Optimisation d’un test d’Expression de base d’ARN Multiplex à l’aide de documents d’archives de Cancer du sein

Cette méthode est optimisée avec succès pour classer les patientes atteintes d’un cancer du sein en groupes thérapeutiques connus et inconnus. La haute sensibilité de ce test permet d’identifier des échantillons hétérogènes qui peuvent être étudiés plus en détail à l’aide de la microdissection laser. Le principal avantage du test multiplex basé sur l’ARN est la reproductibilité des résultats à l’aide de matériel d’archivage fixé à l’hématoxyline et à l’éosine et fixé au formol, inclus dans de la paraffine, permettant des sorties à haute résolution et la validation des biomarqueurs.

Préparez le tissu comme décrit dans le protocole textuel. Pour commencer la dissection, réglez les limites de la lame et calibrez le mouvement de la platine du microscope. Numérisez maintenant les lames de membrane colorées à l’aide de l’objectif 4X.

Sélectionnez et encerclez les zones cibles pour la microdissection sur la lame de membrane. Gardez une trace de la surface totale. Au moins 42 millimètres carrés sont nécessaires pour une analyse adéquate de l’ARN en aval.

Lancez ensuite la découpe laser aux paramètres définis. Ensuite, utilisez le mécanisme de levage du capuchon pour récupérer la section disséquée et placez la section sur le capuchon diffuseur d’un tube étiqueté fixé à un appendice mécanique. Si la section disséquée n’est pas récupérée sur le chapeau, répétez la dissection de la zone cible.

La précision de la microdissection est une étape critique et il faut toujours s’assurer que la zone microdissémiquée présente sur le capuchon coïncide avec l’image marquée et numérisée. Prélevez autant de sections de tissus que vous le souhaitez, chacune dans un tube séparé, puis procédez à la lyse des échantillons de tissus. Pour la lyse, appliquez 2,4 microlitres de solution d’homogénéisation pré millimètre carré de surface tissulaire dans chaque échantillon, puis vortex les échantillons pendant 10 secondes à la vitesse maximale.

Ensuite, faites tourner les échantillons pendant cinq secondes à 2 500 g. Transférez ensuite les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre si nécessaire et placez-les dans un bloc chauffant agitant à 65 degrés Celsius. Secouez-les à 600 tr/min pendant 12 à 18 heures.

Ensuite, centrifugez les lysats à 21 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Recueillir soigneusement le surnageant transparent dans un nouveau tube étiqueté. Évitez de transférer des fragments de tissu.

Les surnageants peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius. Après avoir préparé tous les réactifs pour le test basé sur l’hybridation, chargez jusqu’à 90 puits d’une plaque de séparation magnétique de 96 puits avec un homogénat de tissu de 25 microlitres. Chargez 25 microlitres d’échantillons de contrôle dans trois puits désignés et chargez une solution d’homogénéisation de 25 microlitres dans trois puits en tant que blancs.

Scellez ensuite la plaque de séparation magnétique à l’aide d’un joint de pression en plastique transparent et placez la plaque dans un incubateur à 54 degrés Celsius pendant 18 à 22 heures en secouant. Le lendemain, montez et verrouillez la plaque sur une rondelle de plaque magnétique portable, puis retirez le joint de pression et attendez une minute que les billes magnétiques se déposent. Effectuez maintenant un lavage.

Égouttez l’assiette au-dessus d’un évier et utilisez un papier de soie pour l’éponger doucement, puis chargez tous les puits avec 100 microlitres de tampon de lavage 1X et attendez 15 secondes. Répétez ce processus trois fois pour terminer l’étape de lavage. Après avoir retiré le dernier lavage, rechargez les puits avec 50 microlitres de réactif de préamplificateur, puis scellez la plaque avec une scelleuse de plaque en aluminium et secouez la plaque à 800 tr/min pendant une minute à température ambiante.

Continuez ensuite à secouer la plaque à 50 degrés Celsius pendant une heure. Une fois cette opération terminée, effectuez une autre étape de lavage. Ensuite, remplissez les puits avec 50 microlitres de réactif d’amplification, scellez la plaque avec un joint de plaque en aluminium et répétez l’incubation en secouant d’une minute à température ambiante, suivie d’une heure à 50 degrés Celsius, suivie d’une autre étape de lavage.

Maintenant, faites tourbillonner la sonde d’étiquette pendant 10 secondes à la vitesse maximale, puis ajoutez 50 microlitres de sonde d’étiquette dans chaque puits. Ensuite, refermez la plaque et répétez l’incubation en secouant comme précédemment, suivie d’une autre étape de lavage. Ensuite, chargez les puits avec 50 microlitres de phycoérythrine streptavidine fraîchement mélangée, puis effectuez une incubation en secouant à température ambiante à 600 tr/min, suivie d’une étape de lavage à l’aide d’un tampon de lavage Streptavidin.

Après avoir terminé l’étape de lavage, chargez chaque puits avec 100 microlitres de tampon de lavage Streptavidin et scellez la plaque avec un joint de plaque en aluminium, puis secouez la plaque à 800 tr/min à température ambiante pendant trois minutes. Au cours de la dernière étape d’incubation, démarrez l’analyseur de billes magnétiques et assurez-vous que l’instrument est calibré et que les protocoles de validation ont été effectués. Dans le logiciel, ajoutez une nouvelle analyse en sélectionnant Créer un lot à l’aide d’un protocole existant dans l’onglet Lots.

Ensuite, dans la disposition des plaques, désignez les puits comme inconnus ou vides et fournissez une étiquette pour chacun d’eux dans le panneau Échantillon. Retirez maintenant le joint en aluminium de la plaque de réaction, éjectez le plateau du chargeur de plaques et chargez la plaque dans l’analyseur. Ensuite, cliquez sur Retirer, puis sur Exécuter le lot pour lancer l’analyseur.

Après la lecture, éjectez la plaque et nettoyez l’analyseur de billes magnétiques comme recommandé par le fabricant. Pour l’analyse, accédez à l’onglet Résultats du lot. Sélectionnez le fichier d’analyse correspondant et utilisez-le pour l’exporter sous forme de fichier csv, puis créez des moyennes et des scores bruts à l’aide d’un tableur.

Assurez-vous que les commandes affichent les signaux attendus. Normalisez l’échantillon de données brutes et analysez la distribution des données à l’aide d’une plateforme de science des données ou à l’aide d’algorithmes définis pour exécuter une analyse en composantes principales. Les performances du lecteur de billes multiplex et du test sont essentielles et l’exécution de dilutions en série d’échantillons de contrôle bien annotés avant les échantillons précieux du patient garantit des résultats corrects.

Pour les attributs, sélectionnez le sous-ensemble de données génétiques normalisées et une variable nominale telle qu’un sous-type de cancer du sein. Appliquez un algorithme de classification entraîné et validé pour caractériser des échantillons inconnus. La méthode décrite a été appliquée pour la mesure simultanée de 40 transcrits dans du matériau FFPE coloré H&E, microdisséqué et fortement dégradé.

En utilisant cette méthode, il est possible de montrer une caractérisation précise de l’état du récepteur et de l’expression différentielle du marqueur mésenchymateux FN1 en comparant la tumeur et le tissu témoin apparié dans les différents sous-types de récepteurs positifs et négatifs. L’hétérogénéité au sein des tumeurs peut être caractérisée à l’aide de cette méthode. Une tumeur RE positive présente une expression différentielle spatiale de FN1 dans des zones présentant une morphologie tumorale et une activité mitotique distinctes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer plusieurs gènes directement à partir de lysats tissulaires après l’hybridation de l’ARN cible en billes, l’amplification du signal et la quantification. La sensibilité du dosage permet l’utilisation de matériaux microdissés au laser. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’étalonner l’équipement avant chaque test et de déterminer la plage de sensibilité à l’aide d’un matériel de contrôle de la qualité avant d’analyser de précieux échantillons de patients.

Le flux de travail des tests est facilement adaptable aux laboratoires cliniques. Le profilage de l’ARN d’un maximum de 90 échantillons peut être effectué en 12 heures sur deux jours. La mesure de l’état des récepteurs du cancer du sein dans un laboratoire de pathologie prend du temps et nécessite des pathologistes expérimentés.

L’utilisation de ce test numérisé basé sur des billes multiplex quantifie avec précision l’expression de l’ARN. L’analyse de biomarqueurs fractionnés dans les biopsies dans un diagnostic primaire est une présentation de la tumeur. L’utilisation de cette méthodologie avec un panel de biomarqueurs plus large et l’utilisation de sections entières permettent d’identifier des échantillons hétérogènes.

Le développement de tests à l’aide de cette méthodologie est polyvalent et nécessite peu d’apport d’échantillon. L’échantillon comprend des échantillons cliniques annotés importants pour la validation des biomarqueurs, ainsi que des biopsies liquides, qui sont importantes pour la surveillance des patients et le diagnostic précoce.