Agrégation de récepteur de Surface cellulaire microscopie confocale révèle par spectroscopie de corrélation d’Image

L’objectif global de ce protocole de spectroscopie de corrélation d’images est de fournir une méthodologie accessible pour la quantification des événements de regroupement se produisant à la surface de la cellule. Les anticorps qui se lient aux récepteurs à la surface des cellules peuvent conférer des altérations de confirmation et de regroupement. L’analyse de ces processus dynamiques est importante pour la caractérisation des cibles médicamenteuses.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthodologie accessible pour la quantification des événements de clustering à la surface de la cellule à l’aide d’appareils d’imagerie facilement accessibles. Pour commencer, ensemencez 10 000 cellules de carcinome épidermoïde A431 dans chaque puits d’une lame d’imagerie à huit chambres. Le lendemain, ajoutez 100 nanogrammes par millilitre de ligand EGF immédiat aux cellules afin de stimuler l’agrégation des récepteurs EGF.

Incuber les cellules avec le ligand à température ambiante pendant 10 minutes avant de les fixer. Ensuite, suivez le protocole d’immunocytochimie et d’imagerie confocale dans le protocole de texte qui l’accompagne, en accordant une attention particulière aux paramètres utilisés lors de la collecte, et chargez les ensembles de données acquis dans Fidji. La sursaturation doit être évitée.

Les images finales doivent contenir des pixels de moins de 1 micron carré. De plus, capturez une surface plane sur la surface apicale ou basale ainsi qu’une région acellulaire pour une normalisation ultérieure de l’échantillon. Commencez par identifier la région membranaire de surface apicale ou basale d’intérêt dans la première image.

Sélectionnez une taille de pixel de 2 puissance n dans la plage de 256 par 256, 128 par 128 ou 64 par 64. Ensuite, allez dans le menu de l’image et sélectionnez Dupliquer. Ensuite, allez à l’analyse, puis aux mesures.

Calculez l’intensité moyenne de la zone cultivée d’intérêt. Maintenant, identifiez une région d’arrière-plan de la même taille que l’image d’origine. Dupliquez-le comme précédemment.

Et calculez l’intensité moyenne de la zone d’intérêt recadrée en arrière-plan. Une fois la zone d’intérêt et l’arrière-plan mesurés, accédez à Traiter et sélectionnez Calculateur d’image. Placez la zone d’intérêt en tant qu’Image 1 et l’image d’arrière-plan en tant qu’Image 2, puis sélectionnez Soustraire comme opération.

Ensuite, allez dans le menu du processus. Descendez dans FFT et sélectionnez FD Math. Dans la boîte de dialogue mathématique FFT, sélectionnez Entrez les images comme indiqué ici et définissez l’opération sur corrélation.

Assurez-vous que la transformation inverse est activée. Normalisez l’image résultante en sélectionnant processus, en faisant défiler jusqu’aux mathématiques, en sélectionnant diviser et en entrant le nombre total de pixels dans la boîte de dialogue. Ensuite, normalisez à nouveau en divisant par l’intensité moyenne de la zone recadrée normalisée au carré.

Ensuite, tracez une ligne à travers la fonction d’étalement de points. Tracez le profil de cette ligne pour calculer la valeur maximale en allant dans l’analyse et en sélectionnant Tracer le profil. Calculez les grappes par surface de faisceau en transférant la valeur de crête dans une feuille de calcul.

Définissez ensuite les grappes par surface de faisceau sur un sur la valeur de crête moins un. Afin de traiter les images par lots, il est recommandé d’établir une macro Fidji. Cela permet une analyse cohérente et rapide de plusieurs images confocales pour l’analyse par spectroscopie de corrélation d’images.

Pour établir une macro pour le flux de travail de spectroscopie de corrélation d’images, configurez le programme pour qu’il enregistre chaque commande de menu dans le protocole. Pour cela, allez dans les plug-ins, jusqu’à marcos, et sélectionnez enregistrer. Ensuite, retournez à la fenêtre principale et exécutez le protocole décrit dans la section précédente de cette vidéo.

Lorsque vous avez terminé, revenez à la fenêtre de macro et sélectionnez créer pour générer une macro. Ensuite, dans la fenêtre d’édition de macro, assurez-vous de sélectionner la langue comme macro LJ1. S’il n’est pas sélectionné, le programme ne pourra pas s’exécuter.

Enfin, enregistrez la macro. La fonction de transfert optique d’un microscope garantit que même les objets de taille moléculaire apparaissent sous forme d’images entre 200 et 300 nanomètres dans le plan XY. En imageant les billes de fresine de sous-résolution de la même manière que les cellules comme décrit dans ce protocole, l’aire de la fonction d’étalement du point du microscope peut être calculée.

Ces images représentent des cellules de carcinome épidermoïde A431 adhérentes stimulées par l’EGF et non simulées, marquées avec un anticorps primaire cetuximab ciblant le récepteur EGF de surface cellulaire. Les cases jaunes représentent la membrane cellulaire contenant des régions cultivées dont les dimensions en pixels sont de 64 x 64. Ces images ont été utilisées pour effectuer une analyse par spectroscopie de corrélation d’images.

Après normalisation de la fonction d’autocorrélation, la fonction d’étalement de points peut être mesurée à l’aide de l’outil ligne. Le profil de cette fonction linéaire est tracé pour détecter la valeur maximale. En utilisant ces méthodes, il a été observé que la stimulation par EGF induisait une diminution de 2,56 fois des grappes EGFR détectées par zone de faisceau par rapport aux cellules non stimulées.

Une fois maîtrisée, l’analyse de vos images confocales ne vous prendra que quelques minutes par image. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de collecter plusieurs répétitions de chaque condition expérimentale en utilisant les paramètres décrits dans ce protocole. À la suite de cette procédure, la spectroscopie de corrélation d’images peut être étendue pour explorer les changements temporels des événements de regroupement dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à intervalle de temps.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des états d’agrégation d’ordre supérieur à l’aide de l’ICS par photoblanchiment et de la co-localisation de deux protéines membranaires à l’aide de méthodologies de spectroscopie de corrélation croisée d’images. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de calculer l’état de regroupement de votre molécule de surface cellulaire d’intérêt.