Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans notre compréhension de la régulation du génome, telles que la façon dont les variantes de séquence associées à la maladie dans des régions non codantes affectent l’expression et la régulation des gènes en modifiant la liaison aux protéines, et elle peut aider à identifier ces protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucune sorte de manipulation génétique des cellules ou des tissus, ni des anticorps, ni aucune connaissance préalable des protéines de liaison à l’ADN qui pourraient interagir avec l’ADN à ce locus. La démonstration de cette procédure sera faite par Danu Perumalla, un technicien de mon laboratoire.

Après avoir conçu des oligonucléotides selon le protocole de texte, placez 2 à 5 fois 10 à la 5e cellules lymphoblastoïdes, ou d’autres lignées cellulaires, dans un ballon T25 avec 6 millilitres de milieu RPMI 1640, complété par 1 % de Pen Strep, 2 mil ou plus de L-glutamine et 5 % de FBS. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé pour mesurer la densité cellulaire.

Avant que les cellules n’atteignent 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre, faites-les tourner à 100 fois G pendant cinq minutes et transférez-les dans une fiole T75 avec 25 millilitres du milieu RPMI 1640 préparé plus tôt dans cette vidéo. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité cellulaire de 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre, puis transférez les cellules dans une fiole T150 dans 38 millilitres du même milieu, et cultivez-les pendant deux jours supplémentaires. Ensuite, faites tourner les cellules à 100 fois G pendant cinq minutes et remettez-les en suspension dans 10 millilitres de milieu RPMI 1640.

Versez ensuite la suspension dans un flacon roulant de 1850 centimètres carrés contenant 500 millilitres de fluide, et incubez les cellules dans les mêmes conditions qu’auparavant, mais avec une rotation constante. Une fois que le nombre de cellules souhaité est atteint, faites tourner la culture à 100 fois G pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans 36 millilitres de milieu RPMI 1640. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et retirez les petites aliquotes pour le comptage des cellules et l’extraction de l’ADN.

Pour réticuler les cellules, ajoutez 1 millilitre de formaldéhyde à 37 % pour atteindre une concentration finale de 1 %, puis incubez les cellules à 10 à 30 tr/min à température ambiante pendant 10 minutes. Éteignez la réaction de réticulation en ajoutant 2 millilitres d’une solution de glycine de 2,5 molaires pour une concentration finale de 125 millimolaires. Ensuite, incubez les cellules en rotation pendant cinq minutes.

Après avoir granulé les cellules par centrifugation, utilisez du 1X PBS glacé pour laver les cellules deux fois. Poursuivez la lyse et l’infiltration des cellules, ou remettez la pastille en suspension dans 5 millilitres de tampon de lyse cellulaire, et congelez la suspension goutte à goutte dans de l’azote liquide. Conservez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Pour effectuer la lyse et le voile, remettre la pastille en suspension dans 20 millilitres de tampon de lyse cellulaire. La centrifugeuse les cellules à 400 fois G, à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 6 millilitres de tampon de lyse des noyaux avec des inhibiteurs de protéase.

En préparation de la sonication, divisez l’échantillon uniformément dans six à huit tubes Microfuge. Placez les échantillons sur de la glace ou une grille froide et utilisez un sonicateur avec une micro-pointe pour les soniser à 65 % d’amplitude avec cinq rafales constantes de 20 secondes, permettant à la suspension de refroidir pendant au moins 40 secondes entre les impulsions. Centrifugez les cellules à 12 000 fois G et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube et jetez les pastilles.

Après avoir estimé la récupération totale à l’aide de la fluorométrie, congelez les échantillons en un clin d’œil. Après la préparation des tampons d’hybridation et de lavage selon le protocole de texte, utilisez 1 200 microlitres de tampon d’hybridation 1X pour laver 600 microlitres de billes trois fois. Utilisez ensuite 1 200 microlitres de tampon d’hybridation 2X pour remettre les billes en suspension.

Dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, ajoutez 600 microlitres d’échantillon, 120 microlitres de billes lavées en suspension dans un tampon d’hybridation 2X et 480 microlitres de tampon d’hybridation 2X. Incuber les tubes à 31 degrés Celsius et à 30 à 60 tr/min pendant 10 minutes. Placez ensuite les tubes sur un aimant, jusqu’à ce que les billes soient immobilisées, et transférez les échantillons dans de nouveaux tubes avant de jeter les billes.

Remettez en suspension les oligonucléotides de capture dans une solution de travail de 10 picomoles par microlitre et ajoutez 4 microlitres de cette solution dans chaque tube. Incuber les tubes à 42 degrés Celsius en 30 à 60 tr/min pendant 40 minutes. Pendant l’incubation, mettez de côté les billes nécessaires, lavez les billes trois fois comme précédemment, mais cette fois-ci utilisez un tampon d’hybridation 1X pour les remettre en suspension.

Ajoutez les billes lavées dans les tubes et incubez les échantillons à 30 à 60 tr/min à température ambiante pendant 30 minutes. Placez les tubes sur l’aimant et retirez le surnageant une fois les billes immobilisées. Après avoir lavé les billes, éluez l’échantillon en ajoutant 40 microlitres d’eau de qualité moléculaire et incubez les tubes à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Placez les tubes sur l’aimant et attendez quelques minutes jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube et jetez les billes. Stockez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius ou procédez à l’analyse protéomique selon le protocole de texte. Pour évaluer le rendement de capture, utilisez de l’eau de qualité moléculaire pour diluer une aliquote de l’éluat, de un à dix.

Après avoir extrait l’ADN d’une aliquote prise plus tôt dans la vidéo, utilisez l’échantillon d’ADN et de l’eau de qualité moléculaire pour préparer une courbe standard, avec cinq dilutions de une à dix dilutions. Préparez un mélange maître qPCR en ajoutant des amorces et des sondes, et distribuez la quantité appropriée dans chaque puits de la réaction. Dans chaque puits, ajoutez 5 microlitres d’échantillon dilué, de la courbe standard ou de l’eau de qualité moléculaire pour servir de témoin sans modèle.

Scellez la plaque et faites-la tourner à 100 fois G pendant une minute. Exécutez ensuite les échantillons dans un système qPCR à l’aide des paramètres trouvés dans le protocole texte. Enfin, utilisez la courbe standard pour évaluer les rendements, et la capture brouillée pour évaluer la spécificité de la capture.

On voit ici des captures d’hybridation à l’aide d’un titrage d’oligonucléotides. Le nombre d’oligonucléotides est progressivement augmenté, tandis que la concentration totale est maintenue constante. Cette expérience permet de déterminer combien d’oligonucléotides différents sont nécessaires pour atteindre des efficacités d’hybridation optimales.

Il révèle également toute interaction d’hybridation préjudiciable évidente entre un ensemble particulier d’oligonucléotides, et s’il existe des oligonucléotides avec une faible spécificité, entraînant un bruit de fond élevé. Une grande proportion de fragments dans la chromatine réticulée ne se prêtera pas à la capture par hybridation. Si la capture par hybridation est effectuée avec succès, une expérience de capture ultérieure du même matériau de chromatine, en utilisant un ensemble différent d’oligonucléotides de capture, donnera des rendements comparables à ceux obtenus lors de l’utilisation de chromatine fraîche.

Cependant, dans une deuxième expérience de capture utilisant les oligos originaux et la chromatine restante de la première expérience, le rendement diminuerait d’environ 90 % si la plupart du matériel propice à l’hybridation avait été capturé dans la première expérience. Cette figure montre la capture d’hybridation de différentes régions cibles chromosomiques, chaque région servant de contrôle négatif pour l’autre. Une séquence brouillée sert également de véritable contrôle négatif.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours, si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de tester d’abord les oligonucléotides de capture, pour s’assurer que la région souhaitée se prête à la capture par hybridation. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme l’immunoprécipitation de la chromatine, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme où ailleurs dans le génome se lient les protéines d’interaction avec l’ADN identifiées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer HyCCAPP afin d’enrichir les régions génomiques d’intérêt dans le but d’identifier de novo les interactions protéiques locales.