Name: Analyse des comportements de croissance Arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse phénotypique chez Arabidopsis thaliana sous différentes conditions lumineuses. Cette technique fournit des résultats reproductibles et quantifiables pour étudier l'acclimatation des plantes.

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F.S. reconnaît le soutien de Rhenac vert Tec AG à travers des parties de cette étude. J.S. et B.B. a reçu des fonds de la DFG (SFB TR175).

Ce protocole contient quelques exemples de la façon d’analyser le comportement de la croissance des plantes Arabidopsis .
1. préparation
<ol><li>Avant de commencer, faire un plan prudent sur combien d’usines est nécessaires pour faire une analyse statistique fiable des expériences et prépare ensuite les montants appropriés des pots. NOTE : Laissez toujours la possibilité que certaines graines peuvent germer pas.</li>
	<li>Utiliser une chambre climatique avec différents niveaux de LED programmables individuellement pour comparer la croissance des plantes dans les mêmes conditions environnementales générales (Table des matières).</li>
</ol>2. croissance des plantes et mise en place des lumières LED
<ol><li>Préparer le nombre approprié (en fonction de différentes conditions et/ou des mutants à analyser) des pots de 6 x 7 cm avec de la terre et planter une graine unique dans chacun d’eux. Remarque : dans ce cas, 36 plantes par des conditions ont été semés.</li>
	<li>Vernalize pendant deux jours à 4 ° C.</li>
	<li>La valeur de l’humidité relative de l’air à 65 % et la température de 22 ° C/16 ° C pour une journée de 16 h / 8 h cycle de nuit. Ajuster la lumière de tous les niveaux pour une intensité de 200 µM/cm2/s1. Cela, en entrant les valeurs respectives dans un programme via l’écran tactile à l’avant de la chambre climatique. Pour comparer les quatre différentes qualités de lumière mis les LEDs aux paramètres suivants comme dans le tableau 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>« sunlight »</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rouge et bleu (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleu (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1: Composition de l’intensité de la lumière émise par la LED
<ol start="4"><li>Surveiller le signal spectral en continu, par exemple en utilisant un spectromètre étalonné intégré.</li>
	<li>Placez les plantes dans la chambre climatique sur les différents niveaux et gardez-les couverts avec un haut transparent jusqu'à ce que les cotylédons bien développées sont visibles. Veillez à ce que les plantes sont suffisamment arrosées.</li>
	<li>Surveiller et documenter les plantes par oeil et photographiquement aussi souvent que nécessaire, selon à quelle vitesse les plantes poussent dans les conditions choisies, par exemple tous les deux jours. Assurez-vous d’utiliser un trépied pour l’appareil photo pour garantir l’égale distance entre la caméra et des objets de toutes les photos et ainsi permettre des comparaisons. Utiliser une échelle graphique lorsque cela est approprié. NOTE : Le terme DAS (jours après semis) se réfère à la plantation réelles des graines dont la vernalisation.</li>
</ol>3. calcul du rendement de la PSII
<ol><li>Utilisez un fluorimètre modulées par impulsions. Mettre en place la tête de la caméra à une distance appropriée de l’usine afin que la rosette complete peut être vu sur la fenêtre direct.</li>
	<li>Lors du démarrage du logiciel, une fenêtre « Sélectionnez unité » s’affiche. Cochez « MINI » et puis « OK ». Choisissez couleur « bleu » dans la fenêtre pop-up suivante. Cliquez sur « OK ». Remarque : La fluorescence modulées par impulsions, mesurant la lumière s’allume automatiquement. Sur l’écran, la fenêtre d’Image apparaît affichant le paramètre fluorescence Ft. Une usine placée sous la caméra peut maintenant être considérée comme une image orange.</li>
	<li>Pour mettre l’image et/ou choisir des régions spécifiques de la plante, passer à la vidéo en direct en cochant la case « live vidéo » et tournez la bague de l’objectif. Quittez la fenêtre de la vidéo en direct en cliquant sur la case de sortie dans le coin supérieur droit.</li>
	<li>Pour mesurer des paramètres photosynthétiques, définir une zone d’intérêt (AOI). Utilisez le paramètre par défaut pour ce qui est un cercle qui apparaît automatiquement dans le milieu de l’écran. La zone rouge à côté d’elle représente la valeur de pi en moyenne des pixels situés au sein de l’AOI. Définir l’AOI approprié en choisissant dans la boîte de AOI au panneau droit, où les différentes formes sont disponibles. Cliquez sur « Ajouter » dans l’onglet AOI et placer le cercle intérieur de la zone de la feuille. Répéter cinq fois sur chaque feuille.</li>
	<li>Conserver les paramètres (onglet à droite) les valeurs par défaut fournies par le fabricant (tableau 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mesure de lumière</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Fréquence</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Act. Lumière</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Largeur</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrections d’image</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Transformation de l’image</td>
			<td>Batterie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Gain</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D’amortissement</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Impulsion de SAT</td>
			<td>Int.</td>
			<td>N°</td>
			<td>S d’intervalle</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lente Induction</td>
			<td>S de retard</td>
			<td>Horloge s</td>
			<td>Durée s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Gain rouge</td>
			<td>Intensité de rouge</td>
			<td>Intensité NIR</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Affichage</td>
			<td>Couleur</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Limite</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>INH. Réf. AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Facteur de FM (coutil)</td>
			<td>1 030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2: les paramètres par défaut pour les mesures de PAM tel que prévu par le fabricant.
<ol start="6"><li>Appliquer un flash de lumière saturante pour effectuer une mesure des paramètres photosynthétiques par fluorescentes trempe analyse (impulsion de Saturation). Avant cela, déterminer les coefficients d’extinction en mesurant le rendement de fluorescence minimale et maximale d’une usine d’adapté à l’obscurité. Pour ce faire, placez la plante dans le noir (par exemple dans un tiroir ou une boîte sombre) pendant quelques minutes. Puis placer la plante sous la tête de caméra, cochez les cases mesure et ML (mesurant la lumière), dans la ligne ci-dessous l’image choisir « Fv/Fm » en pointant dans le cercle et cliquez sur Fo, Fm au bas de l’écran. NOTE : Fo/Fm représente le rendement PSII d’une usine d’adapté à l’obscurité. Ainsi, c’est la valeur à laquelle la mesure après l’application de lumière est normalisée. La mesure actuelle de Fo/Fm demeurera jusqu'à ce que le nouvel enregistrement est activé. Tous les F et Fm' valeurs déterminées par impulsions de Saturation sont liés à Fo/Fm et de paramètres trempe sont calculés en conséquence.</li>
	<li>Retrouvez ces résultats dans l’onglet rapport et cochez toutes les cases sur la droite qui se rapportent à l’expérience (par exemple. Ouverts, qP, qN, etc.).</li>
	<li>Exporter les résultats vers une analyse logiciel par exemple. Excel en cliquant sur le bouton Exporter dans le coin supérieur gauche et l’enregistrer sous le nom de fichier approprié. Générer au moins cinq IEA chaque feuille et mesurer plusieurs feuilles de la même plante (n’oubliez pas de sombre peu adapter la plante à nouveau après chaque mesure), ainsi que plusieurs usines d’une affection, qui peut ensuite être statistiquement évaluée.</li>
	<li>Pour l’analyse statistique générer des valeurs moyennes et écarts-types de tous les IEA et au moins trois usines indépendantes pour tous points/conditions de temps et effectuent un test de student t-afin d’évaluer si les données sont significatives12. Ont été évaluées comme étant significativement différent lorsque les valeurs de p sont inférieure à 0,05.</li>
</ol>4. détermination de la densité des stomates
<ol><li>Frais virés trois feuilles en rosette entièrement déployées de trois plants individuels / condition dans l’éthanol à 70 % dans un plat de Pétri de verre et d’extraire la chlorophylle. Incuber dans ce solvant pendant une nuit à température ambiante ou conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Pour le déblaiement complet de pigments, incuber dans une solution d’hydrate de chloral (hydrate de chloral : eau : glycérol = 8 : 2 : 1 w/v/w) jusqu'à ce que les feuilles apparaissent complètement blanches.</li>
	<li>Prendre des images de microscopie (DIC) de la surface abaxiale interférentiel différentiel à un grossissement de 40 X. Compter des stomates dans le champ de vision et d’extrapoler à l’aide de la barre d’échelle de stomates par mm². Répétez que cette procédure pour au moins 4 feuilles par des conditions. Effectuer une analyse statistique en calculant la valeur moyenne pour toutes les feuilles d’une condition et calculer l’erreur moyenne à partir de cela.</li>
</ol>5. détermination du poids frais
<ol><li>Retirez toutes les feuilles y compris les pétioles de rosettes de six usines par l’état avec une lame de rasoir. Peser tous les feuilles immédiatement et soumettre les données à des analyses statistiques tel que décrit ci-dessus.</li>
</ol>6. détermination de la surface foliaire Rosette
<ol><li>Photos de huit usines par état permet d’analyser la surface foliaire graphiquement. Combiner des images pour une condition dans une seule image et enregistrez sous *.jpeg ou * .tiff.</li>
	<li>Télécharger le logiciel approprié (Table des matières). Remarque : Il est, bien sûr, possible d’appliquer n’importe quel autre programme capable d’accomplir cette tâche.</li>
	<li>Ouvrir un fichier image. Choisissez l’outil « Sélection de la main libre ». Encercler incluant des pétioles d’une rosette de feuilles. Cliquez sur « Analyze - ensemble de mesures » et vérifier la « Zone », « Min & Max valeur de gris, » « Densité intégrée » et « Valeur moyenne gris. » Choisissez décimal approprié des lieux, le meilleur est de deux ou trois, puis cliquez sur « OK ».</li>
	<li>Pour obtenir de mm2 au lieu des pixels avec la commande « définir échelle ». Appliquer l’outil de sélection linéaire pour faire une sélection de la ligne qui correspond à une distance connue, par exemple le diamètre de congé qui est facile à calculer à partir de la barre d’échelle des images, puis ouvrez la boîte de dialogue échelle de valeur et entrez cette distance définie et l’unité de mesure. Revenez ensuite à « analyser » et cliquez sur « mesure ».</li>
	<li>Une nouvelle fenêtre s’ouvre intitulées « résultats » qui contient les données pertinentes pour la cocarde actuelle. Répétez l’opération avec toutes les plantes dans l’image et initialiser des mesures de surface pour chaque nouvelle plante avec Ctrl + M. Remarque : Pour des plantes plus petites avec des feuilles de non-cumul l’outil « baguette magique » permet de rendre le processus plus facile et plus rapide. Dès que les feuilles commencent à couvrant les uns des autres, cet outil ne donne pas de résultats fiables.</li>
	<li>Vous pouvez également couper toutes les feuilles et positionnez-les en sorte qu’une image d’aperçu peut être pris et puis utilisez l’outil baguette magique. Tenir compte du fait que lorsque vous utilisez cette méthode, plus les plantes sont nécessaires.</li>
	<li>Sélectionnez « Fichier »-« Enregistrer sous » dans la fenêtre de résultats et de générer un nom de fichier approprié et un emplacement dans le répertoire de l’ordinateur. Le fichier sera automatiquement enregistré au format Excel.</li>
</ol>7. préparation de l’ARN
<ol><li>Récolter les trois échantillons de dix plantes individuelles pour chaque condition. Extraire l’ARN total utilisant une plante kit d’extraction d’ARN selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration RNA, la pureté et l’intégrité à l’aide d’un bioanalyzer. RNA puis peut être utilisé que pour des applications en aval telles que l’analyse d’expression qRT-PCR ou gène par ex. RNASeq13.</li>
</ol>

<ol><li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
<li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Tobacco%2C+Tomato%2C+Potato%2C+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li>
<li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-4931-1">Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols</a>. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRivero%2C+L+%22Arabidopsis+Protocols%22">Arabidopsis Protocols</a>. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).</li>
<li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Plant+Phenomics%3A+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light%3A+OCCURRENCE%2C+TIME+COURSE%2C+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li>
<li>Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24(2017).</li>
<li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana%2C+Nicotiana+benthamiana%2C+Glycine+max%2C+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31(2015).</li>
<li>Olle, M., Viršile, A. <a target="_blank" href="https://journal.fi/afs/article/view/7897">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12(2013).</li>
<li>Lin, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423812004797">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li>
<li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.pagepress.org/journals/index.php/pb/article/view/6281">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li>
<li>Student, <a target="_blank" href="http://seismo.berkeley.edu/~kirchner/eps_120/Odds_n_ends/Students_original_paper.pdf">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5548/rna-seq">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li>
<li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+back+to+nature%3A+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li>
<li>Palus, S. <a target="_blank" href="https://www.smithsonianmag.com/smart-news/japans-indoor-farm-supplies-10000-heads-fresh-lettuce-every-day-180952142/">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La première étape dans l’étude de la croissance des plantes met en place la chambre climatique selon les conditions souhaitées. Cela se fait facilement en tapant toutes les variables dans le masque de programme du logiciel respectif (Figure 1 a). À cette étape, beaucoup de modifications peut être implémenté en modifiant le régime de lumière et/ou de la température. Assurez-vous de surveiller constamment la température, l’humidité et luminosité (Figure 2) pour prévenir la défaillance technique de ruiner l’expérience. Il s’agit d’un point critique pour obtenir des résultats reproductibles. Bien que cette configuration fournit plusieurs variables et peut être ajustée de manière flexible, il a ses limites. Les voyants actuellement disponibles ne peuvent pas imiter la lumière du soleil à cent pour cent et les conditions climatiques à l’intérieur d’une enceinte climatique peuvent refléter jamais complètement ce qui se passe à l’extérieur15.
Par rapport à la largement utilisé des tubes fluorescents LED lumières sont plus polyvalents, ont besoin de moins d’énergie et ne show pratiquement aucun rayonnement de chaleur. Ces avantages ont conduit à la grande industrie agricole intérieure pour équiper les chambres climatiques et les serres avec LEDs16. Compte tenu de l’énormes succès rapportés dans ce domaine, la technique LED trouverez sûrement bien d’autres applications.
Lors de l’observation du phénotype et surtout pour la détermination de la surface foliaire, qu'il est important de prendre en compte que dans les plantes plus âgées laisse chevauchement (Figure 3). Ainsi, une évaluation graphique des rosettes toute tend à être imprécis. Dans ce cas, il est beaucoup plus précis pour couper toutes les feuilles et partir de là.
L’évaluation du comportement de croissance et en particulier les différences de croissance et de développement dans des conditions différentes repose sur un échantillon de taille suffisante. Dans cette étude, au moins six usines ont été utilisées pour la détermination du p. ex. photosynthétique rendement (Figure 5), poids frais (Figure 7), et la surface foliaire (Figure 8 a), mais 30 graines individuelles ont été plantés au début de l’étude pour s’assurer que tout d’abord, suffisamment de graines germent, et Deuxièmement, un choix de plantes « typiques » peut se faire. Même au sein de la même population, c'est-à-dire les plantes en pots unique dans la barre d’État même dans les mêmes conditions exactes, ont montré des phénotypes différents. Alors bien sûr en témoigne l’écart au cours de l’analyse statistique, mais l’interprétation des données est généralement plus fiable lorsque les petites erreurs statistiques sont observés (Figure 8 b).
Mesure du rendement photosynthétique par PAM (Figure 4, Figure 5) peut être fait pour plusieurs paramètres. Dans ce cas, était axé sur le rendement PSII ouverts à titre d’exemple, mais on peut aussi déterminer par exemple quenching non-photochimique, le rendement quantique de dissipation d’énergie réglementés et non réglementés ou de la remise lumineuse. Important ici est de choisir au moins cinq IEA chaque feuille uniformément répartis dans la surface de la feuille et ensuite mesurer au moins six feuilles de différentes plantes. L’inconvénient de cette méthode est que les conséquences pour les PSI ne peuvent être détectés ; pour cela, différents équipements sont nécessaire.

Arabidopsis thaliana a été l’organisme modèle pour les chercheurs de la plante de l’ère moléculaire pendant plus de deux décennies. Plusieurs caractéristiques rendent ce petit représentant de la famille des Brassicacées un candidat idéal pour les études génétiques et moléculaires : il possède un génome relativement faible avec seulement cinq chromosomes (contre par exemple Nicotiana tabacum avec 24 chromosomes) et son génome a été séquencé entièrement en 20001. A. thaliana peut être facilement génétiquement modifié par Agrobacterium infection2 et se prête à même les derniers outils génétiques telles que CRISPR/AR3. Bien que petite, le cycle de croissance est assez rapide pour faire des expériences biochimiques possibles nécessitant une plus grande quantité de matériel. Les plantes poussent sur milieu gélosé ou sur le sol et peuvent même être cultivés comme culture liquide4. Arabidopsis peut être cultivé dans des armoires climatiquement contrôlés, par exemple de Percival, en enceintes climatiques ou dans les serres. Pour être en mesure de comparer le comportement de croissance et d’analyser les phénotypes mutants, il est essentiel de fournir reproductible et avec le même temps la croissance flexible conditions5. Selon le problème scientifique qui doit être adressée, on pourrait besoin de différentes températures et conditions de luminosité constantes, diverses intensités lumineuses ou différentes qualités de lumière à la même température. La lumière est un paramètre très essentiel dans la croissance des plantes et son influence est souvent étudié dans diverses approches6. Afin de garantir la reproductibilité et la comparabilité des données obtenues, il est essentiel d’assurer un rendement stable et appliquent le même type de sources lumineuses.
Les sources lumineuses habituels dans les serres et enceintes climatiques sont constitués de vapeur de sodium ou de lampes fluorescentes, qui favorisent la croissance des plantes satisfaisant mais ont plusieurs inconvénients. Tout d’abord, ils vieillissent avec le temps qui change le rendement spectral, non seulement en intensité, mais de qualité (propres observations). Toutefois, seule l’intensité est généralement surveillée en continu afin qu’un changement dans la qualité de la lumière pourrait passer inaperçu mais toujours avoir des incidences notables. Deuxièmement, les deux types de lampes génèrent de la chaleur aux intensités lumineuses supérieures, qui lui-même a une profonde influence physiologique sur la croissance des plantes et peut masquer une luminescence dépendant. En troisième lieu, la sortie spectrale de ces sources lumineuses est invariable et contrairement à la lumière naturelle du soleil7. Tous ces inconvénients ont été surmontées dans le cas de LEDs)8,9,10,11. Ils ont une longue durée de vie avec à peine n’importe quel changement d’émission, ne produisent pas de chaleur résiduelle, même à très haute intensité lumineuse et ils sont très flexibles concernant leur rendement spectral.
Ici, nous illustrons comment mettre en place une chambre climatique avec LED distinctes pour rouge, bleu et blanc léger et suivre les différents paramètres de croissance de la plante au fil du temps. Nous mesurons le poids frais, la surface foliaire, densité des stomates et rendement photosynthétique. Dans le même temps, nous démontrent l’importance de correctement mise en place d’évaluations statistiques.

<table><tbody><tr><td>Chambre climatique équipée de panneaux LED</td><td>Rhenac Green Tec AG</td><td></td><td>Ces chambres sont fabriquées sur mesure.</td></tr><tr><td>Spectromètre&nbsp ;</td><td>OceanOptics</td><td>USB-650</td><td></td></tr><tr><td>Imaging PAM</td><td>Walz</td><td>IMAGING-PAM M-Series</td><td>Il existe plusieurs modèles appropriés en fonction de l’utilisation plus large.</td></tr><tr><td>Microscope+ objectif 40x</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>DM1000</td><td>D’autres entreprises produisent également des microscopes adaptés.</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td></td><td></td><td>Téléchargement gratuit depuis le site Web</td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ARN végétal</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Nécessite un ordinateur supplémentaire</td></tr></tbody></table>

analyse des comportements de croissance arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Phytobiologistes a souvent besoin d’observer le comportement de la croissance de leur espèce choisie. À cette fin, les plantes ont besoin constantes conditions environnementales et stables légers, qui sont préférence variables en quantité et en qualité, afin que sous différentes configurations peuvent être menées. Ces besoins sont satisfaits par des enceintes climatiques mettant en vedette électroluminescentes diodes (LED) s’allume, qui – contrairement aux lampes fluorescentes – réglable à différentes longueurs d’onde. Les LED sont énergie conservation et n’émet pratiquement aucune chaleur même à des intensités lumineuses, qui constitue souvent un problème avec les autres sources de lumière. Le protocole présenté fournit un guide étape par étape comment programmer une chambre climatique équipé de voyants variables comme décrivant plusieurs approches pour une analyse approfondie des phénotypes de la croissance. Selon le montage expérimental diverses caractéristiques des croissance des plantes peuvent être observés et analysés. Nous décrivons ici comment déterminer le poids frais, la surface foliaire, l’activité photosynthétique et la densité des stomates. Nous démontrons que, pour obtenir des données fiables et de tirer des conclusions valables, qu'il est obligatoire d’utiliser un nombre suffisant d’individus pour l’évaluation statistique. En trop peu de plantes pour ce genre de résultats d’analyse des erreurs statistiques élevées et par conséquent au moins clairement les interprétations des données.

Observation et analyse de la croissance des plantes et en particulier les phénotypes des plantes mutantes dépendent des conditions environnementales stables et reproductibles. Ceux-ci peuvent être fournis dans des enceintes climatiques. Quantité de lumière et surtout qualité critique dépend de la source lumineuse indépendant, qui, dans cette étude ont été fournie par LED s’allume.
Figure 1 montre un exemple d’une enceinte climatique équipé de panneaux de LED. Figure 1 a montre une capture d’écran du panneau de contrôle où toutes les conditions climatiques et la lumière peuvent être réglées. Moins de 24 h vingt différentes périodes de temps peuvent être définies. Dans cet exemple, les conditions de longue journée avec 16 h de lumière/8 sombres ont été programmées. Cette chambre dispose de quatre niveaux qui peuvent être programmées séparément afin que la croissance de la plante à quatre réglages différents de lumière peut être étudiée dans exactement les mêmes conditions environnementales. Le supérieur gauche niveau est défini sur un signal spectral imitant la lumière du soleil autant que techniquement possible, la partie supérieure représente juste niveau élevé rouge (660 nm) et la lumière bleue (440 nm) avec réduit la lumière blanche (3K). Le niveau inférieur gauche a été la valeur élevée de la lumière bleue et le niveau juste inférieur à principalement la lumière rouge. Figure 1 b illustre les LEDs à différents paramètres comme une vue d’ensemble (panneau central) et le zoom-ins respectifs (petits panneaux extérieurs). La différence de qualités de lumière visible par le œil.
Un spectromètre intégré mesure constamment, surveille et ajuste la sortie spectrale. La figure 2 montre le spectre de l’étage supérieur gauche 1.1, qui a été créée pour imiter la lumière du soleil. Par rapport à une ampoule fluorescente ordinaire la partie des UV et la lumière bleue est beaucoup plus élevé7.
Dans la Figure 3 un exemple d’Arabidopsis plantes de tous les jours de quatre conditions, 10, 13 et 17, respectivement, après que l’ensemencement est représenté. Toutes les plantes ont été photographiés à la même distance de l’installation de la caméra sur un trépied. La barre d’échelle représente 1 cm. Après 10 jours, on peut discerner pas beaucoup de différence dans la taille ou la couleur, mais après 17 jours, une croissance plus rapide sous la lumière rouge est évidente. En plus de cette analyse visuelle, plusieurs analyses physiologiques ont été effectuées.
Figure 4 suit les différentes étapes des mesures du PAM, qui analyse la capacité photosynthétique par exemple . Figure 4 a une capture d’écran de la vidéo en direct est montré, qui est le paramètre permettent d’intégrer la plante à la mise au point pour assurer une qualité optimale des mesures. Au lieu de se concentrer sur la plante entière, on peut également choisir une seule feuille à analyser. Figure 4 b montre le rendement courant fluorescent Ft d’une usine d’adapté à l’obscurité avant que la mesure réelle a été démarrée. Dans ce cas, les cinq zones circulaires d’intérêt (ZI) ont été choisis. Les nombres dans les cases rouges à côté de chaque AOI donne directement le résultat numérique, qui peut également être enregistré sous la forme d’un tableau. Pour lancer une mesure des paramètres photosynthétiques Fo, Fm doit définir. Une capture d’écran de Ft, après avoir fait cela est représenté dans la Figure 4. Notez que maintenant le bouton « Fo, Fm » n’est plus actif. Pour démarrer une nouvelle mesure, « Nouveau Record » doit être cliqué pour effacer la normalisation précédente. Enfin, la Figure 4 montre le rendement effectif du quantique PSII ouverts après avoir donné une impulsion lumineuse saturante (« SAT-Pulse »). Quantification des données exemplaires est illustrée à la Figure 5. Les plantes cultivées sous le soleil à 200 µM/cm2/s1 (Figure 5 a) ont été analysés à 12, 21 et 28 jours après le semis, respectivement. Nos résultats démontrent que le rendement PSII est significativement plus élevée dans les feuilles des plantes cultivées pendant trois semaines que pendant 12 jours. La différence entre 28 et 12 jours est encore importante, mais la p-value est plus élevée. Dans la Figure 4 b, PSII rendements des plantes cultivées pendant deux semaines de différentes qualités de lumière ont été comparés. Fait intéressant, la croissance permanente sous la lumière contenant une part élevée de la lumière bleue conduit à un rendement significativement plus élevé de PSII. Un effet similaire a été observé pour les plantes cultivées sous une lumière rouge enrichie, mais l’augmentation a été un peu plus basse.
Différentes qualités de lumière ont été montrées d’effet stomates développement14. Par conséquent, la densité des stomates a été étudiée. Figure 6 montre à quoi ressemble une feuille après l’extraction du pigment. Les cellules épidermiques unique peuvent être bien distingués et stoma peut facilement compter. Dans la figure, les stomates sont signalés par un astérisque. Des données détaillées concernant la densité stomatique des plantes contre les différents réglages de lumière se trouvent ailleurs9.
En plus de l’inspection visuelle (Figure 3), le poids frais fournit une bonne mesure de la progression de la croissance. Dans cet exemple, les feuilles des plantes cultivées sous « sunlight » après 8, 10 et 12 jours après le semis, respectivement, ont été pesés. Évaluation statistique de ces données peut être vu à la Figure 7. Comme prévu, le poids frais augmente avec le temps.
En plus de poids frais, la surface foliaire est une bonne mesure pour la croissance. Ici, le développement de la plante a été suivie de 10, 13 et 17 jours après le semis (Figure 8 a). Au moins six individus ont été évalués régulièrement pour obtenir des données statistiques fiables. Pour démontrer l’importance d’un échantillon de grande taille, on a calculé le pourcentage d’erreur de la valeur moyenne, de l’analyse de deux et six usines, respectivement, (Figure 8 b). Cela signifie que le pourcentage de l’écart en ce qui concerne la valeur moyenne a été déterminé. Il est très clair que, dans le cas d’un petit échantillon, l’erreur est 5 à 10 % plus élevé que dans le cas d’un échantillon de taille supérieure. En augmentant le nombre de plantes qui sont évalués, l’erreur peut être minimisée, ce qui rend l’interprétation des données beaucoup plus claires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Figure 1 : différentes qualités de lumière sont fournies par des LED. A) capture d’écran du panneau de commande de la chambre de LED. Durée du jour est établie à 16 h (en haut à droite) et l’intensité lumineuse est définie sur 200 µmol cm-2 s-1. La qualité de la lumière est différente sur les quatre niveaux : 1.1 représente un spectre semblable à la lumière du soleil comme techniquement possible, 1.2 représente un pourcentage élevé d’onde rouge et bleu (RB) léger, 2.1 est principalement mis sur le bleu (B), 2,2 représente principalement rouge lumière (R). B) le panneau central montre un aperçu de tous les niveaux ; les panneaux extérieurs montrent les niveaux individuels dans un zoom plus élevé. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Figure 2 : spectre de longueur d’onde de paramètres de simulation de la lumière du soleil. Une capture d’écran du spectromètre intégré dans la chambre de LED est montré, qui se trouvait au niveau 1.1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Figure 3 : usine de développement plus d’une semaine. Représentant a. thaliana plantes de tous les quatre conditions de lumière de 10, 13 et 17 DAS. Les plantes ont été photographiés avec un appareil reflex numérique sur un trépied. Barre d’échelle représente 1 cm pour toutes les images. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Figure 4 : Captures d’écran des étapes représentatives des mesures PAM de plantes Arabidopsis . A) capture d’écran de la vue « Live vidéo » où la mise au point de l’image peut être réglée. B) rendement courant de fluorescence Ft avant application de n’importe quel des impulsions de lumière. C) rendement courant de fluorescence Ft après le réglage de la Fo/FM D) rendement quantique PSII effectuant après avoir réglé une impulsion lumineuse saturante. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Figure 5 : représentation graphique du rendement quantique d’effectuant PSII (YII). A) données de plantes 12, 21 et 28 jours après le semis et cultive moins de 200 µmol/cm2/s1 sous la lumière du soleil simulé (« sunlight ») soumis à l’analyse du PAM ont été évaluées statistiquement. Sont les valeurs moyennes des cinq usines et cinq IEA par jour. Un astérisque indique une différence significative avec une valeur p &lt; 0,05 par rapport au jour 12 et de deux astérisques indiquent des différences très significatives avec une valeur p &lt; 0,02 selon students' t-test. B) données de plantes cultivées à 200 µmol/cm 2/s1 sous le soleil simulé (SL), enrichi de bleus (B) ou rouge (R) léger, respectivement, ont été évaluées statistiquement. Sont les valeurs moyennes des cinq usines et cinq IEA par jour. Des différences significatives ont été calculés par rapport à « la lumière du soleil. »
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Figure 6 : image représentative des stomates au côté d’une feuille d’Arabidopsis abaxial. Feuilles préparé comme indiqué ci-dessus et ont été visuellement analysés sous un microscope optique avec les paramètres de la DIC à un grossissement de 40 X. Stomates sont comptés dans la zone visible d’au moins 4 feuilles par État. La photo a été prise avec une caméra numérique connectée à la tubus microscope. Le nombre des stomates par mm² est calculé à l’aide de la barre d’échelle. Étoiles indiquent une stomie unique. La barre d’échelle représente 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Figure 7 : représentation graphique du poids frais d’a. thaliana plantes cultivées à simulé du soleil/200 µmol/cm2/s1. Feuilles en rosette ont été coupées de plantes huit, dix et douze jours après le semis. Les valeurs moyennes en mg de six usines par jour sont représentés. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Figure 8 : Évaluation statistique d’a. thaliana la surface foliaire des plantes cultivées sous différentes conditions de luminosité. A) la surface foliaire d’a. thaliana cultivée pendant 10, 13 et 17 jours a été déterminée graphiquement avec ImageJ et données de n = 6 plantes ont été évaluées statistiquement. La surface foliaire de tous les six rosettes de chaque condition a été résumée et divisée par six pour obtenir la valeur moyenne. Avec cette valeur, l’écart a été calculé, et cela est représenté par les barres d’erreur. B) la surface foliaire a été déterminée graphiquement avec ImageJ et données provenant soit n = 2 ou n = 6 plantes, respectivement, ont été analysés statistiquement comme pour le panneau A. Ensuite l’erreur en pourcentage de la valeur moyenne a été calculée et représentée graphiquement. Les barres vertes montrent le pourcentage d’erreur de l’analyse de n = 6, bleu de barres de n = 2 usines. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole pour l’étude de comportement de croissance des végétaux et en particulier des phénotypes de façon reproductible. Nous montrons comment fournir variable et à des conditions d’éclairage temps stable même. Bon analyses dépendent nombre d’échantillon suffisant et évaluations statistiques valides.

Analyse des comportements de croissance Arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

L’objectif global de cette analyse phénotypique visuelle et moléculaire est de comparer la croissance des plantes dans différentes conditions de lumière et de différents génotypes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les plantes, telles que l’acclimatation à différentes conditions de lumière. Le principal avantage de cette technique est qu’elle donne des résultats reproductibles et quantifiables.Franka Seiler, technicienne dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, calculez une taille d’échantillon appropriée et préparez le nombre requis de pots de six centimètres sur sept avec de la terre et plantez une seule graine dans chacun. Ensuite, vernalisez les graines à quatre degrés Celsius pendant deux jours.Réglez l’humidité relative de l’air d’une chambre climatique à 65 % et la température à 22 et 16 degrés Celsius pour un cycle de 16 heures de jour et de nuit de huit heures. Ajustez ensuite la lumière à tous les niveaux à une intensité de 200 micromoles par centimètre carré et par seconde. Utilisez le spectromètre intégré pour surveiller en permanence la sortie spectrale.Placez les plantes dans la chambre climatique et couvrez-les d’un sommet transparent, jusqu’à ce que des cotalinines bien développées émergent. Inspectez visuellement les plantes et enregistrez les données de croissance photographiquement à intervalles réguliers. Pour garantir des images cohérentes, utilisez un trépied d’appareil photo et une barre d’échelle pour chaque image.Tout d’abord, placez une plante dans l’obscurité pendant quelques minutes. Ensuite, installez un fluorimètre à modulation d’impulsions et une caméra à une distance appropriée de l’usine. La rosace complète doit être visible dans la fenêtre en direct.Démarrez le logiciel et sélectionnez la mini-option qui s’affiche dans la fenêtre de sélection de l’unité. Cliquez ensuite sur OK. Ensuite, sélectionnez bleu dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur OK.Sélectionnez l’option de vidéo en direct, tournez la bague de réglage de l’objectif pour faire la mise au point de l’image, puis sélectionnez une région spécifique de la plante. Pour quitter la fenêtre en direct, cliquez sur la case de sortie dans le coin supérieur droit. Définissez une zone d’intérêt, ou AOI, avec les paramètres par défaut.Un cercle et une case rouge avec la valeur moyenne FT des pixels contenus dans l’AOI, apparaîtront automatiquement au milieu de l’écran. Vous devez supprimer cette AOI, avant de définir la vôtre. Acceptez ensuite les paramètres par défaut dans l’onglet de droite.Cliquez ensuite sur Ajouter dans l’onglet AOI et placez le cercle dans la zone de la feuille. Répétez ce processus cinq fois par feuille, en sélectionnant plusieurs feuilles par plante. Cochez la case correspondante, avec le rendement quantique maximal PS 2, pour sélectionner l’image FV/FM.Appliquez un flash de lumière saturante pour mesurer les paramètres photosynthétiques, via une analyse de serrement fluorescent, en appuyant sur le bouton F0, FM. Recherchez les résultats dans l’onglet Rapport. Cochez toutes les cases pertinentes et exportez-les vers le logiciel d’analyse approprié.Dans cette étude, des lumières LED ont été utilisées pour fournir une quantité et une qualité de lumière stables dans l’observation et l’analyse de la croissance des plantes et des types de veines. Les données des plantes ont été recueillies 12, 21 et 28 jours après la couture. La figure montre les valeurs moyennes de rendement quantique de PS 2 de 5 plantes et de 5.Les données provenant de plantes cultivées sous un soleil simulé, une lumière bleue ou rouge enrichie ont été évaluées statistiquement. Cette figure montre les valeurs moyennes de rendement quantique de PS 2 de 5 plantes et 5 par jour. Les valeurs moyennes pour les plantes cultivées sous lumière bleue et rouge étaient significativement plus élevées que celles cultivées sous la lumière solaire simulée.Une fois installées, les lampes LED peuvent fournir des conditions d’éclairage stables ou variables en économisant beaucoup d’énergie par rapport aux lampes fluorescentes. Pendant l’expérience, il est important de s’occuper des plantes quotidiennement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les plantes pour explorer le comportement de croissance dans différentes conditions de lumière avec une longueur d’onde définie.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et d’analyser les plantes en fonction de leur type de veine visuelle et moléculaire de manière quantitative.

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