Name: Optimisation d’un test d’Expression de base d’ARN Multiplex à l’aide de documents d’archives de Cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez l'optimisation d'un test multiplex à base d'ARN pour classifier les cancers du sein à partir de tissus d'archives dégradés. Cette méthode utilise la microdissection laser et permet une validation précise des biomarqueurs.

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Le travaux ont été subventionnés par (1) un Breast Cancer projet bourse (2014-2016) financé par l’Action de la Breast Cancer Foundation et ALIVE 2013 dans le cadre de la recherche, l’Innovation et la Development Trust (RIDT) de l’Université de Malte, (2) la faculté de médecine & Chirurgie, Université de Malte et (3) projet de loi financé par Malta Council for Science & Technology par FUSION : The R & I Technology Development Programme 2016. La publication de ce manuscrit est pris en charge par le biais de la subvention de Jove-Luminex.

Approbation éthique pour l’utilisation de matériel tissulaire du sein dans cette étude a été obtenue de l’Université recherche éthique Comité (UREC) de l’Université de Malte (Ref : 22/2012).
1. préparation du tissu
<ol><li>Aide appropriée H & E procédures14, préparer teinté référence des sections de tissu et numériquement numériser les diapositives pour référence au cours de la microdissection.</li>
	<li>À l’aide d’un microtome, coupes 20 µm tissus sur un bain d’eau exempte de RNAse à 40 ° C. Recueillir les sections sur des lames de la membrane pour microdissection laser utilisant des matériaux et équipements propres, RNase-décontaminés.</li>
	<li>Sécher les lames de la membrane à 37 ° C dans une étuve de séchage du jour au lendemain. Tache à l’aide de la procédure appropriée H & E15 avec des solutions de qualité de la biologie moléculaire et en augmentant le temps de coloration de l’hématoxyline à 6 min. Si nécessaire, tacher les diapositives de la membrane avec les protocoles d’immunohistochimiques appropriées16.</li>
</ol>2. Microdissection laser
<ol><li>Définir les limites de la diapositive et calibrer le mouvement de la scène.<ol>
<li>Déplacer la vue de laser sur une zone vide d’un glissement de la membrane. Calibrer la mise au point du laser en tirant d’un laser tourné à accroître les intervalles de mise au point (5 %) jusqu'à ce que le laser commence à percer à travers la membrane. Tirage au sort et microdissect toute forme et peaufiner la mise au point de laser pour maximiser l’efficacité du laser au cours de la dissection de laser.</li>
		<li>Augmenter la vitesse de déplacement de phase à un point où l’efficacité de la dissection du laser n’est pas compromise. Calibrer le laser à l’objectif choisi et recalibrer si la modification des objectifs (vitesse du laser à 1 à 15 %), la mise au point à 70 – 75 % et la puissance à 90 à 100 % lorsque vous utilisez l’objectif 4 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numérisez les diapositives de membrane teinté à l’aide de l’objectif 4 X.</li>
	<li>Sélectionnez et encercler les zones cibles pour microdissection sur la diapositive de la membrane. Laser de disséquer une superficie minimale de 42 mm2. Enregistrer la zone disséquées pour déterminer le volume de tampon homogénéisation de l’échantillon à utiliser.</li>
	<li>Utiliser le mécanisme de levage de cap pour récupérer la section disséquée sur les chapeaux de diffuseur de tubes étiquetés, jointe à l’appendice approprié. Si la section disséquée n’est pas trouvée sur le capuchon, répétez la dissection de laser de la zone.</li>
</ol>3. tissu lyse
Remarque : Plusieurs solutions et les matériaux sont fournis avec les kits mentionnés dans la Table des matières.
<ol><li>Préparer le volume requis de mélange homogénéisation pour lyse d’échantillon à l’aide de la solution homogénéisation et la protéinase K à un ratio de 60 : 1.</li>
	<li>Distribuer 2,4 µL d’homogénéiser la solution dans chaque tube pour chaque 1 mm2 de la zone de tissu, Vortexer pendant 10 s à la vitesse maximale et centrifuger à température ambiante pendant 5 s à 2 500 g.</li>
	<li>Incuber dans un bloc de chauffage à 65 ° C pendant 12 à 18 h avec agitation à 600 tr/min.</li>
	<li>Centrifuger les lysats à 21 000 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, soigneusement aspirer le surnageant clair et verser dans un tube frais identifié. Éviter d’aspirer les fragments de tissus/membrane car cela pourrait réduire la qualité des résultats.</li>
	<li>Stocker le liquide clair surnageant dans un congélateur à-80 ° C.</li>
</ol>4. essai hybridation
<ol><li>Effectuer les préparations suivantes.<ol>
<li>Réchauffez le mélange de lyse en plaçant le flacon de réactif dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min et mélanger doucement à l’inversion.</li>
		<li>Si les homogénats de tissus sont figés, décongeler à température ambiante et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Vortex les échantillons à la vitesse maximale après l’incubation.</li>
		<li>L’incubateur agitateur à 54 ° C et y déposer la sonde de la trousse de validation de température dans un puits vide d’une plaque de 96 puits. Après 2 h vérifier la température sur le thermomètre numérique et régler la température de delta de secouer l’incubateur pour corriger tout écart de température.</li>
		<li>Dégel et vortex la sonde définie et blocage du réactif pendant 10 s, centrifuger à température ambiante pendant 5 s 2500 x g et de garder sur la glace.</li>
		<li>Garder le flacon de protéinase K sur la glace pendant l’utilisation.</li>
		<li>Laisser agir les perles de capture à 46 KHz pendant 3 min, puis vortex à la vitesse maximale pendant 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un mélange de billes travail à 25 µL / puits de mise à l’échelle en conséquence des réactifs suivants : 4,25 µL d’eau exempte de nucléase, 16,65 µL du mélange de lyse, 1,00 µL de blocage réactif, 0,10 µL de protéinase K, 0,50 µL de capture perles 2,50 µL de sonde.</li>
	<li>Vortex du mélange de billes de travail pour 10 s à la vitesse maximale puis Pipetter 25 µL/puits dans la plaque de séparation magnétique.</li>
	<li>Prélever 25 µL homogénat de tissu à une plaque de 96 puits de séparation magnétique et 25 µL de solution aux 3 puits comme les blancs l’homogénéisation.</li>
	<li>Sceller la plaque de séparation magnétique à l’aide d’un joint de pression en plastique transparent et placer la plaque dans l’incubateur à 54 ± 1 ° C pendant 18 à 22 h et en agitant à 600 tr/min.</li>
	<li>Préparer un 1 X solution de tampon de lavage pour 24 puits en mélangeant 31,5 mL de RNase-libre de l’eau avec 0,1 mL de lavage tampon composant 1 et 1,67 mL de composant de tampon de lavage 2.</li>
	<li>Retirez la plaque de l’incubateur. Régler la température de l’incubateur à agitation à 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Monter la plaque de séparation magnétique sur la machine à laver à main plaque magnétique et verrouiller en place. Enlever le joint de la pression et attendre 1 min pour les billes magnétiques à régler.</li>
	<li>Lavage : Il faut inverser la plaque de séparation magnétique montée sur la plaque au-dessus de l’évier et la tache doucement sur un papier de soie pour enlever la solution résiduelle. À l’aide d’une pipette multicanaux ajouter 100 µL de solution tampon de lavage 1 X dans chaque puits et attendre 15 s. Répétez cette étape pour laver la plaque 3 fois.</li>
	<li>Distribuer 50 µL de réactif préamplificateur à chaque puits. Sceller la plaque avec un joint de la plaque d’aluminium et secouer la plaque à 800 tr/min pendant 1 min à température ambiante. Incuber pendant 1 heure à 50 ± 1 ° C en agitant à 600 tr/min.</li>
	<li>Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage).</li>
	<li>Distribuer 50 µL de réactif amplificateur dans chaque puits. Sceller la plaque avec un joint de la plaque d’aluminium et secouer la plaque comme dans l’étape 4.10.</li>
	<li>Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage).</li>
	<li>Vortex la sonde de l’étiquette pour 10 s à vitesse maximale. Ajouter 50 µL de la sonde de l’étiquette à chaque puits. Sceller et secouer la plaque (étape 4.10).</li>
	<li>Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage).</li>
	<li>Vortex la phycoérythrine streptavidine (SAPE) pour 10 s à vitesse maximale. Ajouter 50 µL de SAPE dans chaque puits. Sceller et secouer la plaque (étape 4.10).</li>
	<li>Répétez l’étape 4,9 (étape de lavage) sauf utilisation du tampon de lavage SAPE au lieu de la solution tampon de lavage.</li>
	<li>Ajouter 130 µL de tampon de lavage SAPE à chaque puits et joint plaque avec un joint de la plaque d’aluminium. Secouer la plaque à 800 tr/min à température ambiante pendant 3 min.</li>
	<li>Démarrage de l’analyseur de billes magnétiques. Effectuer l’étalonnage et la vérification de routine en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Mettre en place un protocole sur l’analyseur de billes magnétiques utilisant les paramètres suivants : taille de l’échantillon : 100 µL ; DD porte : 5 000 – 25 000 ; Timeout : 90 s ; Région d’événement/perle perle : 100 ; puis cliquez sur suivant. Sélectionnez les nombres respectifs de perle dans le panneau et définissent les régions de perle avec les gènes cibles respectifs comme il est indiqué par le fabricant.</li>
	<li>Ajoutez une nouvelle analyse en sélectionnant «lot de créer en utilisant un protocole existant» dans l’onglet de lots . Dans le schéma désigner les puits comme inconnu ou vide, respectivement et fournissez une étiquette pour chaque échantillon dans le panneau d’échantillons .</li>
	<li>Retirer le joint de la plaque d’aluminium de la plaque de 96 puits de réaction. Éjecter le tiroir de la plaque en cliquant sur le bouton d’éjection , la plaque de charge dans l’analyseur de billes magnétiques. Cliquez sur se rétracter| Lot exécuter pour lancer l’analyseur. Après lecture, eject et retirez la plaque de 96 puits. Nettoyer et arrêter l’analyseur de billes magnétiques, tel que recommandé par le fabricant.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Dans le lot| L’onglet résultats , sélectionnez le fichier d’analyse respectives et cliquez sur le bouton Exporter to.csv . Fichier de the.csv ouvert à l’aide d’un tableur.</li>
	<li>Observer les comtes de perle et omettre aucun résultat < 40 Perles/région.</li>
	<li>Moyenne des valeurs des blancs et de déterminer l’écart-type (SD) et la limite de détection (LOD) (vierges moyenne + (3xSD)) par gène cible. Définissez les valeurs inférieures à la limite de détection comme non détectés. Remarque : Si une des valeurs d’expression normalisant est non détectée, considérer les exemples de données inadéquates. Envisager de valeurs de l’expression plus 20 000 comme au-dessus de la limite de sensibilité supérieure. Les lysats de ces échantillons doivent être dilués et ré-analysés.</li>
	<li>Soustraire la moyenne vide de données brutes par gène.</li>
	<li>Calculer la moyenne géométrique des gènes sélectionnés normalisantes par échantillon. Normaliser les données de chaque échantillon à la moyenne géométrique respectif.</li>
	<li>Analyser les données sur les plates-formes de science de données ou en utilisant des algorithmes définis.<ol>
<li>Importer les données dans la plate-forme de science de données en cliquant sur Ajouter des données. Glissez le fichier de données dans l' Espace de travail de processus et de se connecter à un opérateur [Sélectionnez attributs] , puis à un Principal analyse en composantes (PCA) opérateur et ensuite au port result.</li>
		<li>Dans l' Attribut Select opérateur choisir le sous-ensemble de données normalisée de gène et une variable nominale comme sous-type de cancer du sein. Exécutez le processus en cliquant sur jouer. Dans l’onglet graphiques , sélectionnez le «Scatter couleur 3D» dans le style graphique et la variable nominale dans le champ couleur . Évaluer la variabilité de données APC sur un terrain en 3 dimensions.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Invitrogen the™ QuantiGene™ Plex dosage sont la propriété de Thermo Fisher Scientific.

Un dosage bDNA multiplex axée sur la perle a été optimisé afin de quantifier l’expression des gènes de dégradation ARN provenant de tissus de cancer du sein FFIP et canaux mammaires normales. Optimiser le dosage, impliqués élaborer un algorithme permettant de classer les tumeurs cancéreuses du sein en sous-types luminales et basales utilisant 8 biomarqueurs connus et potentiels 5 normalisation gènes. Normalisation des données a été réalisée à l’aide de permutations des gènes normalisantes. La sélection des gènes normalisantes reposait sur la meilleure prédiction du statut des récepteurs utilisant les gènes de classificateur Luminal/Basal. Pour classer les sous-types Luminal/Basal des tissus FFIP, les gènes de normalisation sélectionnés étaient Beta-actine (ACTB), glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
La méthode peut être adaptée pour utilisation dans d’autre diagnostic et domaines de recherche suite à une sélection adéquate de l’ensemble de gènes normalisant. Une application importante de cette méthode dans le domaine de la recherche est la mesure de biomarqueurs dans les documents d’archives bien annotée avec les résultats cliniques. Cela pourrait valider des marqueurs prédictifs potentiels dans les études rétrospectives, rapidement et avec précision et éviter des études prospectives à long terme en attente de la survie sans maladie et des données de survie globale. Notre groupe est enquête actuellement sur l’utilisation du test pour détecter les exosomes positifs pour le récepteur, qui exige l’élaboration d’un nouvel algorithme qui utilise remplaçant normalisant les gènes de normalisation des données. L’utilisation de liquides biopsies et robuste gene expression assays permettra de dosages multiplex à haut rendement adaptés pour la gestion du patient pendant le traitement et fournir un moyen de suivre l’efficacité du traitement, une rechute potentielle en raison de la résistance au traitement et la capacité métastatique de la tumeur.
Cette méthode a également a un large éventail d’applications possibles dans le diagnostic des tumeurs et est adaptée au flux de travail diagnostic actuel. Les principaux avantages de cette méthode dans le domaine du diagnostic comprennent : (1) application des tests de débit élevé, (2) à l’exclusion de subjectivité et des résultats équivoques provenant de mesures axées sur l’image, (3) détection précise de cibles multiples en même temps, qui améliorent la précision et ne minimiser l’utilisation de précieux échantillons de patients et (4) aucune exigence pour les installations hautement spécialisées et de ressources humaines. Le processus d’échantillonnage optimisé, ainsi que l’entrée basse de matériel requis pour l’essai multiplex axée sur le talon, permet outre enquête d’hétérogénéité tumorale ; Grâce à la microdissection laser pour séparer avec précision les multiples foyers de tissus malins de la même section patiente, il est possible de comparer l’expression des gènes multiples entre eux ainsi qu’avec les tissus normaux appariés (Figure 4). Faible contribution matérielle est vitale pour l’application de diagnostic sur des biopsies de tumeurs qui fournissent un tissu tumoral limité. La capacité du test à mesurer l’expression des gènes des échantillons d’ARN dégradés permet un transport aisé des échantillons pour analyse au sein d’une institution ou au service des laboratoires. En outre, toute la section analyse était également possible à l’aide de H & E teinté matières (Figure 1).
Pour la réussite de ce protocole, il est impératif de : (1) assurer le bon échantillon de la tumeur site/s qui sont lysées pour le dosage et (2) développer bien optimisé et validé les algorithmes de normalisation des données, pour chaque panneau d’expression de gène et/ou le pronostic individuel ou biomarqueurs prédictifs. La première dépend de l’expérience technique du savant/technicien effectuant le prélèvement. Il est recommandé de prendre un noyau supplémentaire et préparer un tissu microarray (TMA) dans le même format du dosage multiplex billes magnétiques (format 96 puits). Cela vous donnera une archive de sites tumoraux comme une réplique des échantillons utilisés pour l’essai à base d’ARN. TMA peut également être évaluée avec d’autres techniques de recherche de suivi ou de validation des résultats. Le développement d’algorithmes de normalisation dépend de la matière étudiée et les gènes de normalisation sélectionnés pour la normalisation. Différents panneaux de normaliser les gènes est sélectionnés selon le niveau et la variabilité d’expression dans l’échantillon analysé et cela varie entre les tissus cancéreux de différentes origines, les exosomes de plasma ou de cellules tumorales circulantes. Validation du test comprend échantillon traitement étant donné que diverses préparations seront traduira également par des algorithmes différents de normalisation.
Pour résumer, l’utilisation de la technologie bDNA en combinaison avec la technologie de billes magnétiques et la sélection du bon groupe de gènes cibles, offrira l’avantage de mesurer l’expression des gènes directement dans les lysats de tissus provenant de petites quantités de patient matériel, y compris les exosomes matérielles, microdissected et cellules tumorales circulantes. En plus de la détection de l’hétérogénéité de la tumeur, la bonne utilisation des panneaux a le potentiel pour détecter les exosomes tumeur dérivée pour le diagnostic précoce et le dépistage précoce des rechutes. Puisqu’il n’y a pas besoin d’une étape d’amplification des acides nucléiques, l’amplification du signal en utilisant la technologie bDNA, combinée avec le multiplex axée sur la perle, mesure de l’expression des gènes multiples dans cliniquement annotée des documents d’archives et fournir une ressource pour validation de biomarqueurs.

Optimisation des dosages de RNA basé utilisant d’archivage fixés au formol paraffine (FFIP) matériel est difficile en raison de la variabilité dans le traitement chirurgical de tissus et de dégradation de l’ARN causée par le formol, utilisé pour les tissus intégrité conservation1, 2. Pour contourner la limitation d’effectuer des études sur l’expression des gènes précis de documents d’archives, notre groupe a utilisé le test de billes magnétiques multiplex bDNA. Au lieu d’amplification enzymatique d’un modèle de cible, la technologie bDNA utilise l’hybridation des sondes spécifiques et amplification d’un signal de journaliste3. Les séquences courtes reconnaissance des sondes de détection et de capture sont conçus pour s’hybrider de courts fragments d’ARN cible4. En outre, l’utilisation des homogénats de tissus comme produit de départ direct dans ce test, surmonte la perte inévitable de l’ARN qui résulte de tests nécessitant une purification et extraction de l’ARN préalable. Amplification du signal, l’utilisation de séquences courtes de reconnaissance et l’exclusion d’une étape de purification, contribuent à la réduire en technique variation du dosage. La technologie offre la possibilité de multiplexer le dosage (jusqu'à 80 objectifs de RNA) et de mesurer l’expression d’un groupe de cibles de matières radioactives faiblement entrée. Ce protocole décrit la préparation et la coloration des échantillons de tissus pour microdissection laser. Coloration sur les lames de la membrane faciliter l’imagerie de la tumeur et l’architecture histologique pour fournir une sélection précise et de profilage de : (1) la tumeur et normales conduits dans le tissu mammaire et (2) de la cellule maligne clones au sein de tumeurs hétérogènes.
Classification moléculaire du cancer du sein est un processus qui interroge des marqueurs moléculaires pour classer les tumeurs patients dans trois classes moléculaires, c'est-à-dire, du récepteur 2 de facteur de croissance épidermique luminale, humain (HER2)-sous-type enrichi et basale. Le sous-type enrichi de HER2 est bien défini, avec une forte expression de récepteurs HER2, en raison de l’amplification de gène ERBB2, combinée avec faible ou absence de récepteur d’oestrogène (ER) et les récepteurs de la progestérone (RP). Le sous-type luminal est généralement positif pour les ER et le sous-type basal sont en général négatif pour les trois récepteurs HER2, ER, la République (PgR) et sensiblement chevauchements à l’aide du sein triple négatif du cancer (TNBC) diagnostic sous-type5,6. Autres marqueurs sont utilisés pour déterminer les caractéristiques épithéliales et mésenchymateuses. La fibronectine (FN1) est une composante principale du compartiment mésenchymateuses du tissu mammaire. Augmentation de l’expression FN1 s’accompagne de Ki67 élevé de coloration et montre une signature pour une tumeur plus envahissantes7,8 et est associée à des métastases9. Fait intéressant, FN1 s’est avéré pour être présents dans les microvésicules provenant de cellules tumorales, qui induit l’activation des signaux mitogènes dans les fibroblastes destinataire10. Par conséquent, circulant microvésicules tels que les exosomes sont un marqueur potentiel de détection précoce ou de métastases et11des rechutes.
Sélection de zones de tumeur du sein cancer transcription sous-typage a été récurrente réalisée par macrodissection12,13. Pour surmonter l’hétérogénéité tissulaire et augmenter la sensibilité, nous avons sûrement combiné classique tissu coloration avec des méthodes de profilage moléculaires multiplexes. Comme une preuve de principe, deux clones de cancer du sein distincts ont été définis par leur signature mésenchymateuse épithéliale et le potentiel métastatique. Le flux de travail du protocole décrit peut être facilement traduit dans la configuration actuelle de clinique et utilisé pour isoler et caractériser des sous-types de tissu à l’aide de profilage d’ARNm cible sélectivement.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Heamatoxylin Mayer’s</td><td>Sigma</td><td>MHS16-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solution aqueuse</td><td>Sigma</td><td>HT110216-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de lapin normal</td><td>Monosan</td><td>MONX10963</td><td>Dilution de travail : 1/40</td></tr><tr><td>Lapin biotinylé anti-souris</td><td>Dako</td><td>E0354</td><td>Dilution de travail : 1/200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-RE (6F11)</td><td>Vector Laboratories</td><td>VPE614</td><td>Dilution de travail : 1/45</td></tr><tr><td>Anticorps HER2 (CB11)</td><td>Novocastra</td><td>CB11-L-CE</td><td>Dilution de travail : 1/325</td></tr><tr><td>Anticorps Ki67 (MIB-1)</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>Dilution de travail : 1/500</td></tr><tr><td>Kit de complexe de biotine Avidin</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E Microscope</td> <td>inverséObjectifs Nikon</td><td>Ti-E</td><td>4x, 10x, 20x et 40x</td></tr><tr><td>Membranes de microdissection laser</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td>S0103</td><td></td></tr><tr><td>mmi CellCamera 1.4</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td>MX4285c-ACK07</td><td></td></tr><tr><td>mmi Cellcut Plus</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouchons diffuseurs</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td>50210</td><td></td></tr><tr><td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355000038</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL Bloc chauffant pour Eppendorf Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>22670522</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant à plaques 96 puits pour Eppendorf Thermomixeur</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>22670565</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Vortemp 56 Incubateur à secousses</td><td>Labnet</td><td>52056A-220</td><td></td></tr><tr><td>LX200 Analyseur</td> de <td>billes magnétiques</td>100/200 <td>Luminex</td><td></td></tr><tr><td>Kit de traitement d’échantillons Invitrogen QuantiGene - Tissus FFPE ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>QS0109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 (séparation magnétique)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Film d’étanchéité Thermaseal RTS</td><td>Thermaseal</td><td>765246</td><td></td></tr><tr><td>Laveuse de plaques magnétique portable</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Kit de validation de la température</td><td>de l’incubateur Affymetrix/Panomics</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K (50&micro ; g/&micro ; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14622</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Multi Speed Vortex</td><td>Kisker Biotech</td><td>MSV-3500</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Silvercrest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNASEZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium 96-well plate seal</td><td>Sigma</td><td>Z721549-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de validation de température</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>RapidMiner Studio Communauté 7.1.001</td><td>RapidMiner</td><td></td><td>Data Science</td></tr><tr><td>Platform Four d’hybridation</td><td>Hybaid (Thermo Scientific)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation d’un test d’expression de base d’arn multiplex à l’aide de documents d’archives de cancer du sein

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Dégradation de l’acide nucléique dans les tissus d’archivage, l’hétérogénéité tumorale et un manque d’échantillons de tissus congelés frais peut nuire aux services de diagnostic du cancer dans les laboratoires de pathologie dans le monde entier. Amplification génique et expression de dépistage à l’aide d’archives ou matériel qui nécessite le transport au service des laboratoires, a besoin d’un test plus robuste et précis adapté aux flux de travail clinique actuelle. Notre équipe de recherche optimisé l’utilisation d’Invitrogen™ QuantiGene™ essai Plex (Thermo Fisher Scientific) pour quantifier la RNA dans des documents d’archives à l’aide de technologie de l’ADN ramifié (bDNA) sur Luminex xMAP® billes magnétiques. Le test d’expression de gènes décrit dans ce manuscrit est une méthode rapide et multiplex roman, qui peut classer avec précision le cancer du sein dans les différents sous-types moléculaires, omettant la subjectivité de l’interprétation inhérente aux techniques d’imagerie. En outre, en raison de l’entrée basse de matériel requis, tumeurs hétérogènes peuvent être microdissected laser à l’aide de l’hématoxyline et éosine (H & E) coupes colorées. Cette méthode a un large éventail d’applications possibles, y compris la classification de la tumeur avec potentiel diagnostique et la mesure de biomarqueurs dans les biopsies liquides, qui permettraient de mieux en charge du patient et contrôle de la maladie. En outre, des mesures quantitatives de biomarqueurs dans les documents d’archives est utile dans la recherche en oncologie avec accès aux bibliothèques de matières annotée sur le plan clinique, dans lequel des études rétrospectives peuvent valider des biomarqueurs potentiels et leurs résultats cliniques corrélation.

La méthode décrite a été appliquée pour la mesure simultanée de 40 transcriptions en H &amp; E teinté (Figure 1), microdissected (Figure 2) fortement dégradées matériel FFIP. En utilisant cette méthode, nous montrons la caractérisation précise de l’état des récepteurs (Figure 3 a), classification des tumeurs en sous-types moléculaires luminale et basale17et l’expression différentielle du marqueur mésenchymateuse, FN1, lors de la comparaison de tumeur et le tissu témoin apparié (Figure 3 b), dans les divers sous-types de récepteurs positifs et négatifs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figure 1 : l’expression des gènes à l’aide de H &amp; E teinté matériel. Corrélation entre un profil d’expression dérivé d’une section de tumeur non colorés par rapport à une section de tumeur tachées. [Corrélation de Pearson p-value = 5.34E-26]. Reproduit avec la permission de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figure 2 : microdissection Laser des tissus FFPE. (A) H &amp; E lame marquée ; (B) Immunohistochemical souillant pour expression ER ; (C) HER2 coloration immunohistochimique ; (D) non colorés section de 20 µm sur coulisses à membrane microdissection laser. La flèche jaune indique une superficie de tumeur invasive qui n’est pas clairement délimitée à l’absence de coloration. (E), une section de 20 µm colorées avec H &amp; E pour une meilleure délimitation des domaines d’intérêt. Flèches blanches indiquent le sentier de dissection de laser tandis que la flèche rouge indique la mise au point du laser au cours de la dissection. Toutes les illustrations ont été capturées à un grossissement de 10 x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figure 3 : Expression de l’état des récepteurs (A) et (B) mésenchymateuse marqueur FN1, dans les tumeurs du sein par rapport à mise en correspondance normale. Les sous-types de cancer du sein diagnostique classique sont définis selon les diagnostique résultat en utilisant l’immunohistochimie et fluorescence in situ hybridation (poisson) pour une coloration immunohistochimique équivoque HER2. L’expression normalisée de HER2 (A) et ER, FN1 (B) mesurée par le test basé sur l’hybridation est illustrée dans HER2 positive, ER positif et négatif cas par rapport au patient assorti tissu mammaire normal. La statistique de Test Kruskal Wallis (K-W χ2) montre que l’expression de HER2 est significativement (p &lt; 0,05) plus élevé dans le tissu tumoral plutôt que les tissus normaux appariés dans la cohorte de HER2 positive et significativement plus faibles dans la cohorte de négatif. Expression de ER significativement plus élevé dans le tissu tumoral par opposition à la normale correspondant dans les cohortes de négatif et un positif ER n’a pas été trouvée. FN1 est significativement plus élevé dans le tissu tumoral dans les sous-types positives HER2 et ER et montre une tendance à être significativement augmenté dans le tissu tumoral également dans la cohorte de négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figure 4 : étude de cas : l’hétérogénéité tumorale. Tumeurs morphologiquement distinctes ont été microdissected et traités comme échantillons distincts. Scan (A), le capitaine de la section H &amp; E. (B, C) Une 10 x et 40 x grossissement, respectivement pour chaque morphologie de tumeur identifiée. (D) Immunohistochemical souillant pour ER à un grossissement de 10 x. (E) Immunohistochemical souillant pour Ki67 à un grossissement de x 10, montrant une activité mitotique plus élevée dans la tumeur 1. (F) normalisé les niveaux d’expression du gène de ESR1 dans chaque tumeur montrant une expression relativement élevée et égale entre tumeurs comme prévu depuis le résultats immunohistochimiques. (G) normalisé les niveaux d’expression de FN1, un marqueur mésenchymateux, où expression FN1 accrue s’accompagne de Ki67 élevé coloration montrant une signature pour une tumeur plus envahissante. L’inverse est observé dans la tumeur 2, qui semble être une tumeur prolifèrent plus lentement avec un faible potentiel malin représenté par expression FN1 réduite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Dégradation de l’acide nucléique dans les tissus d’archivage, l’hétérogénéité tumorale et un manque d’échantillons de tissus congelés frais peut nuire aux services de diagnostic du cancer dans les laboratoires de pathologie dans le monde entier. Ce manuscrit décrit l’optimisation d’un panel de biomarqueurs à un dosage de multiplex de billes magnétiques pour classer les cancers du sein.

Optimisation d’un test d’Expression de base d’ARN Multiplex à l’aide de documents d’archives de Cancer du sein

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Cette méthode est optimisée avec succès pour classer les patientes atteintes d’un cancer du sein en groupes thérapeutiques connus et inconnus. La haute sensibilité de ce test permet d’identifier des échantillons hétérogènes qui peuvent être étudiés plus en détail à l’aide de la microdissection laser. Le principal avantage du test multiplex basé sur l’ARN est la reproductibilité des résultats à l’aide de matériel d’archivage fixé à l’hématoxyline et à l’éosine et fixé au formol, inclus dans de la paraffine, permettant des sorties à haute résolution et la validation des biomarqueurs.Préparez le tissu comme décrit dans le protocole textuel. Pour commencer la dissection, réglez les limites de la lame et calibrez le mouvement de la platine du microscope. Numérisez maintenant les lames de membrane colorées à l’aide de l’objectif 4X.Sélectionnez et encerclez les zones cibles pour la microdissection sur la lame de membrane. Gardez une trace de la surface totale. Au moins 42 millimètres carrés sont nécessaires pour une analyse adéquate de l’ARN en aval.Lancez ensuite la découpe laser aux paramètres définis. Ensuite, utilisez le mécanisme de levage du capuchon pour récupérer la section disséquée et placez la section sur le capuchon diffuseur d’un tube étiqueté fixé à un appendice mécanique. Si la section disséquée n’est pas récupérée sur le chapeau, répétez la dissection de la zone cible.La précision de la microdissection est une étape critique et il faut toujours s’assurer que la zone microdissémiquée présente sur le capuchon coïncide avec l’image marquée et numérisée. Prélevez autant de sections de tissus que vous le souhaitez, chacune dans un tube séparé, puis procédez à la lyse des échantillons de tissus. Pour la lyse, appliquez 2,4 microlitres de solution d’homogénéisation pré millimètre carré de surface tissulaire dans chaque échantillon, puis vortex les échantillons pendant 10 secondes à la vitesse maximale.Ensuite, faites tourner les échantillons pendant cinq secondes à 2 500 g. Transférez ensuite les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre si nécessaire et placez-les dans un bloc chauffant agitant à 65 degrés Celsius. Secouez-les à 600 tr/min pendant 12 à 18 heures.Ensuite, centrifugez les lysats à 21 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Recueillir soigneusement le surnageant transparent dans un nouveau tube étiqueté. Évitez de transférer des fragments de tissu.Les surnageants peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius. Après avoir préparé tous les réactifs pour le test basé sur l’hybridation, chargez jusqu’à 90 puits d’une plaque de séparation magnétique de 96 puits avec un homogénat de tissu de 25 microlitres. Chargez 25 microlitres d’échantillons de contrôle dans trois puits désignés et chargez une solution d’homogénéisation de 25 microlitres dans trois puits en tant que blancs.Scellez ensuite la plaque de séparation magnétique à l’aide d’un joint de pression en plastique transparent et placez la plaque dans un incubateur à 54 degrés Celsius pendant 18 à 22 heures en secouant. Le lendemain, montez et verrouillez la plaque sur une rondelle de plaque magnétique portable, puis retirez le joint de pression et attendez une minute que les billes magnétiques se déposent. Effectuez maintenant un lavage.Égouttez l’assiette au-dessus d’un évier et utilisez un papier de soie pour l’éponger doucement, puis chargez tous les puits avec 100 microlitres de tampon de lavage 1X et attendez 15 secondes. Répétez ce processus trois fois pour terminer l’étape de lavage. Après avoir retiré le dernier lavage, rechargez les puits avec 50 microlitres de réactif de préamplificateur, puis scellez la plaque avec une scelleuse de plaque en aluminium et secouez la plaque à 800 tr/min pendant une minute à température ambiante.Continuez ensuite à secouer la plaque à 50 degrés Celsius pendant une heure. Une fois cette opération terminée, effectuez une autre étape de lavage. Ensuite, remplissez les puits avec 50 microlitres de réactif d’amplification, scellez la plaque avec un joint de plaque en aluminium et répétez l’incubation en secouant d’une minute à température ambiante, suivie d’une heure à 50 degrés Celsius, suivie d’une autre étape de lavage.Maintenant, faites tourbillonner la sonde d’étiquette pendant 10 secondes à la vitesse maximale, puis ajoutez 50 microlitres de sonde d’étiquette dans chaque puits. Ensuite, refermez la plaque et répétez l’incubation en secouant comme précédemment, suivie d’une autre étape de lavage. Ensuite, chargez les puits avec 50 microlitres de phycoérythrine streptavidine fraîchement mélangée, puis effectuez une incubation en secouant à température ambiante à 600 tr/min, suivie d’une étape de lavage à l’aide d’un tampon de lavage Streptavidin.Après avoir terminé l’étape de lavage, chargez chaque puits avec 100 microlitres de tampon de lavage Streptavidin et scellez la plaque avec un joint de plaque en aluminium, puis secouez la plaque à 800 tr/min à température ambiante pendant trois minutes. Au cours de la dernière étape d’incubation, démarrez l’analyseur de billes magnétiques et assurez-vous que l’instrument est calibré et que les protocoles de validation ont été effectués. Dans le logiciel, ajoutez une nouvelle analyse en sélectionnant Créer un lot à l’aide d’un protocole existant dans l’onglet Lots.Ensuite, dans la disposition des plaques, désignez les puits comme inconnus ou vides et fournissez une étiquette pour chacun d’eux dans le panneau Échantillon. Retirez maintenant le joint en aluminium de la plaque de réaction, éjectez le plateau du chargeur de plaques et chargez la plaque dans l’analyseur. Ensuite, cliquez sur Retirer, puis sur Exécuter le lot pour lancer l’analyseur.Après la lecture, éjectez la plaque et nettoyez l’analyseur de billes magnétiques comme recommandé par le fabricant. Pour l’analyse, accédez à l’onglet Résultats du lot. Sélectionnez le fichier d’analyse correspondant et utilisez-le pour l’exporter sous forme de fichier csv, puis créez des moyennes et des scores bruts à l’aide d’un tableur.Assurez-vous que les commandes affichent les signaux attendus. Normalisez l’échantillon de données brutes et analysez la distribution des données à l’aide d’une plateforme de science des données ou à l’aide d’algorithmes définis pour exécuter une analyse en composantes principales. Les performances du lecteur de billes multiplex et du test sont essentielles et l’exécution de dilutions en série d’échantillons de contrôle bien annotés avant les échantillons précieux du patient garantit des résultats corrects.Pour les attributs, sélectionnez le sous-ensemble de données génétiques normalisées et une variable nominale telle qu’un sous-type de cancer du sein. Appliquez un algorithme de classification entraîné et validé pour caractériser des échantillons inconnus. La méthode décrite a été appliquée pour la mesure simultanée de 40 transcrits dans du matériau FFPE coloré H&E, microdisséqué et fortement dégradé.En utilisant cette méthode, il est possible de montrer une caractérisation précise de l’état du récepteur et de l’expression différentielle du marqueur mésenchymateux FN1 en comparant la tumeur et le tissu témoin apparié dans les différents sous-types de récepteurs positifs et négatifs. L’hétérogénéité au sein des tumeurs peut être caractérisée à l’aide de cette méthode. Une tumeur RE positive présente une expression différentielle spatiale de FN1 dans des zones présentant une morphologie tumorale et une activité mitotique distinctes.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer plusieurs gènes directement à partir de lysats tissulaires après l’hybridation de l’ARN cible en billes, l’amplification du signal et la quantification. La sensibilité du dosage permet l’utilisation de matériaux microdissés au laser. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’étalonner l’équipement avant chaque test et de déterminer la plage de sensibilité à l’aide d’un matériel de contrôle de la qualité avant d’analyser de précieux échantillons de patients.Le flux de travail des tests est facilement adaptable aux laboratoires cliniques. Le profilage de l’ARN d’un maximum de 90 échantillons peut être effectué en 12 heures sur deux jours. La mesure de l’état des récepteurs du cancer du sein dans un laboratoire de pathologie prend du temps et nécessite des pathologistes expérimentés.L’utilisation de ce test numérisé basé sur des billes multiplex quantifie avec précision l’expression de l’ARN. L’analyse de biomarqueurs fractionnés dans les biopsies dans un diagnostic primaire est une présentation de la tumeur. L’utilisation de cette méthodologie avec un panel de biomarqueurs plus large et l’utilisation de sections entières permettent d’identifier des échantillons hétérogènes.Le développement de tests à l’aide de cette méthodologie est polyvalent et nécessite peu d’apport d’échantillon. L’échantillon comprend des échantillons cliniques annotés importants pour la validation des biomarqueurs, ainsi que des biopsies liquides, qui sont importantes pour la surveillance des patients et le diagnostic précoce.

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