Name: Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Découvrez une méthode d'amputation chimique du pharynx chez Schmidtea mediterranea utilisant l'azoture de sodium. Cette technique précise permet d'étudier la régénération et le rôle des cellules souches.

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Nous tenons à remercier Alejandro Sánchez Alvarado, qui ont soutenu l’optimisation initiale et le développement de cette technique. Travail en laboratoire de Carolyn Adler est pris en charge par les fonds de démarrage de l’Université Cornell.

1. préparation
<ol><li>
Préparation de l’eau planaria 17<ol>
<li>Maintenir les Platyhelminthes dans une solution de sel de X Montjuïc 1. Pour préparer planaire eau, faire des solutions mères de 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, KCl 1 M et 5 M de NaCl dans l’eau ultrapure. Filtre-stériliser avec un stockage à long terme de filterfor flacon de 0,2 µm. Remarque : Utiliser uniquement l’eau déionisée ultrapure (avec une résistivité de 18,2 MΩ à 25 ° C) pour préparer les sels de Montjuïc.</li>
		<li>Pour préparer un stock de 1 L de solution de sel de 5 X, mélanger 5 mL de 1 M CaCl2, 5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de MgCl2, 0,5 mL de KCl et 1,6 mL de 5 M des solutions de NaCl dans 900 mL d’eau ultrapure. Pour cette solution, ajouter 0,504 g de NaHCO3 et pour mélanger. Ajuster le pH à 7.0 avec l’acide chlorhydrique.</li>
		<li>Diluer ce 5 X solution mère à un 1 X travail de concentration dans l’eau ultrapure dans un contenant stérile comme une tourie de grande capacité (voir la Table des matières). Utilisez cette solution de X 1 pour maintenir les Platyhelminthes asexuées. Remarque : Comme alternative à la solution de sel de Montjuïc, utiliser l’eau de source achetés localement ou eau ultrapure contenant aquarium disponible dans le commerce du sel mélanger (voir Table des matières) à une concentration de of0.5 g/L18.</li>
		<li>Pour éviter une infection bactérienne dans la culture statique19, maintenir Platyhelminthes dans l’eau contenant un antibiotique. Préparer un 50 mg/mL de solution de sulfate de gentamicine dans de l’eau ultrapure et filtre-stériliser. Aux conteneurs où les animaux est entretenus, ajouter le sulfate de gentamicine à une concentration finale de 50 µg/mL (dilution 1 : 1000).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la purée de foie
	<ol>
<li>Platyhelminthes prospèrent sur une diète de bio, boeuf nourri à l’herbe du foie, foie frais d’achat et processus au sein de 24 h. Retirer la capsule membraneuse encapsulant le foie en décollant doucement. Couper le foie en cubes de 1 cm et utiliser une lame pour gratter et jeter toutes les artères et veines hépatiques.</li>
		<li>Faire macérer les morceaux de foie à l’aide d’un moulin ou un robot culinaire et ensuite passer à travers une passoire à filet alimentaire. Combiner dans des sacs de pâtisserie et répartir dans des seringues ou des plats de Pétri de 35 mm. Avant repas, centrifuger doucement pour enlever les bulles d’air.</li>
		<li>Stocker les aliquotes de foie à-80 ° C pendant jusqu'à une année et le dégel avant d’utiliser. Après décongélation, recongeler une fois toute foie reste ou conserver à 4 ° C pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entretien des animaux
	<ol>
<li>Platyhelminthes vont se développer et de réduire de différentes tailles selon la fréquence d’alimentation. Nourrir les Platyhelminthes toutes les deux semaines (une fois tous les 14 jours). Pour les cultures à long terme en vrac, utiliser des récipients en plastique de différentes tailles (voir Table des matières).</li>
		<li>Pour nourrir les animaux, utilisez une spatule métallique ou une pipette de transfert en plastique pour mettre une goutte de noisette de foie dans une boîte. Permettre aux animaux de manger pendant 1-2 h. sortir l’aliment restant avant de nettoyer la zone.</li>
		<li>Nettoyer les vers deux fois par semaine si nourris (une fois directement après le repas et une fois deux jours plus tard), ou une fois par semaine si non nourris. Pour nettoyer, évacuer l’eau dans un bécher en plastique soigneusement déversant de l’eau tout en conservant l’Australie dans la zone. Essuyez la surface de la boîte avec du papier absorbant, puis répéter sur tous les côtés jusqu'à ce que la zone est propre.</li>
		<li>Remplacer l’eau (à environ ¾ du volume de la boîte) et ajoute une concentration finale de 50 µg/mL de gentamicine. Ranger les animaux dans une armoire sombre ou dans un incubateur à 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélection de worms
	<ol>
<li>Sélectionnez vers qui ont été nourris de 5 à 7 jours avant. Remarque : Il est beaucoup plus difficile d’amputer déjà des vers qui ont été alimentés ces derniers temps (1 à 2 jours avant l’amputation). Animaux nourris est également plus sensibles à l’azoture de sodium.</li>
		<li>Sélectionnez vers qui sont d’environ 6 mm de longueur. Pour estimer la taille du ver, les transférer dans un plat de Pétri à l’aide d’une pipette en plastique. Placez une règle plate 6 po ou papier quadrillé 5 x 5 mm sous la boîte de Pétri et mesurez la longueur de la vis sans fin, alors qu’il se traîne. Remarque : Vers inférieurs à 6 mm de long sont plus difficiles à entraîner l’amputation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de l’azide de sodium
	<ol>
<li>Préparer une solution de 100 mM en dissolvant de sodium en poudre dans l’eau planaria azoture. Mise en garde : L’azoture de sodium est toxique et doit être manipulé avec soin. Ne pas jeter de l’azide de sodium dans les égouts. Après utilisation, ramasser séparément pour l’élimination comme déchets dangereux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pharynx Amputation
<ol><li>Lieu vers de terre dans un diamètre de 35 mm boîte de Pétri. Retirez soigneusement toute eau planaire de la capsule à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Remarque : Un maximum de 20 mm 6 vers peut être confortablement logé dans un plat de cette taille.</li>
	<li>Placer le plat sous le microscope puis réglez grossissement afin qu’on peut considérer simultanément vers plusieurs (par exemple 10 un grossissement de X). Remplacer l’eau planaire avec solution d’azoture de sodium 100 mM. Remarque : Pour un plat de Pétri de 35 mm, 5 mL environ d’azoture de sodium est suffisante. La solution devrait submerger complètement Platyhelminthes. Régler le volume de solution pour des plats plus que nécessaire.</li>
	<li>Surveiller les animaux sous le microscope et s’abstenir de passer le plat pendant les premières 3-4 min.</li>
	<li>Observer l’extrusion du pharynx au microscope ; le pharynx se dépassent de la poche pharyngée et étendre complètement (environ 1 mm de longueur) comme illustré à la Figure 1 b. Remarque : Il est important d’attendre que le pharynx a fini d’étendre complètement avant de poursuivre. Une fois que le pharynx se dégage de l’animal, extension complète prend environ 1 min.</li>
	<li>Utiliser une pipette de transfert en plastique pour gicler des animaux partout dans le plat. Aspirer les animaux dans la pipette et de les libérer par la force dans le plat une couple de fois. Si le pharynx est étirée, ce vigoureux pipetage provoquera à détacher.</li>
	<li>Vous pouvez également saisir le pharynx verticalement le long de sa longueur, ou horizontalement le long de sa circonférence à l’aide d’une paire de pinces fines (voir Table des matières) comme illustré à la Figure 1. Avec le pharynx pincé dans la pince, soulever l’animal vers le haut, vers le ménisque. L’animal est augmentée, tension superficielle provoque le pharynx de se détacher de l’animal. Remarque : Cette méthode peut servir pour enlever le déjà de petits animaux (1-3 mm de long) où tourbillonnant énergique n’est pas suffisant. Évitez de piquer ou autrement blessant le corps de l’animal.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert, déplacement d’animaux amputé d’un mets nouveau contenant de l’eau fraîche planaria.</li>
	<li>Une fois transférées, rinçage amputé animaux soigneusement dans l’eau planaria, complètement d’eau trois fois. Transfert à une autre boite contenant de l’eau planaria 50µg/ml de gentamicine. Remarque : Change de tampon complète au cours de ces trois lavages est essentielle pour garantir l’élimination de l’azide de sodium.</li>
	<li>Le lendemain, remplacer l’eau dans le plat avec de l’eau fraîche planaria contenant 50 µg/mL de gentamicine. Répéter tous les deux jours par la suite.</li>
</ol>3. évaluation de Pharynx enlèvement après Amputation
<ol><li>Examiner les animaux sous un microscope (avec un grossissement de X 10-20) pour déterminer si une tache sombre est apparue après suppression réussie du pharynx, comme illustré à la Figure 2 a.</li>
	<li>Vous pouvez également fixer et blanchir les animaux selon le protocole décrit par Pearson et al. 20. animaux de trempage pour la nuit en 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou streptavidine conjugué fluorescent (1 mg/mL dilué 1/500 à 1 X Phosphate Buffered Saline contenant 0,3 % Triton-X). Monter les animaux sur des lames en glycerol/20% 80 % 1 X Phosphate Buffered Saline et image sous un stéréomicroscope fluorescent (Figure 2 b). Remarque : Toutes les images de ce manuscrit ont été capturés sur un stéréomicroscope fluorescent avec un objectif X 1,0.</li>
</ol>4. évaluation de la régénération du Pharynx en mesurant le comportement alimentaire
<ol><li>
Préparation du foie
	<ol>
<li>Transférer la quantité requise de purée de foie dans une micro-centrifugeuse ou tube à fond conique. Tourner brièvement pour enlever les bulles d’air. Estimation du volume du foie et puis ajoutez l’eau planaria à 1/5 de son volume et 2 % du volume total de colorant alimentaire rouge. Par exemple, à 1000 µL du foie coller, ajouter 200 µL d’eau planaria et 24 µL de colorant alimentaire.</li>
		<li>À l’aide d’un pilon en plastique, la pointe de pipette ou la spatule métallique, bien mélanger jusqu'à ce que le colorant alimentaire est réparti uniformément dans la purée de foie. Tourner à nouveau brièvement. Purée de foie peut être conservée à 4 ° C pendant 24 h ou congelée en aliquotes à-80 ° C pour le stockage à long terme.</li>
		<li>Si les tests jusqu'à 25 animaux, préparer 25 µL de purée de foie par plat (environ 1 µL de purée de foie par animal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alimentation des animaux
	<ol>
<li>Sept jours après amputation chimique, transférer les animaux à une nouvelle boîte de Pétri. Si les tests animaux de 10-15, utilisez un plat 35 mm ; plus de 15 animaux devrait être testés dans un plat de Pétri de 60 mm. Garder les animaux dans l’obscurité, non perturbée, pendant environ 1 h avant repas.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux, d’augmenter la largeur d’une pointe de pipette P200 en taillant environ ½ cm de l’extrémité la plus étroite. Pipetter 25 µL de rouge de purée de foie dans le plat. Remarque : Tailler la fin rend pipetage la purée de foie visqueuse plus facile. Pour éviter que le foie flottant à la surface, toucher la pointe vers le bas du plat pendant la distribution.</li>
		<li>Que les animaux puissent se nourrir pendant 30 min.</li>
		<li>Marquer le nombre d’animaux qui ont mangé en plaçant les animaux sur fond blanc ou de les examiner au microscope avec un grossissement de X 10-20.</li>
		<li>Après l’alimentation, retirer le plat de foie et nettoyer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode d’ablation sélective du pharynx à l’aide de l’azide de sodium. Autres études ciblées ablation en Australie ont utilisé mis à jour le chirurgie pour enlever les photorécepteurs21 ou traitement pharmacologique pour l’ablation de neurones dopaminergiques22. Un avantage significatif de l’amputation chimique par rapport aux méthodes existantes, c’est qu’il ne nécessite pas de chirurgie. La structure rigide du pharynx par rapport au reste du corps ...

La régénération est un phénomène qui se produit dans tout le règne animal, avec une capacité régénératrice de régénération du corps entier à certains invertébrés aux capacités plus restreintes dans les vertébrés1. Remplacement des tissus fonctionnels est un processus complexe et implique souvent la restauration simultanée de plusieurs types de cellules. Par exemple, pour régénérer la branche salamandre, ostéoblastes, chondrocytes, neurones, muscles et les cellules épithéliales doivent être remplacé2. Ces types de cellules nouvellement généré doivent également s’organiser correctement pour faciliter la nouvelle fonction membre. Compréhension de ces processus complexes nécessite des techniques qui mettent l’accent sur la régénération des types spécifiques de cellules et de leur intégration dans les organes.
Une des stratégies employées pour simplifier l’étude des réponses régénératrices est l’ablation ciblée soit certains types de cellules ou plus grandes collections de tissus. Par exemple, chez le poisson zèbre, expression de la nitroréductase dans les types spécifiques de cellules conduit à leur destruction après application du métronidazole3,4. Chez les larves de drosophile , exprimant des gènes pro-apoptotiques sous tissu-spécifiques promoteurs peut sélectivement l’ablation des régions spécifiques du disque imaginal5,6. Deux de ces stratégies endommager rapide mais maîtrisé et ont servi à décortiquer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la régénération.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour enlever sélectivement un organe entier appelé le pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea. Platyhelminthes sont un modèle classique de la régénération, connue pour leur capacité régénératrice prolifique, où même infimes fragments peuvent repousser toute animaux 7,8. Ils ont une grande population hétérogène de cellules souches composée de cellules pluripotentes et lignée restreints progéniteurs9,10,11. Ces cellules prolifèrent et se différencient pour remplacer tous les tissus manquants, y compris le pharynx, les systèmes nerveux, digestifs et excréteurs et les muscle et les cellules épithéliales9,10,12. Alors que nous savons que ces cellules souches lancer régénération, nous ne comprenons pas complètement les mécanismes moléculaires qui chasser pour remplacer tous ces différents types de cellules. Méthodes blessantes définies qui déclenchent des réponses précises des cellules souches peuvent aider à délimiter ce processus complexe.
Le pharynx est un gros tube cylindrique requis pour l’alimentation et contient des neurones, les muscle, les cellules épithéliales et sécrétoire13,29. Normalement caché dans une poche sur la face ventrale de l’animal, il s’étend à travers l’unique corps de l’animal, ouvrant sur la détection de la présence de nourriture. Pour sélectivement amputer le pharynx, nous tremper Platyhelminthes dans un azoture de sodium appelé chimique un anesthésique couramment utilisé dans c. elegans14,15,16. Son utilisation en Australie a été signalée par Adler et al., en 2014,12. Quelques minutes d’exposition à l’azoture de sodium, Platyhelminthes extruder leur déjà, et en agitant doucement, le pharynx se détache de l’animal. Nous appelons cette perte complète et sélective du pharynx « amputation chimique ». Une semaine après l’amputation, un pharynx entièrement fonctionnel est restaurée12. Parce que le pharynx est nécessaire pour l’alimentation, régénération fonctionnelle peut être mesurée en surveillant le comportement alimentaire. Ci-dessous, nous décrivons le protocole d’amputation chimique et pour l’évaluation de la régénération du pharynx et la restauration du comportement alimentaire.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium anhydre (MgSO4)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&iuml ; c solution saline</td></tr><tr><td>Copolymère de polypropylène autoclavable Nalgene lowboy avec embout</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Stockage de l’eau</td></tr> de mer <tr><td>Instant Ocean Sea</td><td>Salt Spectrum Marques</td><td>Amazon</td><td>Planaria Eau</td></tr><tr><td>de gentamicine Gemini</td><td>Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Eau de Planaria</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71970</td><td>Hacher le foie&nbsp ;</td></tr><tr><td>Poches à douille jetables-16", paquet de 12</td><td>aliquotes de foie</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>Seringues de 5 mL</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Boîtes</td></tr><tr><td>de Pétri-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Contenants en plastique (différentes tailles)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Logement planaires en culture statique</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Pince Dumont, Style 5</td><td>Microscopie Electronique Sciences&nbsp ;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

amputation chimique et la régénération du pharynx dans le planaire schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Platyhelminthes sont vers plats qui sont extrêmement efficaces à la régénération. Ils doivent cette capacité à un grand nombre de cellules souches qui peuvent répondre rapidement à tout type de blessure. Modèles de lésion commune chez ces animaux retirer de grandes quantités de tissus, qui endommage plusieurs organes. Pour surmonter ces dommages de tissu large, nous décrivons ici une méthode pour supprimer sélectivement un organe unique, le pharynx, dans le planaire Schmidtea mediterranea. Nous y parviendrons par des animaux trempage dans une solution contenant de l’azide de sodium inhibiteur du cytochrome oxydase. Une exposition brève à l’azoture de sodium provoque extrusion du pharynx de l’animal, que nous appelons « amputation chimique. » Amputation chimique supprime le pharynx entier et génère une petite plaie où le pharynx s’attache à l’intestin. Après le rinçage approfondie, amputé de tous les animaux régénèrent un pharynx entièrement fonctionnel dans environ une semaine. Régénération du pharynx nouvelle en voiture des cellules souches dans le reste du corps. Ici, nous fournissons un détaillé protocole d’amputation chimique et décrire les méthodes histologiques et comportementales pour évaluer l’amputation réussie et la régénération.

Exposition à l’azoture de sodium perturbe la motilité normale des Platyhelminthes, causant des animaux à s’étirer et se tordent. Ces mouvements forcer le pharynx à émerger de la face ventrale de l’animal, et après environ 6 min dans une solution d’azoture de sodium, on peut considérer la pointe blanche du pharynx (Figure 1 b-panneau gauche). Quelques minutes plus tard, les animaux activement sur les contrats et déployez le pharynx en l’enfonç...

La planaire Schmidtea mediterranea est un excellent modèle pour l’étude des cellules souches et la régénération des tissus. Cette publication décrit une méthode pour éliminer sélectivement un organe, le pharynx, en exposant les animaux à l’azoture de sodium chimique. Ce protocole décrit également les méthodes de suivi de la régénération du pharynx.

Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

L’objectif global de cette procédure d’amputation est d’enlever sélectivement et complètement le pharynx des planaires sans endommager les autres organes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération. Comme la façon dont les cellules souches reconnaissent les organes manquants et initient leur régénération.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très précise et que les autres organes ne sont pas endommagés pendant le processus. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’anesthésiais des planaires avec de l’azoture de sodium. J’ai remarqué que l’exposition à l’azoture de sodium provoquait l’éclatement du pharynx.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’amputation nécessite une sélection appropriée des animaux ainsi qu’une observation minutieuse des mouvements et de la morphologie des animaux. La démonstration de la procédure sera faite par Divya Shiroor, étudiante diplômée de mon laboratoire. Avant de commencer la procédure, utilisez une pipette de transfert en plastique pour sélectionner les vers qui ont été nourris cinq à sept jours auparavant dans une boîte de Pétri propre.Placez une règle plate sous la boîte de Pétri pour confirmer que chaque planaire mesure au moins 6 millimètres de long lorsqu’ils rampent sur la parabole. Transférez ensuite jusqu’à 20 vers sélectionnés dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et utilisez une pipette de transfert pour retirer toute l’eau planaire de la boîte. Placez la parabole sous un stéréomicroscope et ajustez le grossissement de manière à ce que plusieurs animaux puissent être vus.Ajoutez cinq millilitres de solution d’azoture de sodium de 100 millimolaires fraîchement préparée dans le plat. Surveiller les animaux sans bouger la parabole pendant trois à quatre minutes pour observer l’extrusion du pharynx. Lorsqu’au moins la moitié des animaux dans la boîte ont complètement déployé un pharynx, utilisez une pipette de transfert en plastique pour aspirer et distribuer de force les vers autour de la boîte à quelques reprises.Si des pharynges étaient complètement déployés, ce pipetage vigoureux les ferait se détacher. Alternativement, utilisez une paire de pinces fines pour saisir le pharynx tout en soulevant le planaire vers le haut vers le ménisque. Au fur et à mesure que l’animal est élevé, la tension superficielle provoquera le détachement du pharynx.Pendant que vous déplacez le pharynx, veillez à ne pas causer de blessures accidentelles aux animaux. Les planaires ont un corps très mou et s’abîment facilement, surtout lorsqu’ils sont sous azoture de sodium. À l’aide d’une pipette de transfert, déplacez environ 15 animaux amputés dans un nouveau plat contenant de l’eau planaire fraîche et rincez les vers avec de l’eau planaire fraîche trois fois.Assurez-vous de laver complètement l’azoture de sodium. Même des traces de ce produit chimique pourraient provoquer la lyse des animaux. Ensuite, incubez les vers à 20 degrés Celsius pendant sept jours.Le lendemain de l’amputation, replacez les vers sous le microscope pour déterminer si une tache sombre est visible sur la face dorsale du ver. Pour nourrir les vers, transférez un volume approprié de pâte de foie dans un tube de microcentrifugation et centrifugez brièvement le tube pour éliminer les bulles d’air. Après avoir estimé le volume de la pastille de pâte, ajoutez de l’eau planaire à un cinquième de son volume.En fonction du volume total dans le tube, ajoutez deux pour cent de colorant alimentaire rouge. Mélangez soigneusement l’échantillon alimentaire jusqu’à ce que le colorant soit uniformément réparti dans toute la pâte et centrifugez brièvement à nouveau le tube. Transférez les animaux amputés dans une nouvelle boîte de Pétri et placez-les dans l’obscurité pendant environ une heure.À la fin de l’incubation, coupez environ un demi-centimètre de l’extrémité d’une pointe de pipette P200 et utilisez l’embout modifié pour transférer 25 microlitres de pâte de foie rouge dans la boîte. Laissez les animaux se nourrir pendant 30 minutes. Placez ensuite les vers sur un fond blanc pour marquer le nombre d’animaux qui apparaissent en rouge.Après environ 6 minutes dans une solution d’azoture de sodium, la pointe blanche du pharynx est visible. Quelques minutes plus tard, les animaux se contractent activement et éjectent avec force le pharynx hors de leur corps. Après environ 11 minutes d’exposition à l’azote, les animaux se détendent et la forme caractéristique du pharynx devient clairement visible.Il est maintenant prêt pour l’amputation. L’élimination de cette grande masse de tissu non pigmenté entraîne l’apparition d’une tache sombre sur la face dorsale des animaux amputés. Pour surveiller plus précisément la régénération du pharynx, les animaux peuvent être colorés avec de la streptavidine conjuguée par fluorescence pendant la nuit.En combinant le colorant alimentaire avec la pâte de foie, les animaux qui mangent peuvent être distingués des animaux qui ne mangent pas. Le nombre d’animaux rouges peut ensuite être quantifié pour évaluer le pourcentage d’animaux dotés d’un pharynx fonctionnel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 ou 30 minutes.Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas d’observer attentivement les mouvements planaires pour déterminer quand l’amputation doit commencer. Les amputations sélectives peuvent aider à répondre à des questions telles que la façon dont les cellules souches initient les décisions de lignée appropriées pour accomplir la régénération. Cette vidéo devrait permettre de bien comprendre comment effectuer l’élimination sélective du pharynx à l’aide d’azoture de sodium.Travailler avec de l’azoture de sodium peut être extrêmement dangereux. N’oubliez pas de toujours le manipuler avec des gants, de jeter correctement les déchets et de nettoyer votre espace de travail après l’expérience.

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JoVE Journal

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