Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction

L’objectif global de cette expérience est de digérer des molécules d’ADN marquées par fluorescence avec des enzymes de restriction sensibles à la méthylation et non sensibles à la méthylation et de déterminer le taux de digestion de l’expérience. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la chimie ou de la biologie, comme la génomique. L’avantage de cette méthode est qu’un scientifique peut digérer de l’ADN pré-coloré avec une enzyme pour déterminer si l’ADN est complet après la réalisation d’une expérience différente.

Drew Thompson, un étudiant de premier cycle de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour faire un gel d’agarose à 0,7 %, pesez 1,4 gramme d’agarose à haute température de gélification dans un erlenmeyer. Ajoutez ensuite 200 millilitres de 1x tampon TAE et placez un bécher inversé sur le dessus du flacon.

Faites chauffer la solution sur une plaque chauffante jusqu’à ce que des bulles commencent à se former au fond du ballon et flottez vers le haut. Retirez la solution de la plaque chauffante et laissez-la refroidir jusqu’à ce que le ballon puisse être touché à main nue. Versez ensuite le gel dans un moule à gel de 24,5 centimètres sur 21,8 centimètres avec un peigne à gel pour créer des puits.

À l’aide d’une pointe de pipette, faites éclater les bulles près du peigne ou à la surface du gel et laissez le gel se solidifier pendant au moins 15 minutes. Pour colorer l’ADN lambda à six concentrations différentes de colorants, commencez par utiliser 1x TE pour préparer 300 microlitres de 100 nanogrammes par microlitre d’ADN lambda. Conservez la solution à quatre degrés Celsius.

Lors de la préparation d’un échantillon pour chacune des concentrations de colorant suivantes pour chaque bande attendue dans une digestion de restriction, colorer 75 à 100 nanogrammes d’ADN lambda non méthylé. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, pour déterminer si une enzyme de restriction peut digérer l’ADN coloré, ajoutez 20 unités d’enzyme de restriction, trois microlitres du tampon approprié avec l’efficacité de coupe la plus élevée, et de l’eau distillée autoclavée et filtrée pour une réaction de 30 microlitres.

Placez les réactions dans un bain-marie à l’activité enzymatique optimale et incubez-les pendant deux à quatre heures. Arrêtez ensuite les réactions en ajoutant deux microlitres d’EDTA 0,5 molaire pH 8,0. Retirez les côtés du moule à gel préalablement préparé et placez le gel dans la boîte d’électrophorèse sur gel.

Versez 2,5 litres de 1x tampon TAE dans la boîte. Retirez ensuite soigneusement le peigne à gel du gel afin que les puits soient accessibles. Pipetez les réactions enzymatiques de restriction sur un film plastique et, pour chaque solution réactionnelle, ajoutez un microlitre de colorant de charge 6x pour cinq à six microlitres de solution d’ADN.

Ensuite, pipetez les réactions dans les puits. Mélangez un microlitre d’une échelle d’un kilobase, neuf microlitres de 1x TE et deux microlitres de 6x colorant de chargement. Chargez ensuite la solution dans les puits qui flanquent les autres solutions.

Couvrez la boîte de gel avec un papier ou un tissu bleu foncé ou noir, puis connectez la boîte de gel à une source d’alimentation. Réglez l’alimentation sur 30 volts et faites-la fonctionner pendant la nuit. Éteignez les lumières pendant que le gel fonctionne pour éviter le photoclivage de l’ADN marqué.

Le lendemain matin, transférez le gel dans le plateau dans un récipient contenant 45 microlitres de bromure d’éthidium et un litre de 1x tampon TAE. Conservez le récipient à température ambiante dans l’obscurité ou couvrez-le d’une feuille d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Laissez le gel agir pendant au moins 45 minutes à température ambiante.

Pour imager le gel, placez le gel sur un transilluminateur de lumière bleue, qui émet un rendement lumineux maximal entre 400 et 500 nanomètres. Prenez des photos avec un appareil photo fixé à la station. Déterminez le taux de digestion de l’expérience selon le protocole textuel.

L’efficacité enzymatique est déterminée en divisant le nombre total de bandes attendues par le nombre de bandes visibles. De plus, afin de déterminer la taille approximative des bandes, un contrôle est nécessaire pour savoir où les molécules d’ADN natives sont attendues par rapport à l’ADN coloré. La mobilité des bandes dans les voies trois et quatre a diminué, ce qui les a rapprochées des puits.

Dans ces voies, la quantité de colorant n’affecte pas sensiblement la mobilité, de sorte que les bandes correspondent au contrôle. Les couloirs cinq et six montrent plus de bandes que le témoin, ce qui indique une digestion partielle, ce qui suggère que les colorants ont affecté le clivage aux sites de reconnaissance. Dans cette expérience, toutes les bandes attendues sont observées pour toutes les concentrations de colorants, de sorte que les dés n’ont pas interféré avec la digestion de l’ADN.

Pour voir comment la mobilité se déplaçait à mesure que la concentration du colorant YOYO-1 augmentait, des astérisques colorés ont été insérés à côté de chaque bande. Par exemple, les bandes de base de 3,5 kilos sont accompagnées d’astérisques rouges pour chaque concentration de YOYO-1. Les bandes inattendues dans les couloirs cinq et six n’ont pas d’astérisque à côté des bandes.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de couvrir le gel avec une feuille de papier sombre et de terminer l’écoulement du gel dans une pièce sombre. Assurez-vous également d’utiliser des tubes sombres pour vos réactions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de digérer des molécules d’ADN colorées par fluorescence avec des enzymes de restriction et de déterminer le taux de digestion de la réaction.

N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium peut être extrêmement dangereux, c’est pourquoi des précautions telles que le port de gants et de lunettes de sécurité doivent être prises lors de l’exécution de la procédure. Assurez-vous également de porter des lunettes de sécurité appropriées lorsque vous utilisez un transilluminateur.