Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

L’objectif global de cette procédure est de colorer la capsule polysaccharidique des souches de C. neoformans pour la visualisation et la mesure du diamètre de la capsule. Ces méthodes peuvent aider les chercheurs à l’induction, à l’imagerie et à la mesure de la taille des capsules chez Cryptococcus neoformans. Le principal avantage des techniques de coloration et d’imagerie est qu’elles sont simples, rapides et permettent une mesure précise du diamètre de la capsule.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes du logiciel peuvent être déroutantes la première fois qu’elle est utilisée. Le diamètre de la capsule de Cryptococcus neoformans est souvent utilisé comme mesure de la virulence. La possibilité d’automatiser ce processus permet de gagner un temps d’analyse considérable.

Pour induire la production de capsules, incubez d’abord une colonie de C. neoformans dans un bouillon de dextrose de peptone de levure à 37 degrés Celsius en agitant pendant 18 à 36 heures jusqu’à ce que la culture soit en phase logarithmique. A la fin de la culture, granulez la levure par centrifugation et lavez la levure trois fois dans du PBS. Après le dernier lavage, remettez la levure en suspension à deux fois 10 à cinq cellules par deux millilitres de concentration de DMEM et incubez la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 heures.

Le lendemain, collectez les cellules par centrifugation et retirez tous les microlitres du surnageant, sauf les 10 derniers microlitres. Pour colorer la levure avec de l’encre de Chine, remettez la pastille en suspension dans le surnageant restant et transférez quatre microlitres de suspension cellulaire et quatre microlitres d’encre de Chine sur une lame de microscope en verre. Mélangez doucement la solution obtenue sans créer de bulles.

Placez ensuite une lamelle en verre de 1,5 épaisseur et 13 millimètres sur l’échantillon de cellule et scellez les bords avec un mastic non toxique. Pour colorer la levure avec un colorant fluorescent, remettez en suspension la pastille de culture de nuit dans 50 microlitres de PBS complété par 1 % de sérum bovin et incubez les cellules dans 55 à 60 microlitres d’anticorps monoclonal 18B7 en capsule conjuguée calcofluor-white et Alexa Fluor 488 pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 10 microlitres de PBS plus de l’albumine sérique bovine.

Transférez ensuite huit microlitres de cellules sur une lame de microscope en verre, recouvrez l’échantillon de cellules d’une lamelle en verre de 1,5 épaisseur et scellez les bords avec un mastic non toxique. Pour colorer la levure avec les deux colorants, incubez d’abord les cellules avec une capsule fluorescente et colorez la paroi cellulaire comme nous venons de le démontrer. Ajoutez ensuite quatre microlitres de cellules colorées par fluorescence et quatre microlitres d’encre de Chine sur une lame de verre et placez une lamelle scellée sur l’échantillon de cellules fongiques comme démontré.

Pour imager les cellules par microscopie optique, sélectionnez l’objectif 100X et imagez au moins 50 cellules non chevauchantes par condition avec des temps d’exposition optimisés pour maximiser le contraste de l’image tout en minimisant le flou causé par les mouvements de petites cellules. Pour imager les cellules par microscopie à fluorescence, ouvrez le logiciel d’imagerie microscopique et sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour les fluorophores utilisés. Dans le panneau de configuration de la pile Z, sélectionnez l’avant-dernière option.

À l’aide de la commande de mise au point fine du microscope, faites d’abord la mise au point sous le point le plus large du corps cellulaire d’une seule cellule de levure et des capsules pour toutes les cellules dans le champ de vision actuel et cliquez d’abord sur Set. Ensuite, utilisez la commande de mise au point fine pour faire la mise au point au-dessus du point le plus large du corps cellulaire de la même cellule et de la capsule pour toutes les cellules dans le champ de vision actuel, puis cliquez sur définir en dernier. Ouvrez ensuite l’onglet d’acquisition et cliquez sur Démarrer l’expérience pour acquérir la pile Z pour la position actuelle.

Pour mesurer manuellement les diamètres des gélules et des cellules, ouvrez un programme de mesure de cellules approprié et sélectionnez l’image à mesurer. Sélectionnez mesurer et utilisez le curseur pour tracer une ligne droite passant par le point le plus large de la cellule entière afin de mesurer le diamètre total de la cellule. Cliquez à nouveau sur mesurer et tracez une ligne droite à travers le corps de la cellule pour mesurer le diamètre du corps de la cellule et ouvrir la cellule suivante.

Lorsque toutes les cellules ont été mesurées, enregistrez les images. Pour la mesure automatisée des diamètres des capsules et des cellules, ouvrez d’abord un programme d’édition d’images approprié et inversez toutes les images de cellules colorées à l’encre de Chine. Ensuite, pour importer à la fois les images d’origine et les images inversées dans le logiciel de mesure de cellule, ouvrez le menu Fichier du programme de mesure et sélectionnez Importer la séquence, Charger l’image, Définir la séquence manuellement, Cotes le canal, Importer et Appliquer.

Pour détecter et masquer le corps cellulaire, sélectionnez le protocole de fluorescence de l’analyseur de colonie pour la première image inversée d’intérêt et cliquez sur Appliquer. Sélectionnez à nouveau le protocole de fluorescence de l’analyseur de colonies pour segmenter les images inversées du corps cellulaire de C. neoformans à partir de leurs capsules, puis cliquez à nouveau sur appliquer pour créer un masque de comptage. Faites un clic droit pour renommer le corps de la cellule du masque de comptage et utilisez le protocole de prolifération cellulaire sur l’image d’origine pour détecter et masquer la capsule.

Cliquez sur Appliquer pour créer un masque de comptage pour l’image d’origine et renommer la capsule de masque de comptage. Pour créer un nouveau masque sur l’image d’origine afin de séparer les capsules adjacentes les unes des autres, sélectionnez partition de capsule et capsule pour la région de la capsule. Pour exporter les données, cliquez sur feuille de calcul puis cliquez sur l’icône d’exportation vers une feuille de calcul.

Sélectionnez les mesures que vous souhaitez exporter et enregistrez enfin les données. Une augmentation de la taille des capsules est apparente chez la plupart des souches après l’induction, bien que certaines souches présentent naturellement de petites capsules. Dans cette expérience représentative, une différence significative dans la taille des capsules a été observée de manière constante entre la plus grande souche et les deux souches plus petites.

Les différences de taille des gélules peuvent également être détectées à l’aide de colorants fluorescents. La capture d’image de la pile Z garantit que le diamètre maximal de la capsule et du corps de la cellule est acquis pour chaque cellule. Les piles peuvent ensuite être traitées pour produire des projections d’intensité maximale pour la mesure manuelle de la capsule de cellule de levure et du diamètre de la cellule.

Il n’y a pas de différence intra-expérience significative entre les mesures de capsule utilisant l’une ou l’autre méthode de coloration, bien qu’une plus grande variabilité inter-expérience soit observée lors de l’utilisation de l’encre de Chine pour mesurer les diamètres des capsules par rapport à la coloration par colorant fluorescent. Des différences significatives dans les mesures du diamètre de la capsule entre les différents chercheurs ne sont généralement pas observées, quelle que soit la méthode utilisée, tandis que des différences mineures mais significatives dans la taille de la capsule peuvent être détectées à l’aide de la méthode de mesure automatisée. Pour une mesure automatisée réussie, les cellules doivent être nettes, avoir une capsule de taille moyenne à grande et ne pas être trop regroupées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire la capsule chez Cryptococcus neoformans, de la colorer à l’aide d’encre de Chine ou d’une coloration fluorescente, d’imager la capsule et de la mesurer via un logiciel automatisé.