Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de générer des cartes de synchronisation de la réplication de l’ADN du génome entier à partir d’embryons de poisson-zèbre à différents stades de développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du cycle cellulaire et de la biologie de la chromatine, telles que la façon dont les changements de chromatine qui se produisent au cours du développement embryonnaire peuvent affecter l’initiation des fourches de réplication de l’ADN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle cartographie les changements de réplication qui se produisent in vivo à des stades définis du développement embryonnaire.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la façon dont la réplication de l’ADN change au cours du développement du poisson-zèbre, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes ou organismes modèles, tels que les tuniciers, les grenouilles et les mouches. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car il faut un peu de pratique pour générer des suspensions unicellulaires à partir d’embryons de poisson-zèbre. La nuit précédant la collecte des embryons, placez des dizaines d’adultes reproducteurs dans des bassins de reproduction, en utilisant un nombre à peu près égal de mâles et de femelles.

Selon l’expérience, utilisez l’une des stratégies d’élevage suivantes. Pour la première stratégie de reproduction, placez quelques poissons-zèbres mâles et femelles dans des bassins de reproduction individuels et utilisez un séparateur pour séparer les mâles des femelles. Si cette approche est utilisée, installez de nombreux bassins d’élevage différents et regroupez les embryons de chacun pour vous assurer que la variabilité biologique est représentative de la population.

Pour la stratégie de reproduction numéro deux, combinez des dizaines de poissons-zèbres mâles et femelles dans un grand bassin d’élevage. Utilisez cette stratégie tant qu’il y a un nombre suffisamment important d’embryons. Il est raisonnable de supposer qu’ils proviennent d’une variété de fondateurs et sont donc génétiquement représentatifs de la population.

Pour effectuer des accouplements chronométrés, commencez dès que les cycles de lumière commencent le matin. Laissez les poissons se reproduire dans des eaux peu profondes pendant une période de 10 minutes, avec un faux fond pour que les embryons s’échappent. Après 10 minutes, récupérez les embryons en les versant dans une passoire et en les rinçant dans une assiette de 10 centimètres à l’aide d’une bouteille de lavage.

Regroupez tous les embryons collectés au même moment, marquez-les avec l’heure de collecte et placez-les immédiatement dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius. Pour s’assurer que les embryons en développement synchrone sont collectés, il est essentiel que des lots d’embryons soient collectés toutes les 10 minutes. Ceci est particulièrement important avec les premiers stades du développement embryonnaire.

On peut s’attendre à ce qu’il y ait des centaines d’embryons d’un seul couple d’accouplement en une journée. Laisser les adultes se reproduire par cycles de 10 minutes jusqu’à ce que le nombre d’embryons obtenus soit inférieur à 20. Environ une à 1,5 heure après le prélèvement, pour trier les embryons, les retirer de l’incubateur, les observer sous un microscope de dissection et les trier pour éliminer les œufs morts et non fécondés.

Comptez les embryons et placez-les à une densité de 100 embryons par plaque de 10 centimètres. Ajoutez du milieu E3 frais et remettez les embryons dans l’incubateur à 28,5 degrés Celsius. Lorsque les embryons atteignent le stade de développement souhaité, vérifiez le stade morphologique au microscope optique selon les stades de développement embryonnaire du poisson zèbre.

Si les embryons ont une taille de 48 hpf ou moins, transférez jusqu’à 1500 embryons stagés dans un tube conique de 15 millilitres et utilisez E3 pour les laver plusieurs fois. Pour 100 embryons, ajoutez un millilitre de E3 et 20 microlitres de solution Pronase et remuez doucement. Jusqu’à 1500 embryons peuvent être déchoionnés dans un seul tube avec 15 millilitres d’E3. Posez le tube sur le côté et disposez les embryons en une couche uniforme pour assurer un rapport surface/volume maximal.

Agitez doucement le tube toutes les deux à trois minutes jusqu’à ce que tous les chorions soient tombés des embryons. Le temps total de délivrance variera en fonction de l’activité de la Pronase. Retirez le surnageant et, avec 10 millilitres d’E3, rincez doucement les embryons trois fois.

Après avoir placé les embryons sur de la glace et retiré l’E3 restant, utilisez un millilitre de tampon de déteulage glacé fraîchement préparé pour 500 embryons pour laver l’échantillon. Ensuite, à l’aide d’un P1000, pipetez doucement les embryons de haut en bas cinq à dix fois pour perturber le sac vitellin. Ensuite, transférez un millilitre dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et centrifugez l’échantillon à quatre degrés Celsius et 500 fois la gravité pendant cinq minutes.

Les échantillons doivent être pipetés juste assez vigoureusement pour créer une suspension unicellulaire sans lyser les cellules. Cette étape demandera un peu de pratique. Retirez le surnageant et utilisez un millilitre de 1x PBS glacé pour laver la pastille afin d’éliminer la solution de Ringer.

Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon. Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de 1x PBS. Ensuite, placez le tube sur de la glace.

Ajoutez trois millilitres d’éthanol glacé dans un tube conique de 15 millilitres et tourbillonnez doucement le tube d’EtOH à basse température. À l’aide d’un P1000, versez lentement une suspension de cellules embryonnaires de poisson-zèbre dans l’EtOH tout en continuant à vortex. Ajouter un total d’un millilitre de suspension de cellules embryonnaires, pour une solution de fixation finale de 75 % d’EtOH.

Après avoir ajouté un millilitre de suspension cellulaire, faites tourner doucement le tube pour le mélanger et placez-le sur le côté à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure, ou conservez la suspension au congélateur pendant deux à trois semaines. Pour colorer l’ADN embryonnaire, après avoir retiré les cellules embryonnaires fixées à EtOH à moins 20 degrés Celsius, centrifugez le tube à 1500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez le tube sur de la glace et retirez délicatement le surnageant.

Ensuite, à l’aide d’un P1000, remettez doucement les cellules en suspension dans un millilitre de PBS-BSA froid fraîchement préparé. Centrifugez les cellules à 1500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et placez l’échantillon sur de la glace. Ensuite, retirez le surnageant et, pour 1 000 embryons, ajoutez 200 microlitres de solution de coloration à l’iodure de propidium et remettez les cellules en suspension.

Laissez les cellules incuber dans une solution PI pendant 30 minutes sur de la glace, en mélangeant doucement toutes les cinq minutes. Placez une crépine à cellules en nylon de 40 micromètres sur un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Ensuite, pipetez doucement les cellules pour mélanger et filtrer la solution cellulaire à travers le maillage.

À l’aide de l’extrémité intérieure plate d’un piston de seringue, perturbez doucement les amas de cellules restants sur le treillis. Pour 1 000 embryons, utilisez 500 microlitres de PBS-BSA froid pour rincer les cellules à travers le filtre. Placez un maillage de 40 micromètres sur un tube conique de 15 millilitres sur de la glace et filtrez une deuxième fois la suspension cellulaire du tube conique de 50 millilitres dans le tube de 15 millilitres.

Enfin, à l’aide d’un instrument de tri cellulaire approprié, réglez l’excitation laser à 561 nanomètres et la détection d’émission à 610 sur 20 pour détecter l’iodure de propidium. Triez les cellules et effectuez des analyses supplémentaires selon le protocole texte. Pour déterminer la qualité de la cartographie de lecture, les données de séquençage doivent d’abord être alignées sur le génome, à l’aide de statistiques des valeurs mapQ.

En outre, les statistiques de longueur de lecture calculées sont tracées sous la forme d’un histogramme de la distribution des tailles d’insert pour toutes les lectures de séquençage. Cette expérience particulière a abouti à une médiane de 170 pb. Ce graphique à barres illustre les statistiques de lecture pour le nombre total de lectures mappées, les lectures contenant un indicateur de faible qualité, les lectures avec des paires mappées à un chromosome différent, les lectures avec une paire au-delà du seuil de distance et les doublons PCR.

Les nombres représentatifs de lectures totales cartographiées, non cartographiées et non appariées, de couverture et de résolution de lecture pour une séquence typique d’un échantillon de poisson-zèbre sont répertoriés ici. Après le filtrage, le nombre de lectures est déterminé dans des fenêtres de taille variable et les données sont lissées et normalisées. Les profils de synchronisation de réplication typiques lissés et normalisés d’un chromosome représentatif du poisson-zèbre pour les réplicats biologiques sont présentés ici.

Les profils des réplicats biologiques et expérimentaux doivent être très similaires et présenter également une forte corrélation sur la longueur du chromosome. Les profils doivent également présenter une forte corrélation entre les valeurs temporelles à l’échelle du génome. La carte des couleurs représente le coefficient de corrélation de Pearson.

Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se rappeler de s’assurer que les embryons en développement synchrone sont collectés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme les injections de morpholino ou la mutagenèse CRISPR-Cas9, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels sont les mécanismes par lesquels la réplication de l’ADN est coordonnée avec d’autres processus de développement ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter des cellules à des étapes spécifiques du cycle cellulaire à partir d’embryons de poisson-zèbre en développement synchrone.

La collecte de ces échantillons est essentielle pour générer des cartes de synchronisation de la réplication de l’ADN du génome entier.