Name: Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez une méthode in vivo pour évaluer la perturbation de la barrière hémato-encéphalique chez le rat après un accident vasculaire cérébral ischémique. Cette technique utilise le bleu d'Évans pour mesurer l'intégrité de la barrière et faciliter l'étude de nouvelles thérapeutiques neurologiques.

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Les auteurs sont reconnaissants à la Vice-chancellier de recherche de l’Ardabil University of Medical Sciences (Ardabil, Iran) pour le soutien financier (subvention No : 9607).

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives d’Ardabil University of Medical Sciences Research Council pour mener des études sur l’animal (numéro d’identification éthiques : IR ARUMS. Rec.1394.08). dans la présente étude visualisée, nous avons utilisé Sprague-Dawley rats adultes (300-350 g) de pâturage Institut (Téhéran, Iran).
1. anesthésie et débitmétrie
<ol><li>Induire l’anesthésie à l’isoflurane 4 % et l’entretenir à l’isoflurane (1 à 1,5 %) dans un mélange de protoxyde d’azote (70 % v/v) et oxygène (30 % v/v) pour la durée de l’intervention.</li>
	<li>Placer un animal anesthésié dans la posture sujette sur une couverture de retour chauffage et maintenir la température du corps à 37±0.5 ° C au moyen d’une sonde rectale connectée à cet appareil de chauffage.</li>
	<li>Appliquer une petite quantité de pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement.</li>
	<li>Raser la région chirurgicale sur le côté gauche du crâne avec une tondeuse électrique. Utilisez betadine solution avec un tampon de gaze pour désinfecter la peau. Rincer un tampon stérile contenant de l’éthanol à 70 % de cette région et répétez les deux étapes pour trois cycles de17.</li>
	<li>Pour l’analgésie, injecter 0,2 mL de bupivacaïne 0,5 % par voie sous-cutanée dans la région de chirurgie17.</li>
	<li>Faire une incision de la peau long de 1 cm sur le crâne (s’étendant du canthus latéral de le œil gauche à la base de l’oreille gauche) et disséquer le muscle temporal gauche pour exposer le crâne. Ensuite, créez une Ronce petit trou 5 mm latéral à et 1 mm postérieure au bregma18 au placement de la facilité de la pointe de la sonde de crayon débitmètre Doppler.</li>
	<li>Tourner le rat de l’enclin à position allongée et ensuite mettre la sonde de crayon laser dans le crâne déjà percés aveugles-trou pour surveiller le débit sanguin cérébral régional (DSCR).</li>
	<li>Enregistrer la DSCR de base de chaque animal et considèrent cela comme 100 %. Notamment, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (OACM) est démarrée chaque fois qu’une diminution des DSCR de plus de 80 % est détecté19,20.</li>
</ol>2. l’induction de l’ischémie focale Cerebra
<ol><li>Raser la région du cou et désinfecter la peau avec betadine solution et 70 % d’éthanol. Injecter 0,2 mL de bupivacaïne 0,5 % par voie sous-cutanée dans le site de la chirurgie pour l’analgésie17.</li>
	<li>Faites une incision chirurgicale longue de 2 cm à la surface ventrale du cou pour accéder à l’artère carotide commune gauche (LCCA). Isoler le LCCA de fascia voisin et le nerf vague pour accéder à la bifurcation de l’artère carotide externe (CEA) et l’artère carotide interne (ICA).</li>
	<li>Ligaturer en permanence le LCCA ou CEA employant une suture de soie de 5-0 et disséquer ICA gratuit jusqu’au niveau de l’artère de pterygopalatine.</li>
	<li>Placer librement une cravate de suture de soie de 5-0 autour LCCA, et ensuite temporairement ICA pince avec une pince micro vasculaire.</li>
	<li>Faire une petite incision sur le LCCA avant la cravate lâche précédemment mis, puis insérez une suture de nylon enduit silicone 4-0 dans l’espace luminale de ICA et serrer la suture autour le LCCA pour fixer le fil de nylon et éviter toute fuite de sang.</li>
	<li>Retirez la pince micro vasculaire de l’ICA. Puis, avance un filament intraluminal revêtus de silicium jusqu'à observer une baisse marquée dans DSCR qui indique une occlusion de l’origine de la MCA. À la fin de la période ischémique (90 min), démarrer une reperfusion en retirant l’intraluminal suture21.</li>
</ol>3. veine jugulaire canulation et Evans Blue Injection (EB)
<ol><li>Faire une incision longitudinale de 1 cm dans le cou vers le côté gauche de la ligne médiane et puis carrément disséquer loin fascia superficiel pour accéder à la branche externe de la veine jugulaire gauche (LGV). Puis, en permanence ligaturer l’extrémité crânienne de la LGV avec suture de soie de 5-0. Vaguement placer deux liens autour de la veine et la puis temporairement bloquer l’extrémité cardiaque de la LGV avec une pince de micro vasculaire.</li>
	<li>Faire une petite incision sur la LGV entre deux points de suture et puis insérez sérum hépariné rempli cathéter dans l’espace luminale de la LGV et avancer pour environ 10 mm. par la suite, serrer les ligatures autour de la veine pour fixer le cathéter et prévenir les saignements. Injecter de petites quantités de sérum pour éviter l’effondrement de la veine.</li>
	<li>Au début de la période de reperfusion, injecter lentement colorant EB (1 mL/kg de solution EB 2 % dans une solution saline) sur une période de 5 min. Par la suite, lavez la canule par une injection de 0,5 mL de solution saline normale et retirer la canule d’injection de la veine12,22.</li>
	<li>Enfin, les incisions du cou et la tête de suture et injecter la buprénorphine 0,05 mg/kg par voie intrapéritonéale (IP) et renouveler l’injection toutes les 6-8 h au cours de la période de reperfusion pour analgésie post-opératoire17.</li>
	<li>Injecter 5 mL de saline(IP) préchauffé d’hydratation dans la cage de récupération17.</li>
	<li>Place l’animal dans une cage de récupération spécial équipé de température et le contrôle de la climatisation et surveiller la récupération de l’animal de l’anesthésie.</li>
</ol>4. Evaluation de la perméabilité de la barrière sang cerveau
<ol><li>Après 24 h de reperfusion, profondément anesthésier l’animal avec le thiopental sodique. Ensuite, ouvrir la cavité thoracique en faisant un petit trou sous le sternum.</li>
	<li>Faire une petite ouverture dans l’oreillette droite et injecter 250 mL de sérum physiologique 0,9 % préchauffé (37 ° c) sous une pression de 110 mmHg dans le ventricule gauche pendant 15 min à laver EB loin de la circulation jusqu'à la sortie saline normale de l’oreillette devient incolore23.</li>
	<li>Immédiatement retirer le cerveau du crâne et le placer dans la matrice de cerveau. Disséquer le bulbe olfactif et le cervelet, et ensuite à l’aide d’une lame de rasoir propre, séparer l’hémisphère droit du cerveau gauche (Lesioned) le long de la ligne médiane.</li>
	<li>Peser chaque hémisphère et homogénéiser les séparément dans 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate et mélanger pendant 2 min à l’aide d’une machine de vortex avec 2,5 mL d’acide trichloracétique (60 %).</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de cerveau pendant 30 min à 1 322 x g et laisser les échantillons refroidir au réfrigérateur 4 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Les surnageants permet d’estimer l’absorption EB par un spectrophotomètre à 610 nm23.</li>
	<li>Calculer les concentrations d’EB contre une courbe standard et express résultats µg/g de tissu cérébral.</li>
</ol>5. production de la courbe Standard EB
<ol><li>Préparer 10 exemples de solutions de EB avec des concentrations de 1 à 10 µg de EB dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate.</li>
	<li>Mesurer les valeurs de l’absorbance de chaque échantillon à 610 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
	<li>Faire un graphique en nuages de points à l’aide d’un tableur et des concentrations de EB présentes sur l’axe des X et les valeurs d’absorbance sur l’axe des Y (Figure 1).</li>
	<li>Définir une courbe de tendance linéaire de la courbe avec son équation. Puis, utilisez-le pour obtenir la concentration EB des échantillons.</li>
	<li>Signaler les résultats définitifs de l’extravasation de EB µg/g de la masse de tissu de cerveau.</li>
</ol>6. une opération fictive
<ol><li>Effectuer le même processus chirurgicaux sur des rats opérés de groupe (y compris faisant une incision dans la région du cou et l’injection de EB), mais excluent l’OACM.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Jusqu’ici, diverses méthodes telles que l’autoradiographie et la détection des traceurs radioactifs24,25, immunofluorescence microscopie26,27et EB extravasation technique20, 23 ont été utilisés pour évaluer les dégâts de la barrière hémato - encéphalique. EB colorant fortement peut se lier à l’albumine sérique et est utilisé comme traceur pour dé...

Œdème cérébral vasogénique en raison de la rupture de la barrière hémato - encéphalique (BHE) reste une complication importante de l’accident vasculaire cérébral ischémique et un déterminant majeur de la survie dans les accidents vasculaires cérébraux patients1,2. La sang barrière - encéphalique (BHE), qui est formée par les cellules endothéliales capillaires du cerveau (BCECs) et composée d’éléments distincts neurovasculaire (p. ex., des jonctions serrées entre BCECs, péricytes, astroglials et les cellules neuronales3), fournit un spécialisés et dynamique de l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation sanguine périphérique4,5. Insultes tels que les lésions d’ischémie-reperfusion pourraient perturber l’intégrité fonctionnelle de la BHE et conduire à la pénétration ultérieure des leucocytes circulants dans le parenchyme du cerveau qui finalement déclencher l’inflammation cérébrale et lésions cérébrales primaires 6 , 7. modèles animaux sont nécessaires pour la détection exacte du dysfonctionnement du BBB suite à la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Ces modèles sont d’une grande importance pour l’étude qui sous-tendent les mécanismes physiopathologiques et en introduisant de nouvelles stratégies neuroprotectrices. In vitro sur culture modèles cellulaires de la BHE hautement développées et utilisées pour l’étude moléculaire de la BBB physiopathologie8,9,10. Cependant, in vivo des modèles animaux, qui produisent des dommages ischémiques de la BHE similaire à des conditions cliniques humaines, sont également très utiles à cet égard. Détection quantitative de l’extravasation de bleu Evans (EB) est une technique bien acceptée et sensible qui a été utilisée pour évaluer l’intégrité BBB et fonction dans les maladies neurodégénératives, y compris les accidents vasculaires cérébraux ischémiques11, 12 , 13 , 14. cette méthode est rentable, réalisable, reproductible et totalement applicable dans n’importe quel laboratoire expérimental. Sa mise en œuvre ne nécessite pas d’équipements de pointe, tels que des traceurs radioactifs15 ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM)16, qui sont indispensables pour d’autres méthodes. Dans cet article, nous démontrons exhaustive base procédés techniques d’évaluation de BBB à l’aide d’extravasation de EB dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>AWN 34041100</td><td>20 - 25 &deg ; Chlorure</td></tr><tr><td>de C 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)</td><td>Molekula</td><td>31216368</td><td>4 ans</td></tr><tr><td>Sprague&ndash ; Rats Dawley&nbsp ;</td><td>Institut des pâturages (Téhéran, Iran)</td><td></td><td>300-350g</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>76-03-9</td><td>2 ans</td></tr><tr><td>Bupivacaïne HCl (0.5 %)</td><td>Delpharm Tours</td><td></td><td>ci-dessous&nbsp ; 25 &deg ; c</td></tr><tr><td>Bupernorphine</td><td>exir (Iran)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Di- Hydrogénophosphate de sodium</td><td>EMD Millipore&nbsp ;</td><td>231-448-7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>&nbsp ; 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>silicone(Xantopren)</td><td>Heraeus</td><td>EN ISO 4823</td><td></td></tr><tr><td>Activateur universel plus</td><td>Heraeus</td><td>66037445</td><td></td></tr><tr><td>Pince de micro-dissection</td><td>Stoelting</td><td>52100-41</td><td></td></tr><tr><td>Ressort Scisors</td><td>Stoelting</td><td>52130-00</td><td></td></tr><tr><td>Fonctionnement&nbsp ; Ciseaux</td><td>Roboz</td><td>52140-70</td><td></td></tr><tr><td>Matrice cérébrale&nbsp ;</td><td>Stoelting</td><td>51390</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie pour petits animaux |</td><td>&nbsp ; Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Système de laboratoire d’alimentation</td><td>AD Instruments</td><td>ML880</td><td></td></tr><tr><td>Débitmètre laser Doppler</td><td>AD Instruments</td><td>ML191</td><td></td></tr><tr><td>Système de retour d’information chauffant</td><td>Harvard Appratus</td><td>72-7560</td><td></td></tr><tr><td>Micro pince vasculaire</td><td>FineScience Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture Silk 5-0 Ethicon</td><td></td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture Ethilon 4-0&nbsp ;</td><td>Ethicon</td><td>EH6740G</td><td></td></tr></tbody></table>

une évaluation in vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Accident vasculaire cérébral ischémique entraîne un œdème cérébral vasogénique et crânien primaire subséquent, qui est véhiculé par la destruction de la barrière sang - encéphalique (BHE). Rats atteints d’accident vasculaire cérébral ischémique induit ont été mis en place et utilisés comme in vivo modèles pour enquêter sur l’intégrité fonctionnelle de la BHE. Détection par spectrophotométrie de bleu Evans (EB) dans les échantillons de cerveau avec une lésion ischémique pourrait fournir une justification fiable pour la recherche et le développement de nouvelles modalités thérapeutiques. Cette méthode génère des résultats reproductibles et s’applique à n’importe quel laboratoire sans un besoin d’équipement spécial. Nous présentons ici une orientation technique et visualisée sur la détection de l’extravasation de EB après induction d’AVC ischémique chez le rat.

Il n’y avait aucune différence significative au niveau de RB dans l’hémisphère droit par rapport à l’hémisphère gauche des rats opérés (1,06 ± 0,1 µg/g et 1,1 ± 0,09 µg/g, respectivement). Comme indiqué dans les Figures 2 a-2 b, induction d’ischémie transitoire (90 min d’ischémie / reperfusion 24h) due à une différence significative au niveau de RB (10,41 ± 0,84 µg/g, p &lt; 0,001) dans l’hémisphère gauche ischémique chez le rat, par rapport aux différents hémisp...

L’objectif global de cette procédure est de fournir une technique hautement reproductible pour évaluer in vivo la rupture de la barrière hémato - encéphalique dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

L’objectif global de cette procédure est de présenter une méthode hautement reproductible d’évaluation in vivo de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle réactif d’AVC ischémique. Ceci est accompli par l’induction d’un accident vasculaire cérébral ischémique à l’aide d’un filament intraluminal pour l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne du côté gauche du cerveau. L’étape suivante de la procédure est la canulation de la branche externe de la veine jugulaire et l’injection du colorant Evans Blue à la fin de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne et au début de la période de reperfusion.Vingt-quatre heures plus tard, sous anesthésie profonde, le système de circulation de l’animal est éliminé d’Evans Blue et le cerveau est retiré. Ensuite, deux hémisphères cérébraux sont séparés, homogénéisés et centrifugés, et finalement les surnageants des tissus sont utilisés pour mesurer la concentration d’Evans Blue avec un spectrophotomètre. Anesthésie et débitmétrie.Induisez l’anesthésie à l’aide de 4 % d’isoflurane et maintenez-la avec de l’isoflurane à 1,5 % dans un mélange de 70 % de protoxyde d’azote et de 13 % d’oxygène pendant toute la durée de la chirurgie. Plac

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Cette vidéo présente une procédure d’évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin EAE. Des colorants fluorescents de différentes tailles sont injectés rétro-orbitaire et circulent dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le plus petit colorant s’échappe par des interstices dans le tissu cérébral, tandis que le plus grand colorant n’y pénètre que si la perturbation est grave, en corrélation avec l’étendue des dommages à la barrière.

Détermination de la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide de colorants fluorescents dans un modèle murin EAE

Cette vidéo montre l’évaluation de la zone d’infarctus et de l’œdème cérébral dans des coupes de cerveau de rats soumis à une occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Les zones infarctus sont identifiées à l’aide de la coloration redox, tandis qu’un filtre bleu et une fonction de seuil dans le logiciel d’analyse d’images quantifient la zone d’infarctus et l’œdème dans l’hémisphère touché.

Mesure de la zone d’infarctus et de l’œdème cérébral dans le cerveau d’un rat après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne

Source : Kuts, R.  et al. Lésions cérébrales induites par laser dans le cortex moteur des rats. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’évaluation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) après une lésion cérébrale induite par laser chez des rats. Un colorant de pistage est injecté dans la veine de la queue, ce qui lui permet de circuler vers le cerveau et de s’infiltrer dans les tissus à travers la BHE endommagée. Le cerveau est ensuite extrait et traité pour libérer le colorant.

Évaluation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle de rat de lésion cérébrale induite par laser 

Rupture de la barrière hémato-encéphalique facilite la prestation de certains médicaments vers le cerveau. Mannitol livré intra-artérielle se rétrécit cellules entourant les vaisseaux sanguins afin de perturber physiquement la barrière.

Modèle Rat de rupture de la barrière hémato-encéphalique pour permettre ciblée Therapeutics neurovasculaire

Ce protocole décrit un préconditionnement hypoxique répétitif, ou de brèves expositions à une hypoxie systémique qui réduisent les volumes d’infarctus et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique suite à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Il détaille également la double quantification du volume de l’infarctus et de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique après un AVC afin d’évaluer l’efficacité de la protection neurovasculaire.

Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris

Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.

Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Ce protocole décrit une nouvelle technique de mesure des trois paramètres les plus importants des lésions cérébrales ischémiques sur le même ensemble d’échantillons de cerveau de rongeurs. L’utilisation d’un seul échantillon de cerveau est très avantageuse en termes de coûts éthiques et économiques.

Mesure de l’œdème cérébral post-AVC, de la zone infarctus et de la dégradation de la barrière céphalo-cérébrale dans un seul ensemble d’échantillons de cerveaux de rongeurs

Une méthode a été mise au point pour visualiser l’extravasation du colorant due à la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) en administrant deux colorants fluorescents à des souris à différents moments dans le temps. L’utilisation du glycérol comme cryoprotecteur a facilité l’immunohistochimie sur le même échantillon.

Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Les modèles in vivo chez le rat sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes pathologiques et les cibles thérapeutiques de l’AVC ischémique. Ce travail décrira la réalisation d’une coloration par immunofluorescence dans des coupes de cerveau infarctus après une occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) chez le rat.

Évaluation de la signalisation de la mort cellulaire par immunofluorescence dans un modèle d’AVC ischémique chez le rat

Découvrez une méthode in vivo pour évaluer la perturbation de la barrière hémato-encéphalique chez le rat après un accident vasculaire cérébral ischémique. Cette technique utilise le bleu d'Évans pour mesurer l'intégrité de la barrière et faciliter l'étude de nouvelles thérapeutiques neurologiques.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique (Vidéo) | JoVE Journal

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

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