Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

L’objectif global de cette étude est d’étudier les effets ostéoinducteurs de la vitamine D sur des cellules souches mésenchymateuses cultivées qui ont été récoltées dans le périoste alvéolaire dentaire. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses est une grande avancée en dentisterie au cours de la dernière décennie. Ils ont été isolés et cultivés avec succès à partir de nombreuses parties du tissu dentaire.

L’objectif est cependant d’isoler et de cultiver des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire et d’étudier le potentiel ostéo-inducteur du composé de vitamine D. D’une manière générale, les personnes novices en la matière auront du mal à cause de la nouvelle idée de la formation osseuse dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées du périoste alvéolaire. La démonstration de la procédure par le personnel du laboratoire sera Mlle Hsin-Wen Chi.Elle

est une assistante de recherche de mon laboratoire. Pour commencer, prélevez les tissus périostés des patients lors d’une chirurgie dentaire à l’aide d’un séparateur périosté. Collectez des tranches d’environ deux par cinq millimètres.

Conservez les tranches de tissu dans le DPBS avec des antibiotiques. Au laboratoire, utilisez un scalpel pour hacher soigneusement les fragments de tissu périosté alvéolaire dans les 24 heures suivant le prélèvement. Ensuite, cultivez le tissu sur des boîtes de Pétri de 35 millimètres dans le milieu de culture approprié.

Utilisez un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Trois jours plus tard, jetez les tissus périostés collectés et changez de milieu. Lorsque les cellules ont proliféré à environ 80 % de confluence, détachez les cellules cultivées en ajoutant de la trypsine.

Et l’incubation de la culture pendant trois minutes. Après cela, ajoutez 0,8 millilitres de milieu pour terminer le détachement. Après avoir collecté et compté, répartissez 5 000 cellules dans un millilitre par plaque.

Marquez les cellules plaquées comme passage un à ce stade. Cultivez ces cellules et séparez-les à nouveau après qu’elles aient proliféré à 80 % de confluence. Le support à passage est initialement de couleur orange/rouge.

Lorsque le milieu commence à devenir orange trois jours plus tard, changez-le. Lorsque le passage d’une cellule atteint 80 % de confluence, créez les cellules de la deuxième à la cinquième génération en répétant les mêmes procédures que celles utilisées pour préparer la génération zéro à la première génération. Changez de milieu deux fois par semaine.

Quatre semaines plus tard, évaluez le potentiel des cellules à se différencier en une lignée ostéogénique en observant la morphologie des cellules au microscope. Écassez les cellules à l’aide d’un test de von Kassa. Ce dosage permet de distinguer la présence de dépôts calcifiés dans votre culture.

Lavez les cellules avec du PBS et fixez-les pendant 30 minutes dans un millilitre de formol à 10 %. Après cela, retirez le formol, puis lavez les cellules et traitez-les avec du nitrate d’argent à 5 %. Exposez les cellules à la lumière UV pendant une heure.

Ensuite, retirez le nitrate d’argent et traitez les cellules avec deux millilitres de sulfate de sodium à 5 % quatre fois pendant trois minutes à chaque fois. Remplacez la solution entre les traitements. Enfin, lavez les cellules deux fois avec de l’eau distillée.

20 des 34 échantillons de tissus périostés ont permis de trouver des colonies de cellules souches dérivées de la moelle osseuse. Aucun facteur lié aux donneurs n’a eu d’incidence significative sur le succès de l’élevage. Initialement, les PDC formaient des colonies et des amas sphériques avec un mélange de cellules rondes et en forme de fuseau.

Après le premier passage, les cellules étaient homogènes de type fibroblaste avec une forme de fuseau. À la fin de la différenciation ostéogénique, le dosage de von Kossa a indiqué la présence possible de dépôts de calcium et la différenciation ostéogénique. Ces résultats indiquent fortement que parmi les populations de cellules périostées, les cellules progénitrices possèdent le potentiel de se différencier en cellules ostéogéniques.

Les cellules précurseurs ostéogéniques ont également été traitées avec du calcitriol et examinées à l’aide de la RTPCR pour évaluer le niveau d’expression de la phosphatase alcaline, qui est un indicateur fort de la différenciation ostéogénique précoce des cellules. Le traitement de la vitamine C et du calcitriol, un métabolite actif de la vitamine D, a augmenté l’expression de la phosphatase alcaline. De plus, l’expression des niveaux d’ARNm de collagène un a augmenté en réponse aux mêmes traitements.

On a constaté que l’expression de l’ARNm de la sialoprotéine osseuse augmentait pour les cellules traitées avec une concentration plus élevée de calcitriol. Cependant, l’expression du CBFA one et de l’ARNm ostocalcique n’ont pas répondu aux traitements. Après avoir regardé cette vidéo, le public devrait avoir une bonne compréhension de la minéralisation et du protocole de culture du périoste alvéolaire humain.

Une fois maîtrisée, cette quête peut être réalisée en quatre à cinq semaines si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette expérience, il est important d’utiliser une technique prudente et stérile pour éviter la contamination de la cellule.