Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

L’objectif global de cette procédure est de fournir une technique hautement reproductible pour évaluer in vivo la rupture de la barrière hémato - encéphalique dans les modèles de rat d’accident vasculaire cérébral ischémique.

L’objectif global de cette procédure est de présenter une méthode hautement reproductible d’évaluation in vivo de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle réactif d’AVC ischémique. Ceci est accompli par l’induction d’un accident vasculaire cérébral ischémique à l’aide d’un filament intraluminal pour l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne du côté gauche du cerveau. L’étape suivante de la procédure est la canulation de la branche externe de la veine jugulaire et l’injection du colorant Evans Blue à la fin de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne et au début de la période de reperfusion.

Vingt-quatre heures plus tard, sous anesthésie profonde, le système de circulation de l’animal est éliminé d’Evans Blue et le cerveau est retiré. Ensuite, deux hémisphères cérébraux sont séparés, homogénéisés et centrifugés, et finalement les surnageants des tissus sont utilisés pour mesurer la concentration d’Evans Blue avec un spectrophotomètre. Anesthésie et débitmétrie.

Induisez l’anesthésie à l’aide de 4 % d’isoflurane et maintenez-la avec de l’isoflurane à 1,5 % dans un mélange de 70 % de protoxyde d’azote et de 13 % d’oxygène pendant toute la durée de la chirurgie. Placez l’animal anesthésié en position couchée sur la couverture chauffante de contrôle par rétroaction et maintenez la température corporelle à une plage physiologique normale au moyen d’une sonde rectale reliée à cette unité de chauffage. Rasez la région chirurgicale du côté gauche du crâne et appliquez la solution de bétadine à l’aide d’un tampon de gaze pour désinfecter la peau.

Remplacez-le par un tampon stérile contenant 70 % d’éthanol et répétez les deux étapes avec trois cycles. Faites une incision cutanée d’un centimètre de long sur le crâne s’étendant du canthus latéral de l’œil gauche à la base de l’oreille gauche et disséquez le muscle temporal gauche pour exposer le crâne. Ensuite, découpez un petit trou à cinq millimètres sur le côté et un millimètre en arrière du bregma pour faciliter le placement de la pointe de la sonde crayon du débitmètre Doppler.

Tournez le rat de la position couchée à la position couchée, puis placez la sonde du crayon laser dans le trou du crâne précédemment percé pour surveiller le flux sanguin cérébral régional. Enregistrez le débit sanguin cérébral régional de référence de chaque animal et considérez-le comme une induction à 100 % de l’ischémie cérébrale focale. Rasez la région du cou et désinfectez la peau avec une solution de bétadine et 70 % d’éthanol.

Injecter 0,2 millilitre de bupivacaïne à 0,5 % par voie sous-cutanée dans le site chirurgical pour l’analgésie. Faites une incision chirurgicale de deux centimètres de long dans la surface ventrale du cou pour accéder à l’artère carotide commune gauche. Isolez l’artère carotide commune de l’aponévrose voisine et du nerf vague pour accéder à la bifurcation de l’artère carotide externe et de l’artère carotide interne.

Lister en permanence soit l’artère carotide commune gauche, soit l’artère carotide externe à l’aide d’une suture de sac 5-0 et disséquer l’artère carotide interne au niveau de l’artère ptérygo-palatine. Placez sans serrer une suture de sac 5-0 autour de l’artère carotide commune, puis clampez temporairement l’artère carotide interne avec un micro-clip vasculaire. Faites une petite incision sur l’artère carotide commune avant de placer l’attache lâche précédemment placée, puis insérez une suture en nylon enduite de silicone 4-0 dans l’espace luminal de l’artère carotide interne et resserrez la suture autour de l’artère carotide commune pour fixer la suture en nylon et empêcher les fuites de sang.

Retirez le micro-clip vasculaire de l’artère carotide interne. Ensuite, avancez le filament intraluminal recouvert de silicone jusqu’à observer une baisse marquée du flux sanguin cérébral régional qui indique une occlusion de l’origine de l’artère cérébrale moyenne. Notamment, l’occlusion de l’artère cérébrale médiale commence lorsqu’une diminution du flux sanguin cérébral régional de plus de 80 % est détectée.

Dans ce modèle, nous bloquons temporairement l’artère ptérygo-palatine à l’aide d’une micro-pince pour guider correctement le filament dans le trajet auriculaire. Notez que cette étape est très importante pour la réussite de l’occlusion de l’artère cérébrale médiale. Canulation de la veine jugulaire et injection d’Evans Blue.

Faites une incision longitudinale d’un centimètre dans le cou jusqu’au côté gauche de la ligne médiane, puis disséquez carrément le fascia superficiel pour accéder à la branche externe de la veine jugulaire gauche. Ensuite, ligaturez de façon permanente l’extrémité cornuelle de la veine jugulaire avec une suture de sac 5-0. Placez sans serrer deux attaches autour de la veine, puis clampez temporairement l’extrémité cardiaque de la veine jugulaire avec une micro-pince vasculaire.

Faites une petite incision sur la veine jugulaire à l’aide de deux sutures, puis insérez un cathéter rempli de sérum hépariné dans l’espace luminal de la veine et avancez-le d’environ 10 millimètres. Ensuite, resserrez les ligatures autour de la veine pour fixer le cathéter et éviter les saignements. Injectez une petite quantité de sérum pour éviter l’affaissement de la veine.

À la fin de la période ischémique, c’est-à-dire 90 minutes, commencez la reperfusion en retirant la suture intraluminale. Au début de la période de reperfusion, injectez lentement le colorant Evans Blue d’un millilitre par kilogramme de solution saline à 2 % sur une période de cinq minutes. Par la suite, lavez la canule par injection de 0,5 millilitre de solution saline normale et retirez la canule d’injection de la veine.

Notez le changement de couleur du tissu après l’injection d’Evans Blue. Enfin, suturez les incisions du cou et de la tête et placez l’animal dans une cage de récupération. Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

Après 24 heures de reperfusion, anesthésier profondément l’animal avec du thiopental de sodium. Ouvrez ensuite la cavité thoracique en faisant un petit trou sous le sternum. Faites une petite ouverture dans l’oreillette droite et injectez 250 millilitres de solution saline préchauffée par le ventricule gauche pendant 15 minutes pour éliminer Evans Blue de la circulation jusqu’à ce que la solution saline normale qui est laissée à l’extérieur de l’oreillette devienne incolore.

Retirez immédiatement le cerveau du crâne et placez-le dans la matrice cérébrale. Disséquez le bulbe olfactif et le cervelet, puis, à l’aide d’une lame de rasoir propre, séparez l’hémisphère droit du cerveau de l’hémisphère gauche le long de la ligne médiane. Pesez chaque hémisphère et homogénéisez-les séparément dans une solution saline tamponnée au phosphate de 2,5 millilitres, puis mélangez-le avec 2,5 millilitres d’acide trichloracétique à 16 % pendant deux minutes à l’aide d’une machine à vortex.

Centrifugez les échantillons de cerveau pendant 30 minutes et laissez-les refroidir au réfrigérateur pendant 10 minutes. Utilisez les surnageants pour estimer l’absorbance d’Evans Blue par un spectrophotomètre à 610 nanomètres. Des résultats représentatifs.

Chez les animaux opérés de manière fictive, la concentration en bleu d’Evans des tissus préparés pour les deux hémisphères du cerveau est très faible et il n’y a pas de différence significative entre eux. L’induction d’une ischémie sur 90 minutes suivie de 24 reperfusions a provoqué une augmentation significative des niveaux d’Evans Blue dans l’hémisphère lésé du cerveau chez les rats ischémiques. Collectivement, ces résultats indiquent que, dans des conditions normales, Evans Blue ne peut pas facilement traverser la barrière hémato-encéphalique pour entrer dans le parenchyme cérébral et que les agressions ischémiques cérébrales ont induit l’extravasation d’Evans Blue par une perméabilité interne de la barrière hémato-encéphalique.

La photographie montre le cerveau chez les animaux simulés et ischémiques. Notez que l’intensité de l’extravasation du bleu d’Evans dans le tissu cérébral de couleur bleue provient de l’étendue de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique dans l’hémisphère lésé. Conclusion. L’évaluation in vivo de la barrière hémato-encéphalique permet aux chercheurs d’étudier les mécanismes physiopathologiques possibles de l’œdème cérébral vasogénique induit par l’ischémie et de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques.

Cette technique est simple et fiable. Un chercheur doit prendre en compte certains points techniques pour améliorer encore les performances de la technique et s’assurer de sa précision. L’enregistrement constant du débit sanguin cérébral régional à l’aide d’un débitmètre laser Doppler et l’utilisation d’un filament recouvert de silicone peuvent augmenter le taux de réussite du MCAO et réduire le taux de mortalité.

La posologie et le moment de l’injection sont deux paramètres essentiels pour obtenir des résultats fiables en raison de la nature dynamique de la barrière hémato-encéphalique suite à des atteintes ischémiques.