À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

L’objectif global de cette expérience est de différencier les cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules semblables à des hépatocytes d’une manière qui convient au criblage à haut débit. Les cellules hépatiques sont difficiles à cultiver en laboratoire, mais elles peuvent être générées à partir de cellules souches pluripotentes induites, ce qui fournit une plate-forme de criblage pour identifier les traitements des maladies du foie. Le principal avantage de cette technique est qu’un nombre illimité d’hépatocytes peut être généré à partir de n’importe quel patient atteint d’une maladie du foie qui récapitule la maladie en laboratoire.

La procédure est relativement facile à mettre en place, même sans connaissances approfondies en biologie des cellules souches. Sa reproductibilité permet aux chercheurs de cribler des milliers de composés sans avoir besoin de robotique complexe. Ray Liu, boursier postdoctoral, et Paige Lamprecht, étudiante diplômée, feront une démonstration de la procédure aujourd’hui.

Tout d’abord, diluez la protéine de fusion Ecad à 15 microgrammes par millilitre avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS, qui contient du calcium et du magnésium. Enduire des boîtes de culture tissulaire en suspension de 100 millimètres avec cinq millilitres de matrice diluée et incuber à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après l’incubation, retirer le substrat et le remplacer par cinq millilitres de milieu de culture iPSC.

Récupérer un flacon de cellules souches pluripotentes humaines induites par cryoconservation à partir d’azote liquide. Décongeler à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il reste un petit cristal de glace. Ensuite, pipetez doucement les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu de culture.

Centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez doucement les cellules en suspension avec cinq millilitres de milieu complété par dix micromolaires de Y-27632, un inhibiteur sélectif d’une protéine kinase associée à Rho, contenant des bobines enroulées. Maintenant, retirez le milieu de culture des boîtes de culture tissulaire en suspension de dix millimètres recouvertes d’Ecad et ajoutez cinq millilitres de cellules.

Une fois que les iPSC atteignent environ 80 % de confluence, retirez le milieu de culture et lavez-le une fois avec du DPBS sans calcium ni magnésium. Aspirez le DPBS et ajoutez une quantité suffisante de solution EDTA à 0,02 % pour couvrir la vaisselle. Ensuite, incubez les cellules jusqu’à trois minutes à température ambiante.

Dès que les cellules commencent à se libérer, retirez la solution EDTA à 0,02 % et inondez la parabole avec dix millilitres de milieu M pour libérer les cellules. Facilitez le détachement des iPSC par un pipetage doux. Transférez 1/10e des cellules en suspension dans une boîte de culture de tissus fraîche recouverte d’Ecad contenant cinq millilitres de milieu M.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, en changeant le milieu tous les jours. Récupérez un flacon de 250 microlitres de matrice glacée avec une concentration de deux milligrammes par millilitre et décongelez-le sur de la glace. Ensuite, combinez la matrice décongelée avec dix millilitres de DMEM/F12 froid en mélangeant doucement à l’aide d’une pipette pré-refroidie pour obtenir une concentration finale de 0,05 milligramme par millilitre.

Transférez 100 microlitres de la matrice diluée dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure. Après l’incubation, jeter la matrice et la remplacer par 50 microlitres de milieu M par puits, en répétant la même procédure de revêtement avec le reste des plaques.

Maintenant, cultivez les iPSC sur des boîtes de 100 millimètres jusqu’à ce que les cellules approchent 80 % de confluence. Pour récolter les iPSC de chaque plaque de 100 millimètres, aspirez le milieu de culture et rincez-le avec cinq millilitres de DPBS. Remplacez le rinçage par trois millilitres de solution de décollement cellulaire, comme l’Accutase.

Ensuite, incubez pendant environ deux minutes à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Dès que les cellules commencent à se détacher, récoltez en ajoutant sept millilitres de M medium. Pipetez plusieurs fois pour dissocier les colonies cellulaires en petits groupes d’environ trois à six cellules.

Ensuite, collectez les iPSC dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres et centrifugez à 300 G pendant cinq minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu M. Répartissez uniformément les cellules sur des plaques recouvertes d’une matrice de 96 puits en pipetant 50 microlitres de cellules de suspension dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

Ensuite, cultivez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone et répétez les procédures d’ensemencement cellulaire avec le reste des plaques. Examinez les plaques à 96 puits par microscopie pour vous assurer que les cellules couvrent au moins 70 % de la surface de chaque puits individuel. Pour le premier au deuxième jour de différenciation, remplacez le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de différenciation basé sur le RPMI par puits.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans de l’oxygène ambiant et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours avec un changement de milieu quotidien. Du troisième au cinquième jour de différenciation, remplacer le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de différenciation basé sur le RPMI complété par 2 % de B27 et 100 nanogrammes par millilitre de NA actif. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans de l’oxygène ambiant et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours avec un changement de milieu quotidien. Au cinquième jour de différenciation, traitez chaque puits avec 100 microlitres de solution EDTA à 0,02 % pendant 30 secondes et retirez la solution immédiatement.

Ajoutez 100 microlitres de milieu de différenciation frais à base de RPMI et répétez la même procédure pour le reste des plaques. Pour la différenciation entre les jours six à dix, remplacer le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de différenciation basé sur le RPMI. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours avec un changement de milieu quotidien.

Pour la différenciation entre les jours 11 à 15, remplacer le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de différenciation à base de RPMI, complété par 2 % de B27 et 20 nanogrammes par millilitre de HGF. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous 4 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours avec un changement de milieu quotidien. Pour différencier entre les jours 16 à 20, remplacer le milieu de culture par un milieu de culture de cellules hépatocytaires complété par 20 nanogrammes par millilitre d’oncostatine-M.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans de l’oxygène ambiant et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours avec un changement de milieu quotidien. À la fin de la différenciation le 20e jour, remplacer le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de culture de cellules d’hépatocytes frais complétés par 20 nanogrammes par millilitre d’oncostatine-M. Après une incubation de 24 heures, récupérez le milieu de culture dans une assiette fraîche à 96 puits et conservez-le à 20 degrés Celsius.

Répétez la même procédure de collecte pour le reste des plaques. Ajoutez 90 microlitres de milieu de culture cellulaire d’hépatocytes frais complété par de l’oncostatine-M dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Ajoutez dix microlitres de chaque composé choisi à partir d’une solution mère préalablement préparée.

Ajouter du DMSO à 0,2 % dans les puits témoins pour correspondre à la concentration finale dans les échantillons traités. Après une incubation de 24 heures, rassemblez le milieu de culture dans une assiette fraîche à 96 puits et conservez-le à 20 degrés Celsius. Répétez la même procédure de collecte pour le reste des plaques.

Après cinq jours de traitement, les cellules expriment des protéines qui sont exprimées de manière caractéristique dans l’endoderme définitif. Après cinq jours supplémentaires de différenciation, l’endoderme se convertit en un destin hépatique et les cellules expriment FOXA2 et HNF 4a. Après l’ajout de HGF, les cellules expriment les protéines présentes dans les hépatocytes fœtaux, et à la fin de la différenciation, les cellules adoptent une morphologie cuboïdale avec un noyau contenant des nucléoles proéminents et un grand cytoplasme avec de multiples gouttelettes lipidiques.

L’immunomarquage pour détecter HNF 4a et l’albumine au jour 20 de la différenciation montre que la distribution de ces protéines hépatocytaires est similaire dans tous les puits. Les iPSC ont été utilisées pour dépister les composés abaissant l’APOB afin de fournir un exemple d’utilisation d’hépatocytes dérivés d’iPSC pour le criblage de petites molécules. Le facteur z du test APOB est de 0,73, ce qui confirme la pertinence de l’utilisation de la plateforme pour la découverte de médicaments.

Le rapport post-médicament-pré-médicament de l’APOB a été déterminé pour chaque composé. Une identification des résultats a été réalisée par l’analyse du score z. 24 résultats potentiels avec un rapport APOB de 0,86 à 0,44 ont été identifiés.

Après avoir exclu les composés qui avaient un impact négatif sur la viabilité cellulaire, deux composés se sont avérés reproductibles pour réduire l’APOB. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 25 jours si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer quotidiennement du milieu frais.

Une concentration incorrecte des composants due à la dégradation modifiera la capacité des cellules à se différencier. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments pour explorer le traitement thérapeutique des maladies du foie à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et de conserver des cellules souches pluripotentes induites humaines et d’effectuer une différenciation hépatique sous une petite forme pressée en surface pour le criblage à haut débit.

N’oubliez pas que travailler avec des cellules souches pluripotentes induites par l’homme peut être extrêmement dangereux et que l’équipement de protection individuelle, tel que des gants et une blouse de laboratoire, doit toujours être porté lors de cette procédure.