Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Bonjour, je m’appelle Dr. Robert Schaut et je suis scientifique au National Animal Disease Center à Ames, dans l’Iowa. Dans cette vidéo JoVE, nous partagerons avec vous des informations sur la collecte et le traitement des ganglions lymphatiques de grands animaux pour une utilisation dans des expériences sur l’ARN en aval. Par exemple, ces expériences peuvent inclure la PCR quantitative sur des produits transcrits en sens inverse, ou des études de séquençage de l’ARN de transcriptomes.

Les ganglions lymphatiques sont des échantillons utiles pour l’évaluation des réponses immunitaires de l’hôte, mais peuvent également fournir une source d’ARN pathogène pour l’étude, comme dans le cas des agents pathogènes intracellulaires présents dans les cellules immunitaires à l’intérieur des ganglions lymphatiques. Des échantillons de grands animaux, y compris des animaux d’élevage et des espèces sauvages, présentent un intérêt pour l’étude des zoonoses. Ici, au National Animal Disease Center, nous étudions les infections du bétail par des espèces comme brucella abortus, qui provoque la brucellose chez les bovins et les bisons, et E.Coli O157 :H7 comme excrétée des traces intestinales des bovins.

Nous récupérerons également des échantillons de tissus d’espèces sauvages, comme les cerfs et les wapitis. Une gamme de ganglions lymphatiques peut être prélevée sur des animaux infectés par différentes maladies. Les études des tissus de ces espèces hôtes naturelles sont généralement plus pertinentes pour la progression naturelle de la maladie que les modèles murins.

Cependant, le processus de prélèvement de tissus chez les grandes espèces est nécessairement plus compliqué que chez la souris, notamment le délai plus long entre l’euthanasie et le prélèvement de tissus, et une plus grande taille de ganglions lymphatiques. Ici, nous présenterons un protocole pour l’isolement des ganglions lymphatiques de grands animaux pour l’étude de l’ARN qui sera informatif pour les biologistes moléculaires impliqués dans les études transcriptomiques des infections chez les grands animaux, ainsi que pour les chercheurs vétérinaires qui commencent des études transcriptomiques. Dans cette vidéo, nous allons faire la démonstration des procédures sur les ganglions lymphatiques chez les bovins.

Avant la nécropsie, nous vous recommandons d’assembler les fournitures suivantes spécifiques à la procédure d’isolement des tissus. Des tubes microfuges remplis d’environ 1 ml de conservateur de tissu à ARN, comme RNAlater, des scalpels jetables, des pinces propres et autoclaves, des aiguilles à biopsie, un récipient pour objets tranchants pour les scalpels et les aiguilles usagés, et une planche à découper ou un plateau jetable, selon le niveau d’infectiosité des matériaux impliqués. Dans ce cas, nous démontrerons les éléments clés de la procédure en utilisant les ganglions lymphatiques que nous recueillons généralement chez les bovins.

Ils sont infectés par des bactéries qui causent la brucellose. Il s’agit des ganglions lymphatiques préscapulaires et du ganglion lymphatique parotidien. Lors de la réalisation d’une autopsie animale à grande échelle pour la récupération de l’ARN, il est utile d’avoir au moins trois participants travaillant sur des tissus animaux.

Le dissecteur un sera chargé de sectionner les différents morceaux de l’animal chez les grands animaux, le deuxième récupère les ganglions lymphatiques de différentes sections d’animaux à la table de nécropsie principale, et le troisième dissecteur travaille à une table séparée pour isoler les sections de chaque ganglion lymphatique et les transférer dans des tubes avec une solution de conservation. Nous commencerons par l’identification et l’ablation du ganglion lymphatique préscapulaire. Idéalement, la palpation d’un ganglion lymphatique, avant le curage, aidera à identifier l’emplacement du ganglion lymphatique.

Bien qu’il ne soit pas toujours possible de le détecter, le ganglion lymphatique préscapulaire est généralement palpable chez un animal en bonne santé. Commencez par placer l’animal en position couchée latérale. Étendez l’épaule en déplaçant le membre avant vers l’arrière au niveau du genou.

Ce mouvement ramènera l’épaule vers l’arrière et permettra une palpation facile du ganglion lymphatique. Sentez la présence du ganglion lymphatique comme indiqué. Une fois localisé, et avec l’épaule toujours tendue, utilisez un scalpel ou un couteau à nécropsie pour faire une incision cutanée le long du contour de l’épaule.

Rétractez la peau pour révéler la pointe de la musculature de l’épaule et du cou. Une section de graisse sous-cutanée est parfois observée, en particulier chez les animaux surconditionnés. Le ganglion lymphatique préscapulaire est souvent trouvé avec des sections de graisse sous-cutanée.

Ici, vous pouvez voir les trois couches de la peau, du muscle et de la graisse sous-cutanée. Encore une fois, palpez l’emplacement d’un ganglion lymphatique. Contrairement à la graisse sous-cutanée, le ganglion lymphatique conservera sa forme lorsqu’il sera palpé.

Après avoir localisé le ganglion lymphatique préscapulaire, disséquez soigneusement la graisse sous-cutanée et disséquez le ganglion lymphatique. L’apparence de ces ganglions lymphatiques chez le bison, que nous avons utilisés dans les études sur la brucellose en raison de la sensibilité des bisons de la région du Grand Yellowstone à la brucella, est similaire. Ici, nous démontrons l’apparence du ganglion lymphatique préscapulaire, tel qu’il est disséqué à partir de l’épaule droite d’un bison d’Amérique.

Ensuite, nous passerons à l’isolement du ganglion lymphatique parotidien. Avec l’animal en décubitus latéral, localisez l’articulation temporo-mandibulaire. À l’aide d’un scalpel ou d’un couteau à nécropsie, faites soigneusement une incision sur la peau.

Commencez dorsalement à l’articulation et étendez-vous verticalement le long de la ligne de la mâchoire. Disséquez la peau pour révéler le tissu sous-cutané. La glande salivaire parotide sera visible, d’abord en raison de sa grande taille, de son aspect de surface lobulée et de sa coloration rouge.

À l’aide d’une pince et d’un scalpel, écartez la glande salivaire parotide pour trouver le ganglion lymphatique parotide situé juste à côté du crâne et du milieu de la glande salivaire. Lors de l’isolement du ganglion lymphatique parotide, il est essentiel de séparer le tissu ganglionnaire du tissu de la glande salivaire parotide. Les types de tissus semblent distincts, y compris dans la section transversale des tissus.

C’est ce que l’on peut observer ici, avec le ganglion lymphatique parotide à gauche et la glande salivaire parotide à droite. Assurez-vous d’examiner attentivement la texture du tissu des ganglions lymphatiques parotides avant de poursuivre le traitement. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’exciser la glande salivaire parotide afin de localiser le ganglion lymphatique parotide.

Voici un exemple de glande parotide excisée d’un bouvillon, dans laquelle le ganglion lymphatique était encastré dans la glande salivaire et n’était pas visible avant l’ablation de la glande. Des informations supplémentaires sur l’identification de certains ganglions lymphatiques sont fournies dans le manuscrit principal. Une fois que les ganglions lymphatiques ont été prélevés, vous êtes prêt à exciser des sections pour la préservation.

À l’aide d’un scalpel ou d’un couteau à nécropsie, retirez une section du ganglion lymphatique et faites une coupe sagittale pour ouvrir le ganglion lymphatique. Examinez l’intérieur du ganglion lymphatique, en particulier chez les échantillons provenant d’animaux infectés, à la recherche d’asymétrie, de lésions, de différences de couleur, etc. Dans ce ganglion lymphatique préscapulaire bovin, de multiples caractéristiques sont visibles à l’œil nu.

Il s’agit notamment des follicules, qui abritent les lymphocytes B, et des unités corticales profondes, qui abritent les lymphocytes T. Ces raisons apparaissent plus foncées que les sinus médullaires, qui sont plus clairs. Ici, un autre exemple de ganglion lymphatique non infecté est représenté.

Ce ganglion lymphatique provient d’un bison plus jeune. Notez que les follicules sont moins distincts dans cet exemple. Afin de sectionner les tissus pour le traitement, une option consiste à prélever de petits morceaux de tissus de chaque ganglion lymphatique avec un scalpel pour la récupération ultérieure de l’ARN.

Cependant, l’un des principaux défis de la comparaison des profils d’expression entre les échantillons est la grande taille des grands ganglions lymphatiques animaux, par rapport à un ganglion lymphatique de souris qui peut être facilement extrait entier pour l’extraction de l’ARN. Par conséquent, de petites sections de tissu ne capturent pas uniformément le profil des cellules d’un ganglion lymphatique. Au lieu de cela, pour capturer des cellules sur le profil d’un ganglion lymphatique, excisez un coin en forme de tarte du ganglion lymphatique, coupez-le en petits morceaux d’au plus 5 mm d’épaisseur et placez-le, avec une pince, dans des tubes contenant de l’ARN.

Vous pouvez également utiliser des méthodologies de biopsie pour exciser des sections de tissu de chaque ganglion lymphatique. Sélectionnez l’outil de biopsie à l’emporte-pièce si vous souhaitez prélever des sections spécifiques, telles que des follicules spécifiques du ganglion, puis transférer, avec des pinces, vers RNAlater. Une fois que les échantillons ont été transférés dans RNAlater, transférez-les à nouveau au laboratoire et conservez-les à 4 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre la pénétration des tissus.

Ensuite, débarrassez-vous de l’excès d’ARN et stockez les échantillons de tissus à 80 degrés Celsius. L’un des avantages de l’utilisation d’une solution de conservation à ARN est que l’azote liquide n’est pas nécessaire à l’autopsie, ni lors du prélèvement d’échantillons sur le terrain. Avant d’accéder aux échantillons, pré-aliquote le réactif Trizol dans les tubes pour l’homogénéisation.

Une fois les échantillons sortis du congélateur, transférez-les immédiatement dans le réactif Trizol pour un traitement ultérieur, selon les recommandations du fabricant. Ici, un morceau de 50 à 100 mg de tissu est transféré dans le réactif Trizol. Limitez autant que possible la décongélation avant l’ajout de Trizol.

Le stockage sur glace sèche peut être utilisé lorsque plusieurs échantillons sont sortis du congélateur pour le traitement. Placez les tubes sur l’homogénéisateur et homogénéisez dans le réactif Trizol. Ici, un réglage d’extraction d’ARN de deux minutes est utilisé.

Une fois terminé, vérifiez s’il y a une apparence trouble. Répétez l’opération si nécessaire. Suivez le protocole du fabricant pour générer des couches aqueuses et organiques pour chaque échantillon.

Retirez la phase aqueuse claire supérieure à l’aide d’une pointe de pipette. Transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ensuite, mélangez avec un volume égal de 100 % d’éthanol.

Mélanger. Le tube apparaîtra souvent trouble. À l’aide d’une pointe de micro-pipette, transférez le liquide dans une colonne de centrifugation commerciale à base de silice pour purifier puis éluer davantage votre ARN.

Pour évaluer la qualité de l’ARN, chargez un ou deux litres de l’échantillon d’ARN élué dans un spectrophotomètre pour analyse. Une fois la procédure terminée, nous observons des rapports d’absorbance d’environ deux pour le rapport 260-280 et le rapport 260-230, indiquant une grande pureté avec un transfert chimique minimal. Une contamination par le phénol serait observable à partir d’une diminution du rapport d’absorbance de 260-230 nm.

Au cours de la procédure d’autopsie, dans le cas d’animaux comme le bison, nous avons observé une période d’au moins 20 minutes entre l’euthanasie et le transfert du premier échantillon de tissu dans un agent de conservation. En revanche, les ganglions lymphatiques de souris peuvent être retirés et préservés après l’euthanasie en quelques minutes. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à caractériser le profil de dégradation des ganglions lymphatiques au fil du temps.

Dans le manuscrit principal, nous avons également compilé un résumé des profils de stabilité de l’ARN dans une gamme d’autres types de tissus qui ont été testés dans d’autres publications. Dans des expériences représentatives, menées avec des ganglions lymphatiques de bisons, la stabilité de l’ARN était relativement constante au cours d’une heure après l’euthanasie. Ici, nous représentons une image en gel de l’ARN total purifié à partir de morceaux de tissu ganglionnaire supramammaire d’un bison d’Amérique.

Cette constatation est cohérente avec les données antérieures pour d’autres types de tissus compilées à partir de la littérature. Cela suggère que des échantillons de qualité acceptable pour l’analyse en aval de l’expression génique peuvent être prélevés même sur des espèces plus difficiles comme le bison et le wapiti. Cependant, il est important de comprendre que des délais plus longs entre la mort et la conservation de l’échantillon peuvent entraîner des changements dans les profils d’expression de l’ARN, y compris une augmentation de la dégradation à partir de trois extrémités premières des transcrits de l’ARNm.

Par conséquent, il est toujours important d’utiliser un flux de travail rapide et rationalisé pour la récupération des tissus afin de réduire les délais supplémentaires une fois que l’animal est disponible pour la nécropsie, afin d’obtenir les profils d’ARN les plus valides sur le plan biologique. De plus, on note qu’il faut veiller tout au long de la procédure à éviter l’introduction de contaminants ARN dans les échantillons tout au long du processus, au-delà de ceux qui sont déjà présents dans les tissus. Cela comprend l’utilisation de gants dans le cadre des autres équipements de protection individuelle requis.

Nous aliquotes également le produit final de l’ARN dans plusieurs tubes afin de limiter autant que possible le freestalisation des échantillons d’ARN. Par exemple, des aliquotes distinctes peuvent être stockées pour être utilisées dans les tests de contrôle de la qualité. En résumé, dans cette vidéo, nous avons fourni des informations importantes pour l’identification, la collecte, l’échantillonnage représentatif et le traitement des ganglions lymphatiques pour l’analyse de l’expression génique en aval.

Bien que notre vidéo représentative ait été présentée avec des exemples de bovins et de bisons, nous avons également travaillé avec des ganglions lymphatiques d’autres grandes espèces, notamment les chèvres et les wapitis. Nous espérons que cette vidéo vous sera utile dans votre travail, que vous soyez un scientifique vétérinaire envisageant l’utilisation de méthodes transcriptomiques dans votre travail, ou un biologiste moléculaire intéressé à s’aventurer dans le domaine de la science des grands animaux.