Name: À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Apprenez à différencier des cellules souches pluripotentes induites en hépatocytes pour le criblage à haut débit. Cette méthode permet de générer des cellules illimitées pour identifier des traitements contre les maladies du foie.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 et HG006398 de Sad). Nous tenons à remercier le Dr Behshad Pournasr, Dr. James Heslop et Ran Jing pour leurs contributions.

1. culture de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes
<ol><li>
Revêtement recombinant humain protéine de Fusion Fc E-cadhérine (E-cad-Fc) ou autres matrices appropriés pour la culture de hPSC 6<ol>
<li>Diluer le E-cad-Fc à 15 μg/mL avec Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco contenant du calcium et du magnésium (SPD (+)).</li>
		<li>Manteau plats de vitroplants de suspension 100 mm avec 5 mL de E-cad-Fc dilué et incuber à 37 ° c pendant au moins 1 h substrat supprimer et remplacer par 5 mL de milieu (par exemple, mTeSR1 appelé M-moyen désormais)7. Remarque : Le milieu de culture utilisé dans le présent protocole est établi suivant les protocoles publiés7. Toutefois, plusieurs autres préparatifs des médias ont été décrits, ou sont disponibles sur le marché, qui sont probablement compatible avec la procédure.</li>
		<li>Récupérer un flacon de CISP cryoconservés d’azote liquide. Décongeler à 37 ° c jusqu'à ce qu’un cristal de glace petit reste. Pipetez doucement les cellules dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 4 mL du milieu-M.</li>
		<li>Centrifuger à 300 g pour 5 min. Retirez le surnageant et doucement remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu additionné de 10 µM de Y-27632, un inhibiteur sélectif de la Rho-associés, coiled-coil contenant protéine kinase (ROCK).</li>
		<li>Enlever le milieu M de l’étape 1.1.2 et transvaser 5 mL des cellules de l’étape 1.1.4 aux plats de culture de tissus enduits E-cad-Fc suspension de 100 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maintenir le CISP humaines en culture
	<ol>
<li>Une fois que le CISP se propagent dans confluence de 80 %, enlevez le milieu de culture et laver une fois avec le calcium et magnésium libre SPD (-). Aspirer le SPD (-) et ajouter une quantité suffisante de solution d’EDTA de 0,02 % à recouvrir les plaques, puis incuber pendant jusqu'à 3 min à température ambiante. Remarque : Au confluent de 80 %, la plaque doit contenir environ 2 x 107 cellules. Il est important de ne pas proliférer les cellules et de s’assurer que les cellules conservent une morphologie indifférenciée. La pluripotence des cellules peut être déterminée par coloration avec marqueur de cellules souches Tra-1-60 ou équivalent8.</li>
		<li>Dès que les cellules commencent à se libérer, retirer la solution d’EDTA de 0,02 % et inonder le plat avec 10 mL de la M-moyen pour libérer les cellules. Aide au détachement de CISP en pipettant également, doucement. Remarque : Le temps d’incubation moyen pour détacher des cellules est environ 3 min, mais cela doit être déterminée empiriquement pour chaque ligne de l’iPSC. Les cellules doivent être libérées en petites grappes contenant autour de 5-10 CISP par grappe.</li>
		<li>Transférer 1/10 des cellules suspendues par frais E-cad-Fc couché 100 mm suspension tissu boîte de Petri contenant 5 mL de la M-moyen. Incuber les cultures à 37 ° c moins de 4 % O25 % CO2 et le changement du milieu tous les jours. Remarque : Bien que CISP est couramment cultivées dans des conditions physiologiques d’oxygène pour promouvoir la pluripotence, CISP peut aussi être cultivé à l’aide de l’oxygène ambiant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes sur plaques à 96 puits
Remarque : Cette section décrit la différenciation de la CISP dans un format qui est compatible avec le dépistage. En utilisant cette approche, il est possible d’induire la CISP humaine à différencier et à former des cellules semblables à des hépatocytes en 20 jours. Tandis que ceci convient à la plupart des essais, la durée de la culture peut être étendue pour améliorer la maturité des cellules.
<ol><li>
Revêtement des plaques de 96 puits vitroplants avec matrice de membrane basale de facteur de croissance réduite
	<ol>
<li>Préparer le bouillon en diluant la matrice à 2 mg/mL avec milieu de culture tissulaire DMEM/F12 stérile glacé. Diviser la matrice en 250 parties aliquotes μL et conserver à-80 ° c jusqu'à leur utilisation. Faites refroidir 10 mL de DMEM/F12 sur glace pendant 30 min. récupérer un 250 μL partie aliquote de 2 mg/mL de bouillon de matrice et dégel sur la glace.</li>
		<li>Combiner la matrice avec 10 mL de froid DMEM/F12 en mélangeant doucement avec une pipette réfrigérée avant de faire une concentration finale de 0,05 mg/mL.</li>
		<li>Transférer 100 μL de matrice dilué dans chaque puits d’une plaque 96 puits vitroplants. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant au moins 1 h. jeter la matrice et le remplacer avec 50 μL de M-moyen / puits. Stocker à 37 ° C, 5 % 4 % O2CO2 jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour la différenciation des cellules de plaque
	<ol>
<li>Le CISP sur plaques de 100 mm de la culture jusqu'à ce que les cellules approchent 80 % confluence. Assurez-vous que la plaque contienne environ 2 x 107 cellules. Déterminer le nombre de cellule par cellule cytomètre en flux ou hémocytomètre. Remarque : Avec l’expérience, la qualité des cellules CISP peut être jugée par microscopie ; Toutefois, près de 98 % des cellules devrait exprimer pluripotence marqueurs tels que l’épitope TRA-1-60, lorsqu’elle est mesurée par FACS ou immunostaining. Il est important que les cellules restent activement démarcation et ne sont pas envahis.</li>
		<li>Pour récolter le CISP de chaque plaque de 100 mm, aspirer le milieu de culture et rincer avec 5 mL de SPD (-). Remplacer le rinçage avec 3 mL de solution de détachement de cellules (par exemple, accutase) et incuber pendant environ 2 min à 37 ° C, 4 % O25 % CO2. Remarque : Il est important de suivre le détachement des cellules au microscope. Ne pas trop condensé avec accutase. Le but est de libérer les cellules des groupes restreints avec traitement minimal.</li>
		<li>Dès que les cellules commencent à se détacher, récolter en ajoutant 7 mL du milieu-M. Pipetter plusieurs fois à se dissocier des colonies de cellules en petites grappes d’autour de 3 à 6 cellules (Figure 1 a).</li>
		<li>Recueillir le CISP dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL et centrifuger à 300 x g pour 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL M-moyen.</li>
		<li>Répartir les cellules sur des plaques de 96 puits enduit de matrice de pipetage 50 μL de cellules en suspension dans chaque puits. Pour configurer chaque plaque à 96 puits, utilisez une plaque de 100 mm de CISP avec cellules à 80 % environ des confluence qui contient environ 5 x 106 cellules pour configurer la différenciation. Utiliser une pipette multicanaux pour accélérer ce processus. La culture des cellules durant la nuit à 37 ° c, 4 % O25 % CO2. Remarque : Il est important qu’un nombre égal de cellules est déposé dans chaque puits pour assurer les différenciations reproductibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire la différenciation des cellules
	<ol>
<li>Examiner les plaques 96 puits au microscope afin de veiller à ce que les cellules couvrent au moins 70 % de la surface de chaque individu bien. Si la couverture est inférieure à 70 %, remplacer le support avec un milieu frais et incuber pendant 24 h à 37 ° c, 4 % O25 % CO2supplémentaires. Remarque : Incubation des cellules pendant plus de 48 h après placage sans induire la différenciation communément réduit l’efficacité de la différenciation. La différenciation se produit également de l’oxygène ambiant, bien que l’efficacité soit affecté.
</li>
		<li>Pour le jour 1 à jour 2 de différenciation, remplacer le milieu de culture par RPMI additionné de 2 % B27 (sans insuline), 100 ng/mL activine A 10 ng/mL BMP4 et 20 ng/mL FGF2. Ajouter 100 μl de milieu de chaque puits et incuber à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une modification moyenne quotidienne pendant 2 jours. Remarque : Traiter avec un grand nombre de plaques à 96 puits nécessitent l’utilisation d’une pipette assistée ou le robot. pipettes de 12 canaux et 96 voies sont idéales pour les variations moyennes quotidiennes.</li>
		<li>Pour le jour 3 à 5 jours de différenciation, remplacer le milieu de culture avec RPMI additionné de 2 % B27 (sans insuline) et 100 ng/mL Activin A. Culture des cellules à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une variation moyenne quotidienne pendant 3 jours.</li>
		<li>Au jour de différenciation 5, avant de remplacer par le milieu de culture fraîche, traiter chaque bien avec solution de EDTA de 100 μL 0,02 % pour 30 s, puis les retirer et les remplacer avec milieu de culture fraîche. Remarque : Si la différenciation à l’endoderme est efficace, la monocouche de différencier les cellules est sujette à l’épluchage de la plaque. Un bref traitement avec la solution d’EDTA 0,02 % aide à soulager le détachement cellulaire. Ce traitement n’influe pas sur la différenciation d’hépatocytes.</li>
		<li>Pour différencier les jours 6 à 10, remplacer le milieu de culture avec RPMI / 2 % B27 (avec insuline) additionné de 20 ng/mL BMP4 et 10 ng/mL FGF2 et incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant 5 jours avec une variation moyenne quotidienne. Cette phase induit des cellules à se différencier en cellules progénitrices hépatique.</li>
		<li>Pour différencier les jours de 11 à 15, remplacer le milieu de culture avec RPMI / 2 % B27 (avec insuline) complétés par 20 ng/mL HGF. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant 5 jours avec une variation moyenne quotidienne.</li>
		<li>Pour différencier les jours de 16 à 20, remplacer le milieu de culture avec un milieu de culture de la cellule de l’hépatocyte (HCM) additionné de 20 ng/mL d’oncostatine M (OSM). Incuber les cellules à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une variation moyenne quotidienne pendant 5 jours. Remarque : La reproductibilité de la différenciation entre les puits individuels peut efficacement être déterminée en mesurant le niveau relatif d’albumine, AFP ou APOB sécrétée dans le milieu par ELISA (voir 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. petite molécule dépistage
Remarque : La section suivante décrit la procédure permettant d’identifier des composés qui peuvent servir à abaisser le niveau de l’APOB dans le milieu des cellules semblables à des hépatocytes dérivée de l’hypercholestérolémie CISP. Une description du modèle et son utilisation dans l’identification des hypocholestérolémiants a été décrit en détail auparavant5,9. Dans l’exemple actuel, 1 000 composés provenant de la bibliothèque de Collection composé de Caroline du Sud (SC3) ont été examinés. Chaque composé a été testé à une concentration de 2 µg/mL.
<ol><li>
Traitement de l’iPSC - dérivées d’hépatocytes avec petites molécules
	<ol>
<li>Diluer la maître bibliothèque composée pour produire les plaques des stocks de travail avec des composés à une concentration de 20 μg/mL en 2 % DMSO et les conserver à-20 ° c.</li>
		<li>Préparer suffisamment plaques à 96 puits d’hépatocytes iPSC-dérivé pour permettre à chacun des composés à tester. Remarque : Le nombre de composés à projeté dictera le nombre de plaques de 96 puits qui sont nécessaires. En général, un seul bien doit être préparé pour chaque composé, en plus des puits pour les échantillons de contrôle. Ultrapériphériques puits de la plaque sont généralement évités afin de réduire la possibilité d’effets de bord qui peut altérer l’interprétation. Hits peuvent être identifiés en utilisant la méthode de z-score sans la nécessité d’utiliser des répétitions. Si les répétitions sont incluses, il est plus approprié d’utiliser le test t.</li>
		<li>À la fin de la différenciation (jour 20, voir 2.3.7), remplacer le milieu de culture avec 100 μL de HCM fraisadditionné de 20 ng/mL d’oncostatine M. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant exactement 24 h. récupérer le milieu de culture dans une plaque à 96 puits fraîche et les conserver à-20 ° c. Cet exemple permet de calculer le niveau de l’APOB dans le milieu avant l’ajout de médicaments.</li>
		<li>Ajouter 90 μL de HCM frais additionné de 20 ng/mL d’oncostatine M dans chaque puits. Ajouter 10 μL de chaque composé du stock de travail après avoir mélangé de pipetage. Ajouter le DMSO à 0,2 % pour contrôler les puits pour correspondre à la concentration finale dans les échantillons traités et incuber à 37 ° c, ambiant O25 % CO2 pendant exactement 24 h. recueillir le milieu de culture et conserver à-20 ° c. Cet exemple permet de déterminer le niveau d’APOB après traitement avec des composés.</li>
		<li>Facultatif - les cellules restantes peuvent être traitées pour immunostaining, la viabilité des cellules ou des analyses de l’ARNm en utilisant des approches standards. Remarque : Cet écran a été conçu pour identifier les médicaments qui ont un effet rapide sur les niveaux de l’APOB. Toutefois, selon le modèle de la maladie, les dosages en aval ou mécanisme d’action des médicaments, il peut être bénéfique traiter l’échantillon pendant plusieurs jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Déterminer les niveaux de l’APOB par ELISA
	<ol>
<li>Déterminer la concentration d’apolipoprotéine B (APOB) les deux échantillons de la pré- et post-drogues traitées à l’aide d’un kit de développement humain APOB ELISA suivant les protocoles du fabricant.</li>
		<li>
Préparer les solutions suivantes
		<ol>
<li>Tampon de lavage, composé de 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4. Conserver à 4 ° c jusqu'à l’utilisation.</li>
			<li>Tampon d’incubation, composé de 0,05 % Tween 20 et 0,1 % sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS, pH 7,4. Conserver à 4 ° c jusqu'à l’utilisation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer les anticorps de l’APOB (mAB 20/17) en diluant à 2 µg/mL dans du PBS, pH 7,4. Ajouter 100 μL de l’anticorps dilué chaque puits et incuber pendant la nuit à 4 ° c.</li>
		<li>Retirer les plaques de dosage de l’anticorps et laver chaque bien deux fois avec 200 μl de PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Ajouter 200 μL/puits de 0,05 % Tween 20, 0,1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS, pH 7,4 et incuber sur une plate-forme vibrante pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Préparer une courbe standard de 8 points à l’aide de 0,05 % de Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4 avec les concentrations suivantes d’APOB : 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL et 50 ng/mL.</li>
		<li>Diluer les échantillons de test 1:4 avec 0,05 % Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Après 1 h de blocage avec tampon d’incubation, jetez le tampon et laver les plaques d’essai cinq fois avec 200 μl de 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Supprimer n’importe quel tampon de lavage résiduelle complètement et transférer 90 μL des échantillons dilués et les normes de l’APOB des plaques de dosage. Incuber à température ambiante sur un agitateur pendant 1 h.</li>
		<li>Jeter l’échantillon et laver avec 200 μL 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4 / puits. Répétez les lavages 5 fois au total. Ajouter 100 μL par puits de mAB LDL 11-biotine dilué 1 : 1 000 0,05 % Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4. Incuber à température ambiante sur une plate-forme vibrante pendant 1 h.</li>
		<li>Jeter le réactif et laver avec 200 μL / tampon de lavage bien 5 fois. Ajouter 100 μL / puits des anticorps de la Streptavidine-HRP (1:1, 000 dilution à l’aide du tampon d’incubation), puis incuber à température ambiante sur une plate-forme vibrante pendant 1 h.</li>
		<li>Jeter le réactif et laver avec 200 μL 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4 / puits. Répétez les lavages 5 fois au total. Complètement retirer le tampon de lavage résiduelle sur les plaques de test et ajouter 100 μL par puits de la solution de substrat de Tetramethylbenzidin (TMB) et incuber à température ambiante pendant 8 min.</li>
		<li>Sans enlever le substrat TMB, directement ajouter 100 μL par puits de la solution d’arrêt (1N HCl).</li>
		<li>Déterminer l’absorbance à 450 nm en utilisant un lecteur de plaque.</li>
		<li>Une courbe d’étalonnage peut être établie, à l’aide de la méthode de régression logistique de quatre paramètres, puis utilisé pour définir la concentration d’APOB dans chaque échantillon10.</li>
		<li>Examiner la drogue avant : post drogue rapport APOB dans chaque échantillon d’identifier des composés susceptibles de diminuer l’APOB niveaux dans le milieu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li>
<li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li>
<li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li>
<li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li>
<li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li>
<li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Découverte de médicaments cible basé, où les petites molécules sont identifiées qui influent sur l’activité d’une protéine spécifique, a fait l’objet de nombreux efforts de dépistage existants. Bien que cette approche a fourni de nombreux produits pharmaceutiques, écrans, basés sur l’inversion d’un phénotype, la pharmacologie classique, ont eu plus de succès dans l’identification des composés de première catégorie qui ont été cliniquement efficace1. Un inconvénient à la découverte de médicaments p...

Succès dans l’identification des médicaments qui peuvent servir à cibler une maladie rare se fonde sur le développement de tests qui peut être utilisé pour le dépistage. Hypothèse ou écrans axée sur la cible (pharmacologie inverse) sont utiles, mais nécessitent une compréhension détaillée de la base moléculaire de la maladie. Les écrans phénotypiques (pharmacologie classique) éviter la nécessité d’une compréhension détaillée des voies biochimiques, mais reposent plutôt sur l’élaboration de modèles qui reflètent avec précision la physiopathologie de la maladie. Malgré l’enthousiasme pour les approches axées sur la cible, des médicaments de première catégorie approuvés par la FDA, les analyses révèlent que phénotypiques écrans ont été beaucoup plus de succès1. L’objectif général de cette méthode est d’établir une plateforme de criblage à haute qui peut être utilisé pour identifier de petites molécules pour le traitement d’une maladie métabolique du foie. Plusieurs modèles in vitro ont été décrits, notamment des hépatocytes primaires et cellules d’hépatome de cellules progénitrices du foie2. Cependant, la plupart de ces modèles ont des limites, et on a besoin de nouveaux modèles peuvent récapituler avec précision la physiopathologie des déficiences métaboliques de foie dans la culture. Récemment, les cellules souches pluripotentes humaines combinées avec l’édition de gène ont offert une occasion de modèle même les plus rares de maladies rares en culture sans la nécessité d’accès patients directement3. Tandis que l’utilisation du CISP spécifique au patient comme un outil à la découverte de petites molécules pour le traitement des maladies hépatiques rares est raisonnable sur le plan conceptuel, il y a seulement quelques rapports démontrant la faisabilité de cette approche4. Cependant, nous avons récemment établi une plateforme dérivés iPSC hépatocytes permettant d’identifier avec succès des médicaments qui peuvent être réutilisés pour le traitement des déficiences dans le métabolisme du foie5.
Ce protocole explique le processus de différenciation CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits et en les utilisant pour cribler une banque de petites molécules. Il décrit également l’analyse de point de terminaison utilisant hypercholestérolémie comme un exemple d’une maladie métabolique du foie. Cette approche devrait être utile pour étudier le rôle et l’application de petites molécules dans le cadre d’une maladie infectieuse du foie, hépatopathie métabolique, toxicité des médicaments et autres troubles du foie.

<table><tbody><tr><td>Boîtes stériles de culture tissulaire de 100 mm x 20 mm&nbsp ;</td><td>Boîtes</td> de culture en suspension stériles <td>Corning 430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm</td><td>430591</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire Corning à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humane Albumine</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain Oct-3/4 Anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine conjuguée TRA-1-60 FITC FCMAB115F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activine A Protéine humaine recombinante&nbsp ;</td><td>Supplément d’Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27, moins l’insuline.</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément, sans sérum</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>protéine humaine recombinante BMP4</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>réactif de dissociation cellulaire StemPro&nbsp ; Accutase&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnésium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(sans calcium, sans magnésium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA humain APOB Kit de développement ELISA</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2)Milieu</td> de culture d’hépatocytes <td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>(HCM Bullet Kit)&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des hépatocytes&nbsp ; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Protéine humaine recombinante&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine&nbsp ;</td><td></td> Milieu de cellules souches pluripotentes sans distributeur d’Invitrogen <td></td> 15140163 <td></td></tr><tr><td>: mTesR1&nbsp ;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix pour hPSC (E-CAD-FC)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugué</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0,02 %&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibiteur</td> de <td>ROCK STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for drug discovery

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

La capacité de différencier les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) en cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) offre de nouvelles possibilités pour l’étude des erreurs innées du métabolisme hépatique. Toutefois, afin de fournir une plate-forme qui prend en charge l’identification de petites molécules qui peut potentiellement être utilisé pour traiter les maladies du foie, cette procédure nécessite un format de culture qui est compatible avec des milliers de composés de dépistage. Nous décrivons ici un protocole utilisant des conditions de culture entièrement définie, qui permettent la différenciation reproductible de CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits vitroplants. Nous fournissons également un exemple d’utilisation de la plateforme aux composés d’écran pour leur capacité d’abaisser l’apolipoprotéine B (APOB) produite à partir des hépatocytes iPSC dérivés produits d’un patient de l’hypercholestérolémie. La disponibilité d’une plate-forme qui est compatible avec la découverte de médicaments devrait permettre aux chercheurs d’identifier de nouveaux traitements pour les maladies qui affectent le foie.

Génération des hépatocytes - aime les cellules : La figure 1 représente le calendrier des changements qui se produisent au cours de la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes. La culture de la CISP sur E-Cad-Fc fournit environ 2 mm des colonies de diamètre qui expriment le marqueur pluripotentes OCT4 (Figure 1 a-B). La morphologie d...

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

L’objectif global de cette expérience est de différencier les cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules semblables à des hépatocytes d’une manière qui convient au criblage à haut débit. Les cellules hépatiques sont difficiles à cultiver en laboratoire, mais elles peuvent être générées à partir de cellules souches pluripotentes induites, ce qui fournit une plate-forme de criblage pour identifier les traitements des maladies du foie. Le principal avantage de cette technique est qu’un nombre illimité d’hépatocytes peut être généré à partir de n’importe quel patient atteint d’une maladie du foie qui récapitule la maladie en laboratoire.La procédure est relativement facile à mettre en place, même sans connaissances approfondies en biologie des cellules souches. Sa reproductibilité permet aux chercheurs de cribler des milliers de composés sans avoir besoin de robotique complexe. Ray Liu, boursier postdoctoral, et Paige Lamprecht, étudiante diplômée, feront une démonstration de la procédure aujourd’hui.Tout d’abord, diluez la protéine de fusion Ecad à 15 microgrammes par millilitre avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS, qui contient du calc

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

La méthode présentée ici décrit une solution évolutive et de bonnes pratiques de fabrication (BPF) système de différenciation -ready pour générer des cellules hépatocytes humains comme à partir de cellules souches pluripotentes. Il sert comme un système rentable et standardisée pour générer des cellules hépatocytes comme humains pour la recherche fondamentale et appliquée foie humain.

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Ce protocole décrit une approche semi-automatisée pour produire des cellules semblables à des hépatocytes de cellules souches pluripotentes humaines dans un format de 96 puits plat. Ce processus est rapide et rentable, ce qui permet que la production de qualité assurée des lots de cellules semblables à des hépatocytes pour la recherche humaine fondamentale et appliquée.

Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

Ce protocole décrit une approche pour produire des hépatosphères à partir de cellules souches pluripotentes humaines à l'aide d'un système de culture défini et de l'auto-assemblage cellulaire. Ce protocole est reproductible dans un certain nombre de lignées cellulaires, rentable et permet la production d'hépatosphères humaines stables pour une application biomédicale.

Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

L’objectif de cet article est de fournir une approche standardisée pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Le développement de cette procédure avec des formulations de milieux prêtes à l’emploi offre à l’utilisateur un système facile pour générer des cellules hépatiques humaines pour la recherche biomédicale et la traduction.

Spécification du progéniteur hépatique à partir de cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système de différenciation défini

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes peuvent être purifiés par tri cellulaire, en utilisant une combinaison de coloration de la molécule d’adhésion des cellules leucocytaires activées (ALCAM, également connue sous le nom de CD166).

Application de la coloration des mitochondries vivantes dans le tri cellulaire pour purifier les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Apprenez à différencier des cellules souches pluripotentes induites en hépatocytes pour le criblage à haut débit. Cette méthode permet de générer des cellules illimitées pour identifier des traitements contre les maladies du foie.

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

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