétales de l’éthanol et laissez-les sécher à l’air. Préparez et étiquetez des tubes coniques stériles de 50 millilitres pour chaque échantillon et aliquotez-y 15 millilitres de solution d’incubation de plasmolyse stérilisée avec filtre, ou PIS, dans chacun. À l’aide d’un scalpel stérilisé ou d’un liège, on a sondé un échantillon d’environ un centimètre cube du désir de stériliser les tissus.

À l’aide du scalpel de stérilisation, coupez grossièrement le tissu en morceaux d’environ trois millimètres cubes. Et transférez le tissu dans un tube conique contenant du PIS. Ensuite, incubez le tissu à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Pour générer des protoplastes de pomme de terre, commencez par préparer et filtrer une quantité appropriée de solution enzymatique ou ES avec 0,71 molaire de mannitol, trois millimolaires de chlorure de calcium, un millimolaire de phosphate monopotassique. Un millimolaire de chlorure de magnésium, 4 % de cellulase Onozuka R-10, 0,8 % de macérozyme R-10, 1 % d’hemi cellulase et 10 millimolaires de tampon MES, pH 5,8. À l’aide d’une pipette sérologique, aspirer le PIS des échantillons dans les tubes.

Ajoutez 10 millilitres de ES à chaque échantillon et retournez les tubes deux à trois fois. Ensuite, incubez les échantillons à 29 % Celsius et 180 tr/min pendant la nuit. Le troisième jour, pour récolter et laver les protoplastes, retirez les échantillons de l’agitateur et laissez-les reposer pendant environ 10 minutes.

À l’aide d’une pipette sérologique, aspirez la plus grande partie possible de la solution ES, en prenant soin d’éviter les tissus digérés. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette et tout en tenant le tube en biais, retirez à nouveau toute solution ES restante en évitant le tissu digéré. Il est essentiel d’éliminer autant que possible la solution de lavage des protoplastes pour éviter d’endommager les noyaux.

Tenir le tube à un angle peut aider à l’élimination de la solution tout en laissant les protoplastes. Ajoutez 15 millilitres de PWS à chaque échantillon. Et retournez doucement le tube deux à trois fois.

Laissez les protoplastes se déposer pendant 10 minutes. Utilisez ensuite une pipette sérologique pour retirer le PWS. Et une micro pipette pour retirer le liquide restant.

Tout en gardant les échantillons sur de la glace, ajoutez 1,5 millilitre de FCB glacé dans chaque tube. Secouez brièvement ou agitez chaque échantillon pour briser les tissus agrégés. Il est important de briser les amas de tissu du tubercule afin que le FCB puisse pénétrer complètement dans les cellules et libérer les noyaux.

Si un témoin doit être ajouté, à partir de cette étape, utilisez une lame de rasoir pour hacher finement une petite feuille dans 1,5 millilitre de FCB glacé. Les échantillons de contrôle doivent avoir la même ploité que les échantillons expérimentaux, de préférence le même génotype. Insérez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec l’embout coupé et un treillis métallique de 106 micromètres fondu au fond dans un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres.

Passez ensuite un millilitre de suspension tissulaire FCB à travers le filtre. Ajoutez 250 microlitres de solution d’ARN à chaque échantillon. Ensuite, retournez les tubes et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante.

Ajoutez 125 microlitres d’iodure de propidium ou de solution de PI préalablement préparée à chaque échantillon. Retournez et incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Utilisez les échantillons dès que possible et dans les deux heures pour éviter la dégradation.

Créez deux diagrammes à points à l’aide de l’échelle logarithmique de la diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale et de l’IP par rapport à la diffusion latérale. Créez également un histogramme avec PI sur l’axe des x. Une échelle logarithmique est nécessaire pour s’assurer que tous les événements sont à l’échelle, car les noyaux peuvent différer considérablement en fluorescence.

Chargez un tube d’un échantillon de contrôle connu, tel qu’un tissu foliaire in vitro, à partir d’un génotype d’échantillon. Et ajustez la tension pour que tous les événements soient à l’échelle. Notez le canal du pic 2C dans l’échantillon de contrôle.

Les pics 2C des échantillons expérimentaux doivent se situer au même endroit. Chargez un échantillon de tubercule expérimental et assurez-vous à nouveau que tous les événements sont à l’échelle. Si des ajustements sont nécessaires, répétez le réglage de la tension de l’échantillon de contrôle pour identifier le canal des crêtes 2C.

Gate manuellement les noyaux de protoplastes à l’aide du graphique de diffusion latérale en fonction de PI. Réglez ensuite l’histogramme PI pour qu’il n’affiche que la région des noyaux de protoplaste contrôlée. Collectez le nombre d’événements souhaité à partir de chaque échantillon.

Les chercheurs utilisent fréquemment 10 000 événements déclenchés pour la cytométrie en flux. Cependant, les événements 2000 sont utilisés ici pour les échantillons de protoplastes de tubercules afin d’accueillir plus d’échantillons et d’échantillons à faible concentration. La génération de protoplastes est nécessaire pour obtenir des résultats de cytométrie en flux reproductibles à partir de tubercules de pomme de terre.

La morphologie générale est affichée ici. La séparation entre le parenchyme moelleux et le parenchyme périmédullaire est illustrée par des lignes noires. L’anneau vasculaire, qui sépare le parenchyme du cortex, est indiqué par une flèche noire.

Les protoplastes isolés doivent être sphériques et symétriques avec la membrane plasmique intacte. Notez la différence de taille entre les protoplastes des feuilles et des tubercules, ainsi que les différences de taille à l’intérieur d’un tissu, ce qui peut indiquer différents niveaux d’endoréduplication. Cette figure montre la variation des résultats qui peut être rencontrée à la fois dans les nuages de points et les histogrammes de cytométrie en flux.

Les noyaux intacts montrent une séparation nette entre les pics pour quantifier l’abondance relative des cellules, tandis que les échantillons intégrés de pics montrent des bases larges et décalées et chevauchantes. Dans les nuages de points correspondants, les cases noires indiquent le déclenchement des événements nucléaires pour les histogrammes, et le regroupement des événements est reflété dans la largeur des pics de l’histogramme. Cette expérience analysant les niveaux d’endoréduplication ou EI confirme les résultats précédents selon lesquels le tissu de la moelle présente une EI plus élevée que le tissu du cortex.

Étonnamment, le profil du tissu du parenchyme était similaire à celui du cortex et était également significativement différent du tissu de la moelle. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la stérilité de l’échantillon pour les deux premières incubations ainsi que de garder les échantillons sur de la glace autant que possible après que les protoplastes ont été lysés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la manipulation génétique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels gènes influencent les niveaux d’endoréduplication des tubercules.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les protoplastes des tubercules de pomme de terre et de les préparer pour la cytométrie en flux afin d’étudier leurs niveaux d’endoréduplication. N’oubliez pas que travailler avec de l’iodure de propidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’un EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.