Name: Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humain et les effets de la vitamine D sur leur différenciation ostéogène. Cette méthode permet d'étudier l'expression des biomarqueurs mRNA pour les applications en dentisterie régénérative.

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L’Institutional Review Board a approuvé le protocole d’étude pour clinique recherche de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 4728B-101 et 103-4223C). Cette étude a été financée par Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 et NMRPG3C0151). Ce manuscrit a été édité par Wallace édition académique.

Le protocole de l’étude a été approuvé par le Conseil institutionnel d’examen de Chang Gung Memorial Hospital. Tous les participants eu consentement éclairé.
1. préparation du tissu
<ol><li>Récolter les tissus périostique de patients au cours de la chirurgie dentaire (Figure 1). Après réflexion de Rabat sous anesthésie locale, prenez un morceau de tissu du périoste de l’os alvéolaire, à l’aide d’un séparateur périostique31.</li>
	<li>Après la récolte, rangez les tranches de tissus périostique d’environ 5 mm x 2 mm dans de Dulbecco tamponné phosphate salin (SPD) avec 300 U/mL de pénicilline et 300 mg/mL de streptomycine. Transférer les tissus au laboratoire dans les 24 heures.</li>
	<li>Émincer les fragments de tissus périoste alvéolaire avec scalpels jusqu'à ce que bien hachées et de conserver les échantillons dans un milieu passage 0 (composé de 300 U/mL de pénicilline et de 300 mg/mL de streptomycine, α-MEM et 5 % sérum de veau fœtal [BF]) mis en culture dans un incubateur à 37 ° C avec air humidifié (5 % de dioxyde de carbone). Dans l’incubateur, préparer un bassin d’eau pour maintenir l’humidité.</li>
	<li>Changer le support après 3 jours et deux fois par semaine par la suite.</li>
	<li>Lorsque les cellules ont atteint préconfluence (80 %), libérer les cellules adhérentes avec 200 µL de 0,25 % de trypsine dans l’incubateur (37 ° C) pendant 3 min et ensuite utiliser 4,5 mL de milieu pour mettre fin à la réaction.</li>
	<li>Les cellules à nouveau dans un milieu frais passage 1 sur plaque (α-MEM, 10 % FBS, 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine 100 μg/mL). La plaque est de 5 × 103 cellules (comme comptées par un hémocytomètre).</li>
	<li>Effectuer chaque passage ultérieur après que les cellules atteindre 80 % confluence31. Remarque : Au début, le milieu sera rouge orange. Après environ trois jours, la couleur moyenne doit passer à une teinte jaunâtre. Le temps de doublement des cellules est d’environ 30 à 40 h, qui ont besoin de 7 jours pour 3 à 5 générations.</li>
	<li>Culture du PDC isolé en α-MEM additionné de 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2).</li>
	<li>Observer la croissance cellulaire par jour et remplacer le milieu de croissance deux fois par semaine. Utiliser des cellules de la troisième à cinquième-génération pour toutes les autres expériences.</li>
</ol>2. cytométrie en flux
<ol><li>1 × 106 cellules par l’intermédiaire de la digestion trypsique de récolte :<ol>
<li>Ajouter 200 µL de 0,25 % de trypsine. Après 3 min, utiliser 4,5 mL de milieu de culture contenant FBS pour mettre fin à la réaction de la trypsine et collecter par centrifugation (1500 tr/min, 5 min, 22 ° C).</li>
		<li>Laver les granules cellulaires trois fois à l’aide de 1 x DPBS. Remettre en suspension les cellules dans 200 µL 1 x tampon perméabilisation. Compter les cellules avec un hémocytomètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examiner les marqueurs de surface exprimées exprimés de la PDC à écoulement cytometry (fluorescence-lancée de cellules tri)32. Utiliser des anticorps monoclonaux (ACM) contre CD19 (isothiocyanate de fluorescéine (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (phycoérythrine [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) et HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>Ajouter les anticorps pour les échantillons et de la culture dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.</li>
		<li>Laver les cellules avec 1 x DPBS trois fois.</li>
		<li>Fixer les cellules à l’aide de 2 % de formaldéhyde et aller de l’avant avec écoulement cytometry analyse32.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fixation et viabilité avec ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques différenciation de cellules
Induire la différenciation dans les cellules en ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques lignages en cultivant des cellules périostique dans tous trois passages sur six plats avec les médias de différenciation spécifique.
<ol><li>Pour une différenciation ostéogénique, culture des cellules en α-MEM à une densité de 5000 cellules par puits sur plaques 6 puits culture.<ol>
<li>Sur la réalisation de confluence de 80 %, de la culture des cellules dans des milieux contenant 5 %, α-MEM FBS, β-glycérophosphate (10 mM), 10−7 M dexaméthasone (0,1 mM) et 5 mL d’acide ascorbique (100 uM). Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.</li>
		<li>Modifier les médias deux fois par semaine.</li>
		<li>Après 4 semaines, évaluer le potentiel des cellules à se différencier en une lignée ostéogénique par coloration des cellules à l’aide d’un test de von Kossa, qui distingue la présence de dépôts calcifiés dans une culture33.<ol>
<li>Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Moins de 30 min, ajouter 5 % de nitrate d’argent et de traiter sous lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h à température ambiante.</li>
			<li>Ajouter 5 % Na2donc4 quatre fois, permettant à 3 min de chaque réaction. Enfin, laver les cellules deux fois avec de l’eau distillée. NOTE : Von Kossa coloration est une réaction de précipitation où les ions d’argent et de phosphate réagissent en présence de matières acides ; Cette technique de coloration n’est pas spécifique au calcium. Dans cette étude, lorsque les cellules étudiées ont été traités avec la solution de nitrate d’argent, calcium — qui est réduite par la forte lumière UV — a été remplacé par l’argent, qui est devenue visible comme argent métallique.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la différenciation adipocytaire, la culture des cellules à une densité de 5000 cellules par puits sur des plaques de culture de six puits contenant des α-MEM.<ol>
<li>Sur la réalisation de confluence de 80 %, de la culture des cellules dans un milieu contenant des α-MEM, 5 % FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (100 mg/mL), 1 % de pénicilline, 10−6 M dexaméthasone (1 mM), l’insuline (5 mg/mL) et l’indométhacine (60 mM).</li>
		<li>Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.</li>
		<li>Après 6 à 9 semaines, utiliser huile O rouge pour colorer les cellules et de mettre en évidence les baisses de lipides, déterminant ainsi la présence de différenciation adipocytaire33:<ol>
<li>Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Moins de 30 min, détachant les cellules contenant 0,5 % d’huile rouge O à température ambiante pendant 10 min et puis laver les cellules trois fois avec de l’isopropanol 60 % pendant 3 min chaque fois ; Enfin, laver les cellules avec de l’eau distillée. Remarque : L’huile rouge O est un colorant diazoïque (liposolubles) de lysochrome utilisé pour la coloration des lipides neutres, principalement des esters de triacylglycérols, lipoprotéines et cholestérol. La teinture se dissout dans les gouttelettes de lipides dans la cellule, en tournant les gouttelettes lipidiques rouge.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la différenciation des chondrocytes, cellules de culture sur plaques 6 puits culture avec chaque cupule contenant 5000 cellules.<ol>
<li>Ajouter une différenciation moyenne contenant α-MEM, 5 % FBS, 10−7 M dexaméthasone (0,1 mM), le pyruvate de sodium (100 µg/mL), insuline-transferrine-sélénium-A (1 × STI), facteur de croissance transformant-β (10 ng/mL) et 5 mL d’acide ascorbique (100 µM).</li>
		<li>Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.</li>
		<li>Après 4 à 5 semaines, utiliser une coloration pour mettre en évidence les polysaccharides acides, tels que les glycosaminoglycanes ou certains types de mucopolysaccharides, dans le cartilage des cellules pour déterminer la présence de chondrocytes différenciation33bleu Alcian.<ol>
<li>Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Dans les 30 minutes, ajouter 3 % d’acide acétique et laisser 2 min pour la réaction. Par la suite, laver à l’eau distillée trois fois, ajouter 1 % bleu Alcian 8GX incubé pendant 30 min et puis laver à l’eau distillée. Enfin, ajouter l’acide acétique à 3 % et lavage pendant 3 min et puis laver à l’eau distillée pour finir. NOTE : Les parties de la cellule qui tachent plus précisément par ce colorant devient bleu à bleu-vert après coloration et sont appelés « alcianophilic ».</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. effets des 25-dihydroxyvitamine D3 (1,25-(OH)2D3) sur l’ostéogenèse
<ol><li>Diviser le P3 à P5 PDC en six groupes et culture sur plaques 6 puits avec différents milieux de culture :</li>
	<li>groupe négatif (α-MEM et 5 % FBS) ;</li>
	<li>Groupe de la vitamine C (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C) ;</li>
	<li>et 10−7 M 1,25-(OH)2D3 groupe (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).</li>
	<li>Ajouter 2 mL de milieu dans un incubateur (37 ° C) dans chaque puits et modifier le milieu deux fois chaque semaine.</li>
</ol>5. reverse Transcription/Quantitative PCR en temps réel
<ol><li>Après 7 jours de différenciation ostéoblastique, isoler l’ARN total sur la glace en utilisant un réactif commercial (voir Table des matières) :<ol>
<li>Ajouter 1 mL de réactif de l’isolement dans chaque puits. Ajouter 200 µL de bromochloropropane et laisser pendant 10 min générer des couches RNA et puis centrifuger à 10 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C.</li>
		<li>Après centrifugation, ajouter 500 µL de propanol-2 à 500 µL du surnageant contenant RNA. Précipiter l’ARN sur la glace et laisser 15 min pour la réaction.</li>
		<li>Après l’intervention, centrifuger à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C, après quoi l’ARN se trouve au fond du tube. Par la suite, retirez le surnageant à l’aide de 1 mL d’alcool à 75 % pour le lavage et centrifuger à 7 500 tr/min pendant 8 min à 4 ° C.</li>
		<li>Retirez le surnageant et utiliser une pompe à vide pour produire l’ARN à partir du fond du liquide. Récupérer l’eau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Marche arrière transcrire l’ARN (1 μg) à l’aide de myéloblastose aviaire virus la transcriptase inverse. Définir la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de fonctionner à 25 ° C pendant 10 min, suivie de 50 ° C à 60 min, puis 85 ° C pendant 5 min, avant de finalement conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Synthétiser les premier-brin d’ADN complémentaire (ADNc). Effectuer la PCR quantitative (qPCR) utilisant 5 μL de 01:10 dilué cDNA. Conduite de RT-PCR quantitative (qRT-PCR) en utilisant des amorces pour ALP, BSP, OCN, CBFA1 et collagène-1. Remarque : Pour éviter toute contamination de l’ADN par les signaux, les séquences avant et arrière de chaque amorce ont été conçus sur exons distinctes.</li>
	<li>Effectuer qPCR en utilisant un maître de PCR commercial mélanger (voir Table des matières) conformément aux instructions du fabricant. Définir le thermocycleur à 50 ° C pour 2 min suivie de 95 ° C pendant 10 min et puis 40 cycles chacun à 95 ° C pendant 15 s suivie de 60 ° C pendant 60 s. Remarque : Le protocole SYBR nécessite également une étape de courbe de fonte, exécutée à 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, puis à 95 ° C pendant 15 s.</li>
	<li>Normaliser les valeurs de seuil de cycle pour ALP, BSP, CBFA1, collagène-1 et OCN à celui du ménage gène GAPDH. 34
</li>
	<li>Paires d’amorces sont énumérés dans la Table des matières.</li>
</ol>6. alcaline Phosphatase activité
<ol><li>Évaluer l’activité enzymatique ALP des cellules à l’aide de la technique décrite précédemment35, qui convertit le p- nitrophényl phosphate de p- nitrophénol ; p- nitrophényl phosphate est un substrat de phosphatase qui vire au jaune quand déphosphorylé par ALP, tel que déterminé à une longueur d’onde de 405 nm. Normaliser le total p- nitrophénol formé basé sur les protéines totales, tel que déterminé par l’analyse de Bradford.</li>
	<li>Comparer les activités de l’ALP du contrôle (α-MEM, 5 % FBS), vitamine C (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM, 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3) et vitamine C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM, 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C +1,25-(OH)2D3) groupes après la semaine 1, 2, 3 et 4, de la culture.</li>
	<li>Effectuez une procédure d’extraction de protéine sur la glace :<ol>
<li>Grattez les cellules des plaques 6 puits et ajouter 50 µL de tampon de lyse. Par la suite, placer les cellules sur la glace pendant 30 min détruire les cellules et libérer la protéine.</li>
		<li>Après 30 min, centrifuger à 13000 tr/min à 4 ° C pendant 15 minutes. Après centrifugation, extraire le surnageant pour le stockage et l’utiliser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une modalité thérapeutique développée récemment, à savoir les tissus techniques entraînant MSCs, offre de nombreux avantages. MSCs, qui sont présents dans plusieurs types de tissus, sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en divers tissus mésodermiques fonctionnelle des cellules37 et autres cellules comme les ostéoblastes.
Le périoste sert une niche de cellules progénitrices et comme un approvisionnement riche vascularisation de l’OS, il enveloppe<su...

Bien que les nombreuses techniques pertinents ont été développés ces dernières années, os des restes de reconstruction limité par des contraintes multiples et estimer que l’étendue de la nécessaire reconstruction est souvent impossible. Augmentation des tissus-dur est requis pour atteindre les objectifs esthétiques et fonctionnels en plus un taux de réussite à long terme favorable. Méthodes couramment utilisées pour ces procédures comprennent une greffe osseuse autogène et allogène, xénogreffe et alloplastique une greffe osseuse. Parmi les différents types de greffe osseuse, greffe osseuse autogène est considérés comme les plus efficaces. Cependant, morbidité site donneur, vascularisation compromise et de disponibilité limitée de tissus1 ont été des inconvénients majeurs pour une greffe osseuse autogène. En outre, la greffe osseuse allogénique et xénogreffes ont été associés à la transmission de la maladie. Actuellement, les greffons osseux synthétiques sont largement utilisés pour résoudre ces problèmes. Cependant, avec leur manque de potentiel ostéogénique, résultats cliniques varient considérablement. Des matériaux tels que la cellulose sont associés aux fluctuations de volume, infection et un manque de force.
Augmentation osseuse à l’aide de génie tissulaire a suscité un vif intérêt. Dans cette technique, cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement utilisées pour promouvoir la différenciation ostéoblastique, qui sont ensuite repiqués sur le site de la perte osseuse pour réaliser la réparation osseuse. Cette procédure est actuellement appliquée en thérapie cellulaire. Réalisation de reconstruction osseuse par l’extraction d’une quantité limitée de tissus est plus simple et moins invasive par rapport aux autres méthodes.
Le rôle potentiel de MSCs comme un outil pour des thérapies à base cellulaire visant à régénération dentaire est un intérêt émergent entre les divers groupes de recherche. Des études ont confirmé que MSCs peuvent différencier les types de tissus : la moelle osseuse, membrane adipeuse, synovial, pericyte, l’OS trabéculaire, cordon ombilical humain et tissus dentaires2,3. Les sources communes de MSCs comprennent la moelle osseuse, tissu adipeux et les tissus dentaires. Comparé avec MSCs provenant du tissu adipeux et de la moelle osseuse, les avantages des cellules souches dentaires sont un accès facile et une morbidité moindre après la récolte. Par rapport aux cellules souches embryonnaires, MSCs provenant de tissus dentaires apparaissent nonimmunogenic et ne sont pas associées à des préoccupations éthiques complexes3.
En 2006, la société internationale de thérapie cellulaire recommandé d’utiliser les normes suivantes pour identifier les MSCs : tout d’abord, MSCs doivent être capables d’y attacher au plastique. Deuxièmement, MSCs doivent être positive pour les antigènes de surface CD105 CD73 et CD90 et négative pour les marqueurs pour les monocytes, macrophages et cellules B en plus des antigènes hématopoïétiques CD45 et CD344. Comme un critère final, MSCs doivent être en mesure de différencier en trois types de cellules dans des conditions normales de la différenciation in vitro : les ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes,4. A ce jour, six types de cellules souches dentaires humaines ont été isolés et caractérisés. Le premier type a été isolé à partir de tissu humain pulp, appelée pulpe dentaire postnatal cellules souches5. Par la suite, trois autres types de MSCs dentaires ont été isolés et caractérisés : cellules souches provenant de dents caduques exfoliée6, le ligament alvéolo-dentaire7et la papille apicale8. Plus récemment, de dérivés de follicule dentaire9, de dérivés de tissus gingivaux10, bourgeon dentaire tige cells(DBSCs)11et kyste périapical MSCs (hPCy-MSCs)12 ont également été identifiés.
Château Friedenstein fut le premier à définir MSCs13. MSCs présentent une prolifération haute potentielle et peuvent être manipulés pour différencier avant d’être transplanté, qui suggère qu’ils sont des candidats idéaux pour des procédures régénératrices10.
Bien que la plupart des études utilisent la moelle osseuse comme une source de cellules souches, cellules dérivées de périoste (PDC) ont également été récemment utilisé14. Le périoste est plus facilement accessible que ce qui est de la moelle osseuse. Par conséquent, dans cette technique, nous utilisons périoste alvéolaire pour éliminer le besoin pour les incisions supplémentaires pendant la chirurgie et à réduire la morbidité post-opératoires chez les patients. Le périoste est un tissu conjonctif qui forme la paroi extérieure des os longs et se compose de deux couches distinctes : la couche fibreuse externe composé de fibroblastes, collagène et fibres élastiques15et la couche intérieure riche en cellules cambium en contact direct avec la surface osseuse. La couche de cambium abrite une population de cellules mixtes, principalement les fibroblastes16, ostéoblastes17, péricytes18et une sous-population critique identifié sous MSCs19,20,21. La plupart des études ont rapporté que PDC est comparables, voire supérieurs, à des cellules souches issues de la moelle osseuse (BMSC) en os de guérison et de régénération22,23,24. Le périoste est facilement accessible et expositions excellente efficacité régénératrice. Cependant, peu d’études ont porté sur le périoste25,26,27.
Concernant la réparation osseuse, la pratique clinique actuelle implique la transplantation de cellules progénitrices périostique amplifié dans les échafaudages favorables. Des études récentes ont mis l’accent sur l’acquisition de cellules souches dans des régions défectueuses et utilisant des cellules souches pour la régénération de tissu20. Dentistes a également anticipent l’application future de la régénération osseuse parodontale en traitements parodontaux et implants dentaires. Au sujet du site donneur, le périoste peut être facilement récolté par les chirurgiens dentistes généraux. Cela se compare favorablement contre les cellules stromales de la moelle, comme le périoste sont accessibles au cours de la chirurgie buccale systématique. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’établir un protocole pour la récolte de PDC et d’évaluer la morphologie, la viabilité et la prolifération des cellules souches humaines périoste.
Métabolites de la vitamine D affectent l’in vivo minérale de l’OS équilibre dynamique. Une étude a indiqué que 24R,25-(OH)2D3 forme active de vitamine D est essentielle à la différenciation ostéoblastique des humains MSCs (CSM)28. L’homéostasie osseuse et la réparation sont réglementés par un réseau de vitamine D3 métabolites, dont 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) est la plus biologiquement active et pertinente dans la régulation de la santé des os. Vitamine D3 est essentiel pour la calcification29. Dans une étude sur des souris de Kunming blanc 2-d-ancien, les corps embryoïdes chez les souris ont indiqué que les suppléments de vitamine C et de vitamine D de promouvoir efficacement la différenciation des ostéoblastes dérivés ESC30. Parmi ses autres activités biologiques, 1,25-(OH)2D3 stimule la différenciation in vitro des CSM d’ostéoblastes, qui peuvent être surveillés basées sur l’augmentation dans l’activité de l’enzyme phosphatase alcaline (ALP) ou le gène de l’OCN expression.
Peu d’études ont détecté une relation dose-effet des traitements combinés avec la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 aux humains PDC en mettant l’accent sur l’ingénierie tissulaire osseuse. Par conséquent, dans cette étude, nous examinons les concentrations optimales pour un traitement simple ou combiné de 1,25-(OH)2D3 et vitamine C pour induire la différenciation ostéogénique du PDC humaine. Ce protocole vise à déterminer si une population de cellules isolée du périoste alvéolaire dentaire contient des cellules avec un phénotype MSC et de savoir si ces cellules peuvent être élargis dans la culture (in vitro) et différenciées pour former le tissu désiré . En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes. La deuxième partie de l’étude évalue les effets de la vitamine C et de 10−10, 10−9, 10−8et 10−7 M 1,25-(OH)2D3 sur l’activité ostéogénique du PDC. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer les fonctions de la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 au cours de la différenciation ostéoblastique des PDC par activité de l’ALP et pro-ostéogénique gènes, tels que de l’ALP, collagène-1, OCN, BSP et CBFA1. En outre, cette étude détermine les conditions optimales ostéo-inducteurs pour PDC humain basé sur ces résultats.

<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>2-phospho-L-ascorbique acide trisodique</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr> virus de <tr><td>la myéloblastose aviaire transcriptase inverse</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>facteur de liaison du noyau alpha-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>indométacine</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>insuline</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>insuline&ndash ; transferrin&ndash ; selenium-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td><td>Life</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp film adhésif optique</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR Master Mix</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td> Facteur de croissance <td>transformant</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>vie-&beta ;</td><td>Sigma</td><td>T7039° ;</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de trizol (pour l’isolement de l’ARN)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-glycérophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collagen-1</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>amorce avant 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' amorce inversée 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>amorce avant 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' amorce inversée 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'Amorces</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>ALP<td>commerciales CBFA1</td></tr></tbody></table>

isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine d sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont présentes dans divers tissus et peuvent être différenciés dans nombreux types de cellules, y compris les ostéoblastes. Parmi les sources dentaires de MSCs, le périoste est un tissu facile d’accès, ce qui a été identifié pour contenir les MSCs dans la couche de cambium. Toutefois, cette source n'a pas encore été largement étudiée.
Vitamine D3 et 1,25-(OH)2D3 ont été démontrés pour stimuler la différenciation in vitro de MSCs en ostéoblastes. En outre, vitamine C facilite la croissance cellulaire osseuse et de la formation de collagène. Cependant, aucune étude n’a encore étudié les effets de la vitamine D3 et la vitamine C sur MSCs.
Nous présentons ici une méthode permettant d’isoler les MSCs du périoste alvéolaire humaine et examiner l’hypothèse que 1,25-(OH)2D3 pourraient exercer un effet ostéo-inducteurs sur ces cellules. Nous avons également enquêter sur la présence de MSCs dans le périoste alvéolaire humaine et évaluer la prolifération et l’adhérence de cellules souches. Pour évaluer la capacité de la vitamine C (sous forme de contrôle) et de diverses concentrations de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8et 10−7 M) pour influer sur les biomarqueurs d’ARNm clés dans MSCs ARNm isolés de la phosphatase alcaline (ALP), OS sialoprotéine osseuse (BSP), liaison de base le facteur alpha-1 (CBFA1), collagène-1 et ostéocalcine (OCN) sont mesurés à l’aide de la PCR en temps réel (RT-PCR).

Pour tous les dosages quantitatifs, les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (SD). Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de Student t-test. Au total, 34 échantillons ont été obtenus avec un âge moyen de participants de 48,1 ± 12,3 y. onze de ces échantillons provenaient de patients de sexe masculin et 23 de patientes. Vingt-huit échantillons ont été prélevés les régions molaires et 6 par les régions antérieures ; 26 ont été extraites de la maxi...

Nous présentons un protocole visant à enquêter sur les biomarqueurs d’expression ARNm de cellules dérivées de périoste (PDC) induites par la vitamine C (vitamine C) et 1, 25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes.

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

L’objectif global de cette étude est d’étudier les effets ostéoinducteurs de la vitamine D sur des cellules souches mésenchymateuses cultivées qui ont été récoltées dans le périoste alvéolaire dentaire. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses est une grande avancée en dentisterie au cours de la dernière décennie. Ils ont été isolés et cultivés avec succès à partir de nombreuses parties du tissu dentaire.L’objectif est cependant d’isoler et de cultiver des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire et d’étudier le potentiel ostéo-inducteur du composé de vitamine D. D’une manière générale, les personnes novices en la matière auront du mal à cause de la nouvelle idée de la formation osseuse dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées du périoste alvéolaire. La démonstration de la procédure par le personnel du laboratoire sera Mlle Hsin-Wen Chi.Elle est une assistante de recherche de mon laboratoire. Pour commencer, prélevez les tissus périostés des patients lors d’une chirurgie dentaire à l’aide d’un séparateur périosté. Collectez des tranches d’environ deux par cinq millimètres.Conservez les tranches de tissu dans le DPBS avec des antibiotiques. Au laboratoire, utilisez un scalpel pour hacher soigneusement les fragments de tissu périosté alvéolaire dans les 24 heures suivant le prélèvement. Ensuite, cultivez le tissu sur des boîtes de Pétri de 35 millimètres dans le milieu de culture approprié.Utilisez un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Trois jours plus tard, jetez les tissus périostés collectés et changez de milieu. Lorsque les cellules ont proliféré à environ 80 % de confluence, détachez les cellules cultivées en ajoutant de la trypsine.Et l’incubation de la culture pendant trois minutes. Après cela, ajoutez 0,8 millilitres de milieu pour terminer le détachement. Après avoir collecté et compté, répartissez 5 000 cellules dans un millilitre par plaque.Marquez les cellules plaquées comme passage un à ce stade. Cultivez ces cellules et séparez-les à nouveau après qu’elles aient proliféré à 80 % de confluence. Le support à passage est initialement de couleur orange/rouge.Lorsque le milieu commence à devenir orange trois jours plus tard, changez-le. Lorsque le passage d’une cellule atteint 80 % de confluence, créez les cellules de la deuxième à la cinquième génération en répétant les mêmes procédures que celles utilisées pour préparer la génération zéro à la première génération. Changez de milieu deux fois par semaine.Quatre semaines plus tard, évaluez le potentiel des cellules à se différencier en une lignée ostéogénique en observant la morphologie des cellules au microscope. Écassez les cellules à l’aide d’un test de von Kassa. Ce dosage permet de distinguer la présence de dépôts calcifiés dans votre culture.Lavez les cellules avec du PBS et fixez-les pendant 30 minutes dans un millilitre de formol à 10 %. Après cela, retirez le formol, puis lavez les cellules et traitez-les avec du nitrate d’argent à 5 %. Exposez les cellules à la lumière UV pendant une heure.Ensuite, retirez le nitrate d’argent et traitez les cellules avec deux millilitres de sulfate de sodium à 5 % quatre fois pendant trois minutes à chaque fois. Remplacez la solution entre les traitements. Enfin, lavez les cellules deux fois avec de l’eau distillée.20 des 34 échantillons de tissus périostés ont permis de trouver des colonies de cellules souches dérivées de la moelle osseuse. Aucun facteur lié aux donneurs n’a eu d’incidence significative sur le succès de l’élevage. Initialement, les PDC formaient des colonies et des amas sphériques avec un mélange de cellules rondes et en forme de fuseau.Après le premier passage, les cellules étaient homogènes de type fibroblaste avec une forme de fuseau. À la fin de la différenciation ostéogénique, le dosage de von Kossa a indiqué la présence possible de dépôts de calcium et la différenciation ostéogénique. Ces résultats indiquent fortement que parmi les populations de cellules périostées, les cellules progénitrices possèdent le potentiel de se différencier en cellules ostéogéniques.Les cellules précurseurs ostéogéniques ont également été traitées avec du calcitriol et examinées à l’aide de la RTPCR pour évaluer le niveau d’expression de la phosphatase alcaline, qui est un indicateur fort de la différenciation ostéogénique précoce des cellules. Le traitement de la vitamine C et du calcitriol, un métabolite actif de la vitamine D, a augmenté l’expression de la phosphatase alcaline. De plus, l’expression des niveaux d’ARNm de collagène un a augmenté en réponse aux mêmes traitements.On a constaté que l’expression de l’ARNm de la sialoprotéine osseuse augmentait pour les cellules traitées avec une concentration plus élevée de calcitriol. Cependant, l’expression du CBFA one et de l’ARNm ostocalcique n’ont pas répondu aux traitements. Après avoir regardé cette vidéo, le public devrait avoir une bonne compréhension de la minéralisation et du protocole de culture du périoste alvéolaire humain.Une fois maîtrisée, cette quête peut être réalisée en quatre à cinq semaines si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette expérience, il est important d’utiliser une technique prudente et stérile pour éviter la contamination de la cellule.

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Rat MSC ont été isolés à partir des fémurs et tibias et ensuite enrichi par tri cellulaire magnétique. Cellules triées ont été confirmés pour l'expression des marqueurs de surface par cytométrie en flux. Ces cellules ont également été cultivées à une densité clonale pour former des colonies isolées et ensuite ces colonies ont été séparés par des cylindres de clonage.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel de différenciation vers la lignée ostéoblastique lorsqu’elles sont stimulées par des facteurs solubles ou des biomatériaux spécifiques. Ce travail présente une nouvelle option pour l’administration de CSM à partir de la membrane amniotique humaine (AM-hMSC) qui utilise la matrice osseuse bovine Nukbone (NKB) comme échafaudage.

Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse

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Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Cet article présente une méthode qui combine l’adhérence entière de moelle et le tri cytometry d’écoulement pour isoler, cultiver, trier, et identifier des cellules souches mésenchymateuses de moelle des mâchoires de rat.

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Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

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Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

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