Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

L’objectif général de cette procédure est d’observer la morphologie et la fonctionnalité des leucocytes à l’intérieur du foie lors d’un choc septique. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des vidéos directes des leucocytes à l’intérieur du foie. Avant l’opération, utilisez de l’éthanol à 70 % pour désinfecter la table d’opération et tous les instruments.

Ensuite, installez les outils pour la chirurgie du foie et ajustez la plaque chauffante à 37 degrés Celsius. Après avoir anesthésié les souris injectées de LPS ou de PBS selon le protocole textuel, appliquez une petite quantité de pommade oculaire pour éviter que la rétine ne se dessèche. Utilisez un rasoir et une crème dépilatoire pour enlever les poils autour de l’abdomen.

Utilisez ensuite de la gaze humide pour dégager l’abdomen. Tout en effectuant une injection rétro-orbitale à l’aide d’une seringue à insuline, injectez 200 microlitres de solution de dextran rouge du Texas. Utilisez un marqueur pour marquer la zone sous-costale droite de l’apophyse xyphoïde à l’extrémité de la côte.

Appliquez ensuite de la povidone iodée sur l’abdomen de la souris pour prévenir une infection secondaire. Utilisez des pinces et des ciseaux pour couper l’épiderme. Ensuite, à l’aide de micro-ciseaux et de pinces, ouvrez la cavité abdominale et exposez soigneusement le foie.

Utilisez des cotons-tiges pour dérouler le lobe latéral gauche. Versez ensuite 500 microlitres de PBS stérile sur la cavité abdominale pour éviter que le foie ne se dessèche. Placez la souris dans la bonne position de décubitus dans une chambre conçue sur mesure et appliquez une petite quantité de colle tissulaire sur le lit de silicone.

Ensuite, utilisez des cotons-tiges pour fixer soigneusement le foie. Le tissu hépatique est extrêmement friable. N’utilisez jamais d’outils tranchants ou lourds pour exposer et tenir le foie.

Quelques secondes plus tard, mouillez à nouveau le foie avec 500 microlitres de PBS stérile pour éviter qu’il ne se dessèche. Placez ensuite le cadre métallique sur le foie et utilisez des écrous pour le fixer fermement. Placez toujours les écrous de support avant de placer le cadre métallique.

Cela aidera à réduire la pression du cadre métallique. Pour effectuer une imagerie intravitale du foie, exécutez le logiciel Zen pour allumer le laser. Réglez la longueur d’onde sur 880 nanomètres et réglez les canaux vert et rouge.

Ajustez ensuite la puissance du laser en fonction de l’intensité de la fluorescence. Placez la chambre sur la platine d’imagerie et positionnez l’objectif à immersion dans l’eau de puissance 20 près de la vitre de protection. Fixez le chauffage en caoutchouc de silicone sous le corps de la souris pour maintenir sa température corporelle.

Ensuite, prélevez 500 microlitres d’eau distillée sur le cadre métallique. Et puis positionnez la lentille de l’objectif près du foie. Ajustez la mise au point et déterminez la profondeur et la durée de la zone d’imagerie.

Pour l’imagerie à long terme, injectez une demi-dose du mélange anesthésique Zoletil et Rompun préparé au préalable pour chaque heure pendant l’imagerie pour des raisons éthiques. Maintenez la température corporelle à 37 degrés Celsius et gardez toujours un œil sur la souris car les temps d’anesthésie diffèrent pour chaque souris. Pour analyser les données, ouvrez Velocity et importez les données brutes de la bibliothèque.

Ensuite, supprimez le bruit de l’image et prenez un instantané. Enfin, ajustez les éléments édités à 100 % et exportez les fichiers sous forme de fichiers JPEG ou TIF pour les images instantanées et de fichiers AVI pour les films. L’analyse d’imagerie intravitale de souris témoins a montré qu’un petit nombre de neutrophiles circulaient dans le vaisseau sanguin.

Alors que le nombre de neutrophiles était significativement augmenté chez les souris traitées au LPS. Dans l’état LPS, beaucoup de neutrophiles circulaient à l’intérieur de la circulation sanguine, mais ils ne migraient pas à l’extérieur du vaisseau. Comme on le voit dans ces films, par rapport aux souris témoins, les neutrophiles des souris traitées au LPS étaient plus fermement adhérés à la surface luminale du vaisseau, ce qui rendait les neutrophiles plus fréquemment détectés dans le vaisseau.

Outre la motilité des neutrophiles, les macrophages capsulaires hépatiques, ou LCM, chez les souris CX3CR1-GFP ont été observés à la surface du tissu hépatique plutôt qu’en profondeur dans le tissu. De plus, les LCM ont montré peu de mouvement ou d’activation dans le foie, même chez les souris traitées au LPS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de définir la ligne d’incision du processus xiphoïde à l’extrémité de l’abdomen sous-costal droit. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’injection de traitement peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont le foie se remet des dommages et des infections. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine pour explorer la réaction des leucocytes lors de la septicémie et tester des médicaments potentiels.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exposer un foie avec une incision abdominale minimale. N’oubliez pas que travailler avec le lipopolysaccharide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la stérilisation et le lavage des mains doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.