Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon

L’objectif principal de cette publication est de présenter une méthode de normalisation du microbiome des rongeurs. Dans cette démonstration, l’effet de l’enrichissement de l’environnement sur le microbiome est analysé pendant la genèse de la tumeur du côlon. Ce protocole montre comment la normalisation du microbiome avant une intervention d’enrichissement de l’environnement améliore la reproductibilité expérimentale.

Nous montrons également comment réduire le stress des animaux et améliorer les interactions en utilisant un environnement enrichi. Bien que nous nous soyons concentrés sur l’effet de l’enrichissement environnemental dans un modèle de tumeur du côlon, la méthode peut facilement être appliquée pour mieux comprendre le rôle du microbiome dans l’étiologie de la maladie. Installez les cages dans des conditions stériles en travaillant sous une hotte ventilée.

Les contrôles de cette expérience consistent en des cages conventionnelles avec de la litière et des tissus de laboratoire pour la nidification, mais sans dispositifs d’enrichissement. Pour mettre en place les cages d’élevage de petits ou enrichies écologiques, connectez deux grandes cages autoclavées avec un tunnel stérilisé sécurisé par des œillets et incluez une plate-forme stérilisée dans chaque cage pour augmenter l’espace au sol. Pour EE, fournissez également des roues de course stérilisées, des tunnels, des igloos, des cabanes, des balles à ramper et du matériel de nidification.

Placez les cages enrichies et de contrôle dans le même rack pour assurer une ventilation égale. Pour la reproduction, combinez un père et deux mères potentielles dans des cages normales. Chaque matin, vérifiez la présence de bouchons vaginaux indiquant que l’animal s’est accouplé pendant la nuit.

Si un bouchon n’est pas visible, la résistance à la sonde vaginale peut détecter un bouchon internalisé. Si une femelle a un bouchon vaginal, transférez-la dans une grande cage d’élevage de chiots. Jusqu’à 12 barrages gestants peuvent être logés dans les cages enrichies en environnement avec des plates-formes, à condition qu’elles soient toutes censées accoucher au cours de la même semaine.

Lorsque les petits ont entre 21 et 28 jours, répartissez les mâles et les femelles par génotype dans des environnements témoins ou des environnements enrichis. Assurez-vous de conserver une proportion de chaque génotype dans chaque cage. Les cages non enrichies peuvent supporter jusqu’à cinq souris, tandis que les cages enrichies nécessitent au moins 20 souris pour la stimulation sociale et peuvent supporter jusqu’à 41 souris.

Commencez à recueillir les selles un ou deux jours avant d’euthanasier les souris. Collectez toujours à la même heure de la journée. Pour recueillir les selles des animaux vivants, ébouriffez soigneusement l’animal au-dessus d’une cage propre.

Ensuite, récupérez les selles déféquées à l’aide d’une pince stérile et transférez-la dans un tube de microfuge stérile. Si un animal ne défèque pas immédiatement, placez-le dans une cage propre et attendez que l’animal défèque, ce qui peut prendre jusqu’à une heure. Pour recueillir les selles d’un animal euthanasié, disséquez-les pour accéder au côlon.

Ensuite, coupez le côlon juste en dessous du cæcum et étalez-le sur un morceau de papier filtre. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez le haut du tube du côlon et ouvrez la lumière à l’aide de ciseaux. Coupe longitudinale distale à proximale pour ouvrir le côlon dans le sens de la longueur.

Ensuite, prélevez les selles du côlon distal dans un tube de microfuge stérile à l’aide d’une pince stérile. Conservez les échantillons de selles à moins 80 degrés Celsius. En plus des selles, prélevez d’autres échantillons de tissus du côlon et de l’intestin grêle, des microsomes, du tissu adipeux, etc.

Utilisez une trousse commerciale pour isoler l’ADN microbien des selles en suivant un protocole de détection des agents pathogènes dans les selles. Ce faisant, transférez les échantillons du congélateur à moins 80 degrés Celsius sur de la glace sèche et pesez-les. Ensuite, mettez en place une PCR qui amplifie l’ADN microbien comme décrit dans le protocole texte.

Nettoyez ensuite les produits de réaction à l’aide de billes magnétiques. Pour le nettoyage, centrifugez d’abord brièvement la plaque PCR de l’amplicon pour regrouper les produits de réaction. Ensuite, faites vortex les billes magnétiques pour les disperser uniformément et transférez bien 20 aliquotes de microlitres à chaque réaction.

Mélangez soigneusement les billes avec la solution en pipetant lentement 10 fois sur tout le volume. Laissez ensuite les perles reposer pendant cinq minutes. Ensuite, placez la plaque PCR sur un support magnétique et attendez deux minutes que les surnageants disparaissent après la collecte magnétique des billes.

Retirez et jetez ensuite les surnageants. Ensuite, avec la plaque toujours sur l’aimant, remplissez chaque puits de perles avec 200 microlitres d’éthanol frais à 80 % et attendez 30 secondes. Retirez ensuite avec précaution le surnageant.

Répétez cette étape de lavage une fois et laissez les perles sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Maintenant, éluez les produits de réaction des billes en retirant la plaque du support magnétique et en ajoutant 52,5 microlitres de Tris dans chaque puits. Mélangez complètement les billes dans la solution en pipetant lentement tout le volume 10 fois.

Ensuite, collectez les billes sur le support magnétique comme précédemment et transférez 50 microlitres de surnageant sur une plaque PCR propre. Couvrez la plaque d’un adhésif transparent et conservez-la à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine maximum. Utilisez le surnageant collecté pour effectuer une PCR d’index afin de joindre des codes-barres à la séquence d’adaptateurs.

Ensuite, purifiez les produits et préparez la bibliothèque indexée pour le séquençage. Chez la souris, l’enrichissement de l’environnement est connu pour améliorer la durée de vie et la réparation des plaies tumorales. Pour définir le rôle du microbiote dans ce phénotype, des animaux reproducteurs ont été intégrés dans la colonie de souris pendant au moins un mois afin de normaliser le microbiote.

Ensuite, ils ont été élevés et leur progéniture a été élevée dans un environnement enrichi ou un environnement normal. La progéniture était également porteuse de tumeurs ou de type sauvage. Après 16 semaines, les animaux ont été euthanasiés et des échantillons de selles ont été prélevés pour isoler l’ADN microbien.

Ensuite, la PCR a été utilisée pour amplifier la sous-unité ribosomique 16S dans les échantillons afin d’étudier les composants du microbiome. Les produits de réaction ont ensuite été identifiés à l’aide de l’indexation par code-barres. Il est intéressant de noter que les environnements améliorés n’améliorent pas la biodiversité chez les animaux sauvages, mais ils augmentent considérablement la biodiversité chez les animaux porteurs de tumeurs.

Cela démontre la sensibilité de la méthode. Cette augmentation de la biodiversité a été attribuée à une présence accrue de l’embranchement des protéobactéries, avec des augmentations significatives des classes alphaprotéobactéries et bêtaprotéobactéries et une diminution des gammaprotéobactéries pathogènes. La plus forte augmentation de la classe des bêtaprotéobactéries a été observée dans le genre Sutterella, un commensale probablement impliqué dans la dégradation de l’immunoglobuline A sécrétée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modifier les pratiques d’élevage pour normaliser le microbiome entre les animaux de laboratoire avant de commencer vos interventions d’intérêt. Lors de l’exécution de cette procédure, rappelez-vous que les animaux ont établi leur territoire dans l’environnement. Pour cette raison, les changements environnementaux peuvent provoquer un stress qui affectera le microbiome de l’animal.

Un changement soudain dans le comportement de l’animal est un signe physique de stress. À la suite de cette procédure, des microbes spécifiques peuvent être isolés et caractérisés davantage pour tester la suffisance du microbe identifié sur la progression de la maladie.