Name: Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez la reconstruction d'un modèle tissulaire gingival inflammatoire 3D utilisant trois types de cellules humaines in vitro. Cette méthode avancée permet d'étudier la cicatrisation, la régénération tissulaire et de cribler des médicaments potentiels pour les maladies parodontales.

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Ce travail a été soutenu en partie par la société japonaise pour la subvention Promotion of Science (JSPS) pour la recherche scientifique (26861689 et 17 K 11813). Les auteurs tiennent à remercier M. Nathaniel Green pour la relecture.

Ce protocole est conçu pour créer des tissus gingivaux humains équivalents, blessure gingivale modèles et modèles de gingivite. Kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT) ont été gracieusement fournis du professeur Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Allemagne)7. Les fibroblastes gingivaux humains (HGFs) ont été isolés des tissus gingivaux selon les protocoles publiés précédemment8. Le consentement éclairé a été obtenu au préalable et l’étude a été approuvée selon les lignes directrices établies par le Comité d’éthique, l’Université dentaire Nippon School of Life Dentistry à Tokyo (numéro d’autorisation : NDU-T2012-35). Protocole, étapes 1-3 devraient être effectuées sous une hotte de culture cellulaire.
1. préparation du tissu humain 3D équivalents de la gencive (GTE) (Figure 1 a)
<ol><li>Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré MEM-alpha et tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO3 et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) dans un tube stérile de 15 mL de pipetage. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à utilisation.</li>
	<li>Placer les inserts de culture 24 puits (pore taille 3,0 µm) dans une plaque de 24 puits.</li>
	<li>
Enlever HGFs de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu de culture A (MEM-alpha + 20 % BF + 1 % GlutaMAX). Compter les cellules par un compteur de cellules Bürker-Türk.
	<ol>
<li>Extraire la quantité désirée de cellules (1-5 x105 cellules/mL), puis centrifuger pendant 4 min à 190 x g.</li>
		<li>Suspendre les cellules dans la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL du mélange cellulaire-collagène (0,5 à 2,5 x 105 cellules/puits) dans l’insert de culture sans produire toutes les bulles. Incuber le mélange pendant 10 à 30 min en atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C, pour coaguler le mélange dans un gel. NOTE : Ajouter le mélange de collagène dans le centre de l’insert de culture afin d’éviter la formation inégale de gel de collagène.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de culture dans le puits et 0,5 mL dans l’insert. Incuber la plaque de culture pendant 24 h ou toute la nuit dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	<li>Éliminer les cellules HaCaT de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu B (DMEM + 10 % BF + 1 % GlutaMAX) et compter les cellules non vides. Extrait la quantité nécessaire de cellules (1 – 5 x 105 cellules/mL) avec une pipette, centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules de B. moyen</li>
	<li>Retirez le support les inserts de culture, contenant le mélange de HGF-collagène, par aspiration. Ajouter 0,5 mL de suspension de cellules HaCaT (0,5 à 2,5 x 105 cellules/puits) sur le dessus le mélange de HGF-collagène. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit. Remarque : À ce moment, le milieu de la culture bien devrait être A moyen, tandis que le milieu dans le foyer de la culture devrait être moyen B.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec support KSR (milieu de culture Co) (MEM-alpha + 15 % KnockOut remplacement de sérum + 1 % GlutaMAX) + 5 % FBS. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans la culture bien et 0,5 mL dans le foyer de la culture. Incuber les cultures pendant 24 à 48 h.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec moyen KSR + 1 % FBS. Ajouter 1 mL dans la culture bien et 0,5 mL dans l’insert de la culture. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture dans la culture bien avec 0,7 – 1 mL de milieu KSR. Retirez complètement le milieu de l’insert de culture (la surface de culture doit être exposée à l’air). Incuber les cultures pendant 1 à 2 semaines. Modifier le milieu dans la culture bien deux fois par semaine. Remarque : Ne laissez pas la montée de niveau moyenne au-dessus de la surface de culture (la couche supérieure composée de kératinocytes). Gardez toujours la surface de culture sèche.</li>
</ol>2. préparation du GTE blessé (Figure 1 b)
<ol><li>Préparer un perforateur de tissus 1 à 3 mm de diamètre. Stériliser à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Poussez le perforateur de tissu perpendiculairement dans GTE environ 300 µm de profondeur et percer un trou dans le tissu pour simuler une blessure.</li>
	<li>À cette étape, utilisez le GTE blessé pour enquêter sur la régénération de tissus et la cicatrisation plaie. Vous pouvez également fixer GTE en utilisant la solution tampon neutre de 10 % de formol pour effectuer une analyse histologique.</li>
</ol>3. préparation du GTE inflammatoires (iGTE) (Figure 1 b)
<ol><li>Cultiver des cellules THP-1 selon le précédent rapport9.</li>
	<li>Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré RPMI 1640, tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO3 et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) et 10 ng/mL PMA. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Nombre 1-2 x 106 THP-1 cellules et centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules dans 1 mL de la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.</li>
	<li>Ajouter 10 – 30 µL THP-1-collagène mélange dans la zone blessé de GTE. Remplacer le milieu de culture à 0,7 – 1 mL de milieu KSR contenant 10 ng/mL de PMA.</li>
	<li>Incuber le mélange dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 72 h.</li>
	<li>Utiliser le modèle pour l’étude de gingivite ou parodontopathie (par exemple, ajouter potentiel anti-inflammatoire à iGTE pour voir ses effets sur la libération de cytokines10). Vous pouvez également omettre 72 h PMA-traitement, ajouter 2 µg/mL de LPS dans la culture et incuber le tissu dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 48 h11,12.</li>
</ol>4. fixation et immunomarquage de monter ensemble de GTE et iGTE Cultures
<ol><li>
Fixation des cultures.
	<ol>
<li>Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Laver les tissus 2 fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution tampon neutre de 10 % de formol à l’insert et 1 mL de la culture. Laisser la plaque 24 puits dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.</li>
		<li>Enlever la solution de tampon neutre de formol 10 % le lendemain.</li>
		<li>Pour toute monture immunostaining, laver les tissus 3 - 4 fois avec du PBS après fixation.</li>
		<li>Pour l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et immunostaining régulière, procéder avec déshydratation, enrobage de paraffine et de sectionnement. Remarque : Pour toute monture immunostaining, cette étape peut être omise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toute monture immunostaining Remarque : Ce protocole a été modifié de celle de référence 13.<ol>
<li>Laver les tissus 3 x dans du PBS 0,5 – 1 % Triton, 10 – 30 min chaque fois.</li>
		<li>Incuber les tissus deux fois pendant 30 min dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA), à la température ambiante.</li>
		<li>Laver les tissus 2 × dans un tampon bloquant, 5 – 10 minutes chaque fois.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de solution d’anticorps primaire à la dilution/concentration requise pour les inserts. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.</li>
		<li>Incuber le tissu pendant 1 à 2 jours à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les tissus 3 fois, pendant 30 min dans du PBS 1 % Triton + 10 % de BSA. Lavez à nouveau 3 fois, pendant 5 min dans du PBS 1 % Triton.</li>
		<li>Ajouter 50 µL d’anticorps secondaire dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA) et 5 µL de solution de Hoechst 33342 (tache NucBlue vivre cellule) à chaque insertion. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.</li>
		<li>Incuber pendant 1 à 2 jours à 4 ° C. Enrouler la plaque 24 puits dans une serviette de papier humide et puis le mettre dans un paquet en plastique à utiliser tout au long de l’incubation.</li>
		<li>Laver les tissus 3 fois, pendant 10 min dans triton de PBS 1 %</li>
		<li>Utilisez une aiguille fine pour couper la membrane de l’insert de culture pour obtenir le tissu. Placer la membrane sur une lame. Remarque : Le tissu doit être sur la membrane.</li>
		<li>Ajouter 2 à 3 gouttes de milieu de montage de fluorescence. Couvrir le tissu avec une lamelle couvre-objet et conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à l’analyse.</li>
		<li>Découvre les tissus avec un laser confocal, microscopie (LSM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2017).</li>
<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole est basé sur les méthodes de création d’équivalents de tissu gingival et les équivalents de-le tissu adipeux sous-cutané décrits par les précédents rapports8,21,22. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et facile, certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le mélange collagène doit être maintenu sur la glace jusqu'à l’utilisation afin d’éviter la formation de gel dans la solution. Lorsque...

Les maladies parodontales sont la principale cause de la perte des dents chez les adultes. La gingivite et la parodontite est des maladies parodontales les plus courantes. Les deux induite par le biofilm aiguës ou chroniques inflammatoires changements actuels dans la gencive. La gingivite est caractérisée par une inflammation aiguë, tandis que la parodontite se présente généralement comme une inflammation chronique. Sur le plan histologique, les composantes bactériennes déclenchent l’activation des cellules immunitaires, tels que les macrophages, lymphocytes, plasmocytes et mastocytes1,2. Ces cellules immunitaires, en particulier les macrophages, interagissent avec les cellules locales (y compris les cellules épithéliales gingivales, fibroblastes, cellules endothéliales et les ostéoblastes) entraînant des lésions inflammatoires dans les tissus parodontaux3,4. Modèles expérimentaux de maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux, comme les rats, hamsters, lapins, furets, chiens et des primates. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments des maladies parodontales5. Co-culture de bactéries parodontales et cellules épithéliales humaines orale de monocouche a été utilisé pour étudier le mécanisme de l’infection parodontale6. Néanmoins, des cultures monocouches de cellules par voie orale n’ont pas l’architecture cellulaire d’en trois dimensions (3D) de tissus intacts ; par conséquent, ils ne peuvent pas imiter la situation in vitro .
Ici, équivalents 3D inflammatoires des tissus humains de la gencive (iGTE) sont mis en place pour représenter les maladies parodontales in vitro. Ce modèle 3D des maladies parodontales occupe une position intermédiaire entre des cultures monocouches de cellules et des modèles animaux. Trois types de cellules humaines, y compris HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, sont conjointement cultivés sur gel de collagène et stimulées par les initiateurs inflammatoires de construire iGTE. IGTE simule étroitement les conditions in vivo de la différenciation cellulaire, interaction cellule-cellule et activation des macrophages dans la gencive. Ce modèle a de nombreuses applications possibles pour drogue préliminaire et d’essai de nouvelles approches pharmacologiques dans les maladies parodontales, ainsi que pour analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires dans la guérison des blessures, l’inflammation et la régénération des tissus.

<table><tbody><tr><td>Collagène de type I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>Pour la fabrication du derme de GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Insert de culture cellulaire (pour plaque de 24 puits), taille des pores 3,0 &mu ; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Réactif de culture cellulaire</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Réactif de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Perforateur de tissus</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Pour perforation de trous dans GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (coloration NucBlue Live Cell)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Pour le marquage des noyaux</td></tr><tr><td>Milieu de montage par fluorescence</td><td>Dako</td><td></td><td>Pour le montage d’échantillons après immunomarquage</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytokératine 8+18 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Pour l’identification de l’épithélium</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Pour l’observation de la surface, de la topographie et de la composition des échantillons</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser</td><td>LSM 700 ; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Pour l’observation de la coloration par immunofluorescence des échantillons</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytokératine 19</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Pour l’identification de l’épithélium</td></tr><tr><td>Anticorps anti-vimentine</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Pour l’identification des fibroblastes et des macrophages activés</td></tr><tr><td>Anticorps anti-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Pour l’identification des fibroblastes dans le derme</td></tr><tr><td>Anti-CD68 anticorps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Pour l’identification des macrophages</td></tr><tr><td>Anticorps CD14 humains</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Pour l’identification des macrophages</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin secondaire conjugué Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Pour la coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris secondaire conjugué Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Pour la coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Système d’imagerie cellulaire EVOS FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour l’observation de la coloration par immunofluorescence de l’échantillon des</td></tr><tr><td>cellules THP-1</td><td>Banque de cellules BRC Riken</td><td>RCB1189</td><td>Pour la fabrication de l’iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Pour différencier les cellules THP-1</td></tr></tbody></table>

dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Les maladies parodontales (telles que la gingivite et la parodontite) sont les principales causes de la perte des dents chez les adultes. Inflammation de la gencive est la fondamentale physiopathologie des maladies parodontales. Les modèles expérimentaux actuels des maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments pour les maladies parodontales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour reconstruire les équivalents humains inflammatoires des tissus de la gencive (iGTE) in vitro. Nous avons tout d’abord créer des équivalents de tissus humains de la gencive (GTE) en utilisant deux types de cellules humaines, y compris les fibroblastes gingivaux humains (HGF) et les kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT), dans des conditions en trois dimensions. Nous créons un modèle de la plaie à l’aide d’un perforateur de tissu pour percer un trou dans le GTE. Ensuite, humaines monocytes THP-1 mélangés avec du gel de collagène sont injectées dans le trou dans le GTE. Par adimistration de 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 72 h, THP-1 cellules se différencient en macrophages aux foyers inflammatoires de la forme en GTE (iGTE) (IGTE peut également être stumilated avec 2 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 h initier l’inflammation ). IGTE est le premier modèle in vitro de la gencive inflammatoire utilisant des cellules humaines avec une architecture en trois dimensions. IGTE reflète des changements pathologiques principaux (immunocytes activition, interactions intracellulaires chez les fibryoblasts, les cellules épithéliales, les monocytes et les macrophages) dans les maladies parodontales. GTE, GTE blessé et iGTE utilisable comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et médicaments potentiels écran des maladies parodontales.

Cellules HaCaT affichent la morphologie typique de kératinocytes sous observation au microscope à contraste de phase (Figure 2 a). Images de scanner électronique microscopiques (SEM) ont montré que les surfaces de cellules HaCaT étaient couverts de nombreuses microvillosités. Liens intercellulaires entre les cellules HaCaT ont été véhiculées par des procédés à membranes (Figure 2 b). HaCaT cellules expriment l’épithélium gingival...

L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.

Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

L’objectif global de cette expérience est de reconstruire un modèle 3D de tissu gingival inflammatoire en utilisant trois types de cellules humaines in vitro. Cette méthode peut aider à étudier la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, l’inflammation et à dépister les médicaments potentiels pour les maladies parodontales. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit de la première méthode permettant de construire un modèle in vitro de gencive inflammatoire à l’aide de cellules humaines à l’architecture tridimensionnelle.Dans un tube stérile de 15 millilitres, ajoutez du collagène de type I-A, 10 % de MEM-alpha concentré et 10 % de tampon de reconstruction. Ensuite, laissez le mélange de collagène sur de la glace jusqu’à la prochaine utilisation. Ensuite, positionnez les inserts de culture à 24 puits avec des pores de trois micromètres dans une plaque de culture à 24 puits.Ensuite, utilisez une solution de trypsine-EDTA à 25 % pour détacher les EFC de la fiole de culture. Ensuite, suspendez les cellules détachées dans 10 millilitres de milieu de culture. Ensuite, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules Burker-Turk.Après avoir isolé le nombre de cellules souhaité, centrifugez les cellules à 190 fois g pendant quatre minutes. Ensuite, suspendez la pastille cellulaire avec la solution de collagène et laissez le tube sur de la glace. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de mélange cellule-collagène dans l’insert de culture sans produire de bulles d’air.Ensuite, incubez l’insert de culture avec le mélange cellule-collagène à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu de culture dans le puits et 5 millilitres de milieu dans l’insert. Ensuite, incubez la plaque de culture à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une journée.Ensuite, utilisez 25 % de solution de trypsine-EDTA pour détacher les cellules HaCaT de la plaque de culture. Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de milieu B aux cellules. Ensuite, comptez le numéro de portable.Après avoir isolé le nombre de cellules souhaité, centrifugez les cellules à 190 fois g pendant quatre minutes. Après la centrifugation, dissolvez la pastille cellulaire dans le milieu B.Ensuite, aspirez le milieu de l’insert de culture. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de suspension de cellules HaCaT sur le mélange HGF-collagène.Laissez l’insert de culture dans l’incubateur pendant une journée. Le lendemain, remplacez le milieu de culture. Ajouter un millilitre de milieu de co-culture KSR complété par 5 % de sérum de veau fœtal dans le puits de culture et 5 millilitres dans l’insert de culture.Ensuite, incubez la plaque de culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu de co-culture KSR complété par 1 % de sérum fœtal. Retirez tout le milieu de culture de l’insert de culture et du puits de culture après 24 heures.Ensuite, ajoutez 7 à un millilitre de milieu KSR frais dans le puits de culture uniquement et continuez la culture pendant deux semaines. N’oubliez pas de bien changer de support dans la culture deux fois par semaine. Préparez un poinçonneur à mouchoirs d’un à trois millimètres de diamètre et stérilisez-le dans l’autoclave à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes.Après la stérilisation, poussez le poinçonneur de tissus perpendiculairement dans le GTE sur environ 30 micromètres de profondeur pour faire une plaie dans le tissu. Ensuite, mélangez 10 nanogrammes par millilitre de PMA, 10 % de tampon de reconstruction et 10 % de milieu RPMI concentré avec du gel de collagène de type I-A. Ensuite, laissez le mélange de collagène sur de la glace jusqu’à la prochaine utilisation.Ensuite, centrifugez les cellules THP-1 à 190 fois g pendant quatre minutes. Après la centrifugation, suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de solution de collagène et laissez-la sur de la glace. Ensuite, ajoutez 10 à 30 microlitres du mélange cellule-collagène THP-1 sur la zone blessée du GTE.Ensuite, remplacez le milieu de culture par un milieu KSR de 7 à un millilitre contenant 10 nanogrammes par millilitre de PMA. Ensuite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Pour caractériser la GTE reconstruite, une coloration H et E et une microscopie électronique à balayage sont effectuées.Les images montrent que GTE présente une structure tissulaire semblable à celle d’une gencive avec plusieurs couches d’épithélium et de lamina propria. Les images montrent également que les cellules HGF dans les GTE reconstruites présentent des caractéristiques morphologiques distinctes des fibroblastes entourés de fibres de collagène. Ensuite, une coloration par immunofluorescence est effectuée pour étudier l’expression des marqueurs dermiques et épithéliaux.Il s’agit de valider si GTE et iGTE ont les caractéristiques moléculaires de la véritable gencive inflammatoire humaine. Les images montrent que la vimentine et TE-7 sont fortement présentes dans la lamina propria de GTE. K19, un marqueur spécifique de l’épithélium jonctionnel dans la parodontite, bien que faiblement exprimé dans l’épithélium GTE, est assez fort dans l’épithélium iGTE.Enfin, afin de générer les foyers inflammatoires dans l’iGTE, des monocytes THP-1 traités par PMA sont injectés dans la zone blessée du tissu. 72 heures après le traitement par PMA, les cellules THP-1 sont différenciées en cellules de type macrophage. L’immunocoloration de l’ensemble a confirmé que ces cellules expriment deux marqueurs macrophages importants, CD14 et la vimentine, et ont formé les foyers inflammatoires.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre semaines si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter la contamination. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme l’utilisation du LPS pour stimuler les réponses inflammatoires, peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires, comme comment induire une inflammation par le biais des interactions hôte-biofilm.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’inflammation, de la régénération des tissus et de la cicatrisation des plaies pour explorer le mécanisme cellulaire et moléculaire et dépister des médicaments potentiels pour les maladies parodontales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un modèle 3D de tissu gingival inflammatoire in vitro.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette étude décrit une technique efficace pour isoler et traiter des tissus gingivaux de la cavité buccale de la souris afin de produire une culture unicellulaire. Les cellules obtenues peuvent en outre être utilisés pour l'analyse par cytométrie en flux et des études moléculaires.

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génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

L’objectif de ce protocole est de construire un équivalent tridimensionnel de la peau de pleine épaisseur, qui ressemble à une peau naturelle. Grâce à un dispositif de plaie automatisé spécialement conçu, des plaies précises et reproductibles peuvent être générées en cas de maintien de la stérilité.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

Ce manuscrit décrit la production, la caractérisation et les utilisations potentielles d'une ingénierie tissulaire de construction de l'œsophage 3D préparé à partir de fibroblastes humains primaires normale de l'œsophage et les cellules épithéliales squameuses ensemencées dans un échafaudage porcine de-cellularisée. Les résultats mettent en évidence la formation d'un épithélium stratifié mûr similaire à l'oesophage humain normal.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.

L&#39;isolement, la caractérisation et de l&#39;examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

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Une nouvelle approche pour la surveillance de néovascularisation de la greffe dans la gencive humaine

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Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

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Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

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Découvrez la reconstruction d'un modèle tissulaire gingival inflammatoire 3D utilisant trois types de cellules humaines in vitro. Cette méthode avancée permet d'étudier la cicatrisation, la régénération tissulaire et de cribler des médicaments potentiels pour les maladies parodontales.

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