Name: Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative de l'arborisation dendritique chez Drosophila pour étudier le développement neuronal et le gène SOX5. Cette méthode permet d'évaluer la morphogenèse dendritique et ses implications dans les maladies neurodégénératives.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier William A. Eimer pour l’assistance technique d’imagerie. Ce travail a été soutenu par fonds la Cure Alzheimer [à R.E.T], le National Institute of Health [R01AG014713 et R01MH60009 à R.E.T ; R03AR063271 et R15EB019704 à A.L.] et la National Science Foundation [NSF1455613 à A.L.].

1. préparation expérimentale
<ol><li>Préparer des réactifs suivants : phosphate de Dulbecco solution saline tamponnée (PBS) ; Triton X-100 ; 0,2 % PBST (PBS + 0,2 % Triton X-100) ; 32 % de paraformaldéhyde (PFA), dilué dans 4 % avant utilisation ; base d’élastomère de silicone et de salaison ; milieu de montage antifade (p. ex., prolonger or) ; et le vernis à ongle.</li>
	<li>Préparer le matériel suivant : microscope de dissection, deux tranchants forceps et une paire de ciseaux pour microdissection, un certain nombre de broches pour microdissection, une boîte de pétri pour faire le plat de dissection, les lames de microscope et les lamelles, un microscope confocal et un ordinateur avec ImageJ Fidji logiciel installé.</li>
</ol>2. Collection de larves
<ol><li>S’accouplent SAMU-Sox102F-Arni mouches avec SAMU-GFP, ppk-GAL4 ou W1118 mouches de type sauvage, respectivement. La culture vole dans des conditions standards à 25 ° C.</li>
	<li>~ 5-6 jours, recueillir le troisième stade larvaire de l’UAS-Sox102F-Arni / ppk-GAL4, SAMU-GFP ou SAMU-GFP et ppk-GAL4 / + contrôle soigneusement avec une pince de dissection.</li>
</ol>3. dissection des larves
Remarque : Toutes les procédures de cette section sont exploités sous un microscope de microdissection. Le grossissement est jusqu'à les enquêteurs. Essayer d’ajuster à l’affichage de la vue optimale. Grossissement X ~ 4-6 est recommandé.
<ol><li>Placez une larve sur un plat de dissection en élastomère de silicone base et une boîte de pétri de culture de tissus.</li>
	<li>Épingler le crochet de bouche de larve pour permettre à la face dorsale à relever, et ensuite épingler la queue de la larve. Placer la face dorsale du milieu autant que possible d’exposer la ligne médiane, qui sera le marqueur d’ouvrir.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de PBS à la larve de maintenir l’humidité du corps.</li>
	<li>Faites une coupe avec une paire de ciseaux le long de la ligne dorsale médiane entre les deux trachées, de caudale à rostrale. Faire une petite coupure à chacun des quatre coins du corps de la larve.</li>
	<li>Placez une épingle à chacun des quatre coins du corps afin que le corps repose à plat.</li>
	<li>Fixer la paroi du corps de la larve dans 4 % PFA pendant 25 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver dans du PBST pendant 5 min. de répéter deux fois plus.</li>
	<li>Enlever les tiges du tissu. Transférer ensuite le tissu sur une lame de verre, couvrir avec le milieu de montage antifade et monter avec une lamelle couvre-objet. Laisser sécher pendant 1 h et sceller les bords avec le vernis à ongle.</li>
</ol>4. traitement d’imagerie
Remarque : Les Images ont été prises en utilisant un système de microscope confocal inversé. L’utilisateur peut photographier l’échantillon à l’aide d’un objectif 20 X (recommandé).
<ol><li>Capturer des images de la série Z. Ouvrez la boîte de dialogue « Capture série Z » dans le logiciel de microscope confocal. Déterminer la fourchette pour capturer les images de série Z.<ol>
<li>Cliquez sur le bouton « Haut et bas ». Déterminer le haut et le bas du poste et entrez les valeurs à « bas : » et « Top : » boîtes. Définir le « étape » dans « Capture Z-série » la boîte de dialogue comme 0,5 µm. Puis cliquez sur le bouton « Exécuter maintenant » pour acquérir les images de la série Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrer les images obtenues sous forme de fichiers *.tiff ou *.nd2.</li>
	<li>Conservez les diapositives dans un support foncé à 4 ° C après l’imagerie.</li>
</ol>5. dendrite évaluation
Remarque : Protéine GFP a été co-surexprimé dans les SAMU-GFP et ppk-GAL4 vole dans les neurones dopaminergiques pour l’analyse d’imagerie de fluorescence GFP. La longueur, ramification et la structure des neurones dopaminergiques dans le troisième stade larvaire ont été quantifiées. Paramètres d’analyse comprennent la longueur des dendrites (µm), superficie (µm2), le nombre total de branches et de structure de ramification (%). La figure 1 montre les paramètres de l’analyse en détail.
<ol><li>
Longueur des Dendrites Remarque : La longueur des dendrites est la somme de tous les dendrites étiqueté à traceurs plugin.<ol>
<li>Le programme d’installation et lancez le logiciel20 Fidji ImageJ (https://fiji.sc/). Puis diviser images en canaux séparés, s’il y a plusieurs chaînes d’images. Remarque : L’image dans le présent protocole n’est un canal de GFP.</li>
		<li>Exécutez « Image | Piles | Projet de Z » pour obtenir une projection de Z ; une nouvelle fenêtre s’affiche avec le nom « Z-projection. » Cliquez sur « intensité max » pour le type de projection et d’organiser les nombres entre tranche de démarrage et arrêt de tranche en fonction sur les préférences individuelles. Cliquez sur « OK ». Une image de Z-projection s’affiche présentant la projection de dendrite clairement.</li>
		<li>Tracer les neurites.<ol>
<li>Sélectionnez « Plugins | Segmentation | Traceur de Neurites simple » dans la fenêtre de retracer les dendrites. Trouver le soma des neurones et puis cliquez sur un point à une dendrite à partir du corps cellulaire et un autre point à l’extrémité de cette dendrite. NOTE : Le programme se connectera les deux points avec une ligne bleue.</li>
			<li>Appuyez sur « Y » dans la fenêtre du plug-in si la voie est libre ; le chemin de la dendrite est tracé jusqu'à ce que les points de terminaison de la voie choisie dans les images visibles. Cliquez sur « chemin d’accès complet » sur la même fenêtre de plugin ; le segment est terminé (Figure 2). NOTE : Certaines dendrites clos le plus éloigné des points de départ, où la voie a été divisée en segments plus petits. Les segments ont été combinées pour fournir un chemin d’accès complet pour le traceur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Une fois terminé, un chemin de retour vers un nouveau point où les branches sont. Le nouveau chemin d’accès peut être construit la zone de fenêtre « Tous les chemins » affiche les valeurs de longueur de tous les chemins (Figure 3). Enregistrez le fichier de traçage et continuer avec traces inachevés, comme illustré à la Figure 2.</li>
		<li>Exporter les données de longueur de dendrite en cliquant, « fichier | Exporter en *.cvs » dans la fenêtre « Plugin ». Puis résumer toutes les longueurs de chemin et exporter les données vers un logiciel d’analyse/tableau de données. (Figure 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Superficie des neurones da
	<ol>
<li>Sélectionnez l’outil dessin à main levée dans la fenêtre « Fidji ImageJ ». Tracer le chemin et ensuite connecter les points de terminaison. Dans le menu « Analyser », sélectionnez « Set mesures | Domaine. » Cliquez sur « mesure » dans le menu « Analyser ». Le résultat s’affiche dans une nouvelle boîte avec la valeur de la zone sélectionnée (Figure 4). Copiez-le dans le logiciel d’analyse de données.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Total nombre de Branches et de Structure de ramification des neurones da
	<ol>
<li>Calculer le nombre total des branches en ouvrant « Analyse », puis « Render | Analyser les chemins Skeletonized » dans la fenêtre du plugin de traçage (Figure 5). Remarque : La structure de l’arbre est la somme des niveaux des branches. Le chemin d’accès a été défini entre le corps cellulaire et les conseils de dendrite et un chemin d’accès peut inclure plusieurs branches, tels que les axes principaux sont les dendrites du neurone corps cellulaire. Les axes secondaires sont des branches de la primaire et ainsi de suite avec les axes de tertiaire, quaternaire, quinaire et de. La structure de dendrite ramification est séparée selon les niveaux des branches. Par exemple, le % primaire est le nombre de branches divisées par le nombre total de ramification et ainsi de suite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les dendrites qui innervent l’épiderme sont les régions d’entrée des neurones et leurs morphologies déterminent comment est reçue et traitée par des neurones individuels. Morphologie dendritique développement reflète la modulation de gène d’organisation de dendrite. La drosophile da larvaire neurone du système nerveux périphérique est un modèle important pour étudier le développement de la dendrite en raison de : 1) la similitude fonctionnelle avec mammifères11,<sup class="xref...

Les dendrites, qui sont les projections ramifiées d’un neurone, couvrent le champ qui englobe sensoriel et synaptique apports le neurone des autres neurones1,2. Dendrites sont une composante importante de la formation des synapses et jouent un rôle essentiel dans l’intégration des entrées synaptiques, ainsi que la stimulation électrochimique dans un neurone de multiplication. Arborisation dendritique (da) est un processus par lequel les neurones forment de nouveaux arbres dendritiques et des branches pour créer de nouvelles synapses. Le développement et la morphologie des da, comme la densité de la branche et modes de regroupement, résultent de plusieurs étapes des processus biologiques et sont fortement corrélées à la fonction neuronale. Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’analyse quantitative de la complexité de ces dendritric neuronale dans Drosophila.
La complexité des dendrites détermine les types synaptiques, la connectivité et apports des neurones de la partenaire. Patrons de ramification et la densité des dendrites sont impliqués dans le traitement des signaux qui convergent sur le champ dendritiques3,4. Dendrites ont la souplesse d’adaptation en développement. Par exemple, signalisation synaptique influe sur l’organisation de la dendrite dans le neurone somatosensoriel pendant la phase de développement et dans le système nerveux mature5. L’établissement de la connectivité neuronale s’appuie sur la morphogenèse et de la maturation des dendrites. Malformation des dendrites est liée à l’altération de la fonction neuronale. Des études ont montré que l’anomalie de la morphogénèse du neurone da pourrait contribuer aux étiologies de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et la maladie de Gehrig / Sclérose latérale amyotrophique (SLA)6,7,8. Modifications synaptiques apparaissent dans les premiers stades de l’AD, de concert avec le déclin et l’altération de la fonction de neurone7,8. Toutefois, les détails de comment la pathologie dendrite contribue à la pathogenèse de ces maladies neurodégénératives reste insaisissable.
Le développement des dendrites est réglementé par les gènes qui codent pour un réseau complexe d’organismes de réglementation, comme la famille Wnt de ligands sur des récepteurs de surface cellulaire11,12, facteurs de transcription et protéines9,10 . Neurones dopaminergiques Drosophila consistent en quatre classes (classe I, II, III, IV), de quelle classe IV neurones dopaminergiques ont les patrons de ramification plus complexes et ont été employés comme un puissant système expérimental pour mieux comprendre la morphogenèse13, 14. Au cours de la morphogenèse au début, surexpression ou RNAi silencing des gènes dans les neurones dopaminergiques de classe IV provoquer des changements dans les patrons de ramification et dendrite élagage13. Il est important de développer une méthode pratique pour l’analyse quantitative de l’arborisation dendritique neuronale.
Nous avons déjà montré que faire taire des orthologues de drosophile de SOX5, Sox102F, a conduit à plus courts dendrites des neurones dopaminergiques et de complexité réduite en classe IV de neurones da15. Nous présentons ici la procédure d’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile. Ce protocole, adapté de la méthodologie décrite précédente, fournit une méthode brève pour analyser le développement des neurones sensoriels da. Elle illustre l’image robuste à l’étiquetage et le neurone de da dans le troisième stade larvaire paroi corporelle16,17,18,19. C’est un protocole précieux pour les chercheurs qui souhaitent étudier les NDAC et les différences de développement in vivo.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Base en élastomère de silicone et agent de durcissement</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516 ; 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles&nbsp ;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux&nbsp ;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes&nbsp ;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope Fisher</td><td>Scientific</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites sont les projections ramifiées d’un neurone et morphologie dendritique reflète une organisation synaptique au cours du développement du système nerveux. Drosophila larvaire arborisation dendritique neuronale (da) est un modèle idéal pour l’étude de la morphogénèse des dendrites neurales et la fonction des gènes dans le développement du système nerveux. Il existe quatre classes de neurones dopaminergiques. Classe IV est la plus complexe avec une ramification qui couvre presque toute la surface de la paroi corporelle larvaire. Précédemment, nous avons caractérisé l’effet de faire taire les orthologues de drosophile de SOX5 sur la classe de complexité d’arborisation dendritique neuronale IV (NDAC) à l’aide de quatre paramètres : la longueur des dendrites, la superficie de la couverture de la dendrite, le nombre total de branches et la structure de ramification. Ce protocole présente le flux de travail de l’analyse quantitative NDAC, composée de larve dissection, microscopie confocale et procédures d’analyse image à l’aide de logiciels ImageJ. Autre aperçu da développement neuronal et ses mécanismes sous-jacents améliorera la compréhension de la fonction neuronale et fournir des indices sur les causes fondamentales de neurologiques et de troubles du développement neurologique.

Les dendrites des neurones dopaminergiques ont été marquées par la co-surexprimant GFP (SAMU-GFP ; ppk-GAL4) dans le da soma neuronaux et les arbres dendritiques pour l’analyse d’imagerie de fluorescence GFP. La morphologie des dendrites des neurones da a été photographiée par un microscope confocal inversé (Figure 2).
Les dendrites des neurones dopaminergiques ont été tracés à l’aide de logiciels d...

Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’impact du gène SOX5 sur la complexité des neurones d’arborisation dendritiques pendant le développement neuronal à Drosophila. Cette méthode peut aider à étudier la morphogenèse des neuro-dendrites, et la fonction génétique dans le développement du système nerveux, pour mieux comprendre les gènes des maladies neurodégénératives. En fin de compte, cette technique fournit une analyse quantitative de la complexité des dendrites, qui peut être utilisé dans de nombreux types différents de neuro-dendrites.Les implications de cette technique s’étendent au mécanisme génétique de la maladie neurodégénérative, parce que la mutation détient la clé pour comprendre la fonction de gène. Croix de mise en place de UAS-GFP;ppk-GAL4 avec les mouches de souche UAS-Sox102F-RNAi ou contrôles W118. Culture des mouches dans des conditions standard à 25 degrés Celsius.En cinq à six jours environ, utilisez des forceps pour recueillir soigneusement les larves du troisième stade pour la dissection. Placez une larve dans un plat de dissection fait de base d’élastomer de silicium, et une boîte de Pétri de culture tissulaire. Ensuite, placez le plat sous le microscope de dissection.Maintenant épingler la queue de la larve pour exposer la ligne médiane. Puis épinglez les crochets de bouche de larve ainsi le côté dorsal de la larve est vers le haut. Maintenant, ajoutez 200 microlitres de PBS au plat pour immerger la larve dans la solution.Ensuite, coupez la queue et la bouche de larve avec de petites incisions. Puis couper la larve ouverte le long de la ligne médiane dorsale et entre les deux trachées, allant de caudal à rostral. Ensuite, placez une épingle à chacun des quatre coins du corps de sorte que le corps se trouve à plat.Maintenant fixer la paroi du corps de larve en quatre pour cent PFA pendant 25 minutes à température ambiante. Lavez ensuite la larve avec du PBS trois fois pendant cinq minutes par lavage. Après les lavages, retirer les broches et transférer le tissu sur une lame de verre.Puis immerger le tissu dans un milieu de montage antifade, et le monter avec un glissement de couverture. Laisser sécher le tissu monté pendant une heure avant de sceller sur le bordereau de couverture avec du vernis à ongles. Stockez ces diapositives dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.Capturez des images de la série Z à l’aide d’un microscope confocal à l’aide d’un objectif 20X. Tout d’abord, réglez la portée des z-steps pour inclure tous les neurones DA dans la paroi du corps de larve, et réglez la taille de l’étape à un demi-micromètre. Ensuite, stockez les images sous forme de fichiers TIF ou ND2 pour le traitement.Ensuite, évaluez le nombre et la morphologie des dendrites sur les neurones DA. Commencez par évaluer leurs longueurs. Tout d’abord, dans Fiji ImageJ, diviser les images en canaux distincts si nécessaire.Seul le canal GFP doit être évalué. Ensuite, faites une projection z. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez l’intensité maximale pour le type de projection, et choisissez les tranches de démarrage et d’arrêt.Cliquez ensuite sur OK pour produire une image de projection z avec des projections claires de dendrite. Maintenant, tracez les neurites à l’aide de l’outil plug-in. Tout d’abord, aller au soma du neurone d’intérêt et cliquez là où un dendrite émerge du corps cellulaire.Cliquez ensuite à la pointe de ce dendrite. Si la ligne bleue qui relie les deux points s’étend sur toute la longueur du neurite, appuyez sur Y pour oui. Ensuite, si cette ligne s’adapte à la trajectoire complète du neurite, cliquez sur le chemin complet.Si la ligne ne correspond pas au chemin, cliquez sur les points plus loin le long de ce neurite pour plier le chemin en plusieurs segments de ligne qui s’adapteront à la longueur du neurite. Ensuite, cliquez sur le chemin complet et procéder à marquer le chemin pour le prochain neurite. Après avoir complété tous les chemins de traçage, sélectionnez l’option Analyse, Chemins de mesure pour exporter les chemins vers un fichier CSV.Utilisez ces données pour calculer et la valeur moyenne des longueurs de chemin pour l’analyse. Ensuite, calculez la surface du neurone. Tout d’abord, sélectionnez l’outil de dessin à main libre de la fenêtre Fiji ImageJ.Ensuite, connectez les points finaux du neurone d’intérêt. Ensuite, sélectionnez l’option Mesure à partir de la fenêtre Analyser. Le résultat apparaît dans une nouvelle boîte avec la valeur de la zone sélectionnée.Copiez cette valeur au logiciel d’analyse de données. Enfin, calculez le nombre total de branches à l’aide du plugin Analyze Skeletonized Paths. Les dendrites des neurones DA ont été étiquetés par GFP co-surexprimant dans leurs tonnelles de soma et dendrite pour l’analyse d’imagerie de florescence de GFP.La morphologie des dendrites a été photographiée à l’aide d’un microscope confocal inversé. Les dendrites des neurones de DA ont été tracés comme décrit. Le fichier a été utilisé pour estimer la longueur du dendrite.Le silence de Sox102F dans les neurones DA dans la troisième larve instar a conduit à une réduction significative du nombre total de dendrites avec environ la moitié de la longueur de la branche et avec une structure plus simple, montrant seulement la moitié du nombre de branches. Logiquement, cela a conduit à une réduction de la surface des tonnelles. Ce protocole fournit une méthode rapide pour évaluer le développement des neurones sensoriels DA.Tout en essayant cette procédure, assurez-vous de prendre un grand nombre d’images de chaque groupe de neurones DA pour obtenir une bonne couverture. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse de dendrite peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions sur le développement de dendrite. Depuis son développement, cette technique a aidé des chercheurs dans le domaine des neurosciences à faire des inférences sur les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer à l’aide de systèmes modèles.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l'examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Les neurones sensoriels de l'arborisation dendritique...

Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques

Source : Ting, C., et al., Analyse de la morphologie dendritique en colonnes et en couches. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la procédure de préparation d’un cerveau de drosophile, de capture d’empilements d’images horizontales et frontales de dendrites médullaires marquées à la GFP sous un microscope confocal, et de création d’une reconstruction 3D pour analyser leur morphologie à travers les couches et les colonnes.

Analyse de la morphologie dendritique à travers les couches et les colonnes de la drosophile

Nous décrivons deux méthodes de visualisation et de quantification de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe de modèles murins : l’imagerie en temps réel et l’imagerie en profondeur de champ étendue. Alors que la première méthode permet un traçage topographique sophistiqué et une quantification de l’étendue de la ramification, la seconde permet une visualisation rapide de l’arbre dendritique.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.

Enlèvement de<em&gt; Drosophila</em&gt; Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

Deux algorithmes d'analyse d'images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Ici, nous montrons comment analyser dendritique routage des neurones médullaires drosophile dans des colonnes et des couches. Le flux de travail comprend une technique d'imagerie à double vue d'améliorer la qualité de l'image et des outils informatiques pour le traçage, l'enregistrement arborisation dendritique à la matrice de la colonne de référence et pour l'analyse des structures dendritiques dans l'espace 3D.

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

Nous présentons ici un protocole Golgi-Cox avec beaucoup de détails. Cette méthode de tache tissulaire fiable permet une évaluation de haute qualité de la cytoarchitecture dans l'hippocampe et dans tout le cerveau, avec un dépannage minimal.

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Découvrez l'analyse quantitative de l'arborisation dendritique chez Drosophila pour étudier le développement neuronal et le gène SOX5. Cette méthode permet d'évaluer la morphogenèse dendritique et ses implications dans les maladies neurodégénératives.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Explorer plus de vidéos