Variations sur négatif tachent les méthodes de microscopie électronique : outils pour s’attaquer à contester les systèmes

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer plusieurs variantes différentes de techniques de préparation d’échantillons de microscopie électronique à transmission de coloration négative. La coloration négative est le meilleur moyen d’évaluer rapidement la qualité d’un échantillon EM. Il est important de reconnaître que différentes techniques de préparation de grille fonctionnent mieux pour certains échantillons.

La technique qui fonctionne le mieux pour un échantillon donné doit être déterminée par essais et erreurs. Pour commencer, préparez les grilles EM à l’aide de la méthode de la feuille de carbone et préparez les réactifs de coloration négative comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Placez une grille EM recouverte d’une feuille de carbone vers le haut sur une lame de microscope.

Placez la glissière dans une unité de décharge luminescente et traitez la grille pendant au moins 30 secondes à 10 milliampères pour rendre la grille hydrophile. Lorsque vous avez terminé, retirez l’échantillon de l’unité de décharge. Ensuite, utilisez une pince à épiler à pression négative pour saisir le bord de la grille.

Pour colorer à l’aide de la méthode du transfert latéral, appliquez d’abord trois à cinq microlitres de l’échantillon sur la surface de support. Laissez l’échantillon s’adsorber sur la surface de la grille pendant 10 secondes à une minute, puis touchez le bord de la grille à une feuille de papier filtre et laissez l’action capillaire retirer le liquide. Ensuite, placez 50 gouttes d’un microlitre d’eau ultrapure ou d’une solution tampon volatile appropriée sur une feuille de film de laboratoire.

Touchez doucement la surface en carbone de la grille jusqu’à la goutte et soulevez une petite gouttelette sur la surface de la grille. Ensuite, touchez le bord de la grille à une feuille de papier filtre et laissez l’action capillaire retirer le liquide. Ensuite, placez deux gouttes de 50 microlitres de réactif de coloration sur une feuille de film de laboratoire.

Touchez doucement la surface en carbone de la grille jusqu’à la goutte et soulevez une petite gouttelette sur la surface supérieure de la grille. Si la tache migre à l’arrière de la grille, le film de carbone a été brisé et il doit être jeté. Après 10 à 15 secondes, touchez le bord de la grille à une feuille de papier filtre et laissez l’action capillaire aspirer le liquide.

Répétez cette étape de coloration une fois de plus, puis laissez la grille sécher à l’air. Pour colorer l’échantillon à l’aide de la méthode du effleurement, saisissez le bord de la grille à l’aide d’une pince à épiler à pression négative et appliquez trois à cinq microlitres d’échantillon sur la surface de support. En tenant la pince à épiler d’une main, inclinez la grille de manière à ce qu’elle soit à environ 45 degrés face à l’extérieur et effleurez rapidement le poignet pour éliminer la majorité des gouttelettes qui se trouvent au-dessus de la grille.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, appliquez une goutte de solution de lavage sur la surface de support. Retirez la goutte et répétez l’opération plusieurs fois pour laver l’échantillon. Ensuite, appliquez une goutte de réactif de coloration sur la surface de support et retirez à nouveau la gouttelette.

Répétez cette étape de coloration une à trois fois, en fonction de la profondeur de coloration requise pour la visualisation de l’échantillon. Enlevez l’excès de tache en touchant le bord déchiré d’un morceau de papier filtre sur le bord de la grille, puis laissez la grille sécher à l’air. Pour colorer l’échantillon à l’aide de la méthode de rinçage rapide, prélevez d’abord 30 à 70 microlitres de colorant dans l’extrémité d’une pipette de 200 microlitres.

Tournez le cadran de volume pour aspirer cinq microlitres d’air, puis prélevez cinq à 30 microlitres de réactif de lavage, suivis d’un autre petit espace d’air, avant cinq autres microlitres d’échantillon. Saisissez le bord d’une grille à l’aide d’une pince à épiler à pression négative et inclinez la grille d’environ 45 degrés vers l’extérieur. D’un mouvement rapide, éjectez tout le contenu de la pointe de la pipette sur la face de la grille EM recouverte de carbone.

Enlevez l’excès de teinture en touchant le bord déchiré d’un morceau de papier filtre sur le bord de la grille et laissez la grille sécher à l’air. Le choix idéal pour une coloration négative dépend fortement de l’échantillon. La coloration la plus couramment utilisée est l’acétate d’uranyle, mais les teintures de lanthanide peuvent également être utilisées.

Pour les échantillons profondément incrustés, les colorants à base de lanthanides, l’acétate de thulium et l’acétate d’erbium, ont produit une coloration négative de qualité équivalente à celle de l’acétate d’uranyle, à en juger par le contraste apparent et la netteté des particules colorées, l’acétate de thulium produisant des images plus claires et plus nettes que l’acétate d’erbium. La grande taille des grains d’acétate de thulium devient apparente à un fort grossissement, comme le montre ici un échantillon de particules fibreuses de mosaïque de tabac coloré avec 1 % d’acétate de thulium. En utilisant de l’acétate de thulium, la répétition de 23 angström de la particule fibreuse de la mosaïque du tabac est clairement visible à l’œil nu.

Aucune des autres teintures de lanthanides testées n’a été en mesure de résoudre cette caractéristique. Un autre échantillon difficile à imager est la protéine C dérivée du muscle. Cet échantillon produit des images significativement différentes selon la méthode de coloration.

Lorsqu’il est coloré avec une méthode de transfert latéral, il apparaît comme une structure globulaire et effondrée en forme d’aile. Lorsque des grilles sont préparées par la méthode du effleurement, la protéine C est observée comme une série de domaines qui ressemblent à des perles sur un fil. Cela représente mieux la structure réelle de la protéine C.

Une fois masterisé, il ne faut qu’une minute environ pour préparer un échantillon coloré négativement. Il est important de se rappeler que chaque échantillon réagit différemment à chaque technique de coloration. Pour les nouveaux échantillons, la meilleure approche doit être déterminée expérimentalement.

N’oubliez pas que les réactifs de coloration à l’uranyle sont toxiques et légèrement radioactifs. Assurez-vous qu’ils sont éliminés dans un flux de déchets approprié.