Name: Un système de Microbiomechanical pour l’étude de la Formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez une méthode par fluide pressurisé pour induire des varicosités réversibles sur les axones de neurones hippocampiques en culture. Cette technique permet d'étudier la plasticité neuronale mécanique et de développer des stratégies thérapeutiques pour les lésions cérébrales.

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Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon le National Institutes of Health Animal usage Guidelines. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du National Institutes of Health (R01NS093073 et R21AA024873) de C. Gu.

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<li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/23/1/015002">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002(2013).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La procédure de ce test de microbiomechanical est simple. Il va produire des résultats fiables, si toutes ses étapes sont réalisées avec soin. Il y a plusieurs étapes clés qui, si mal exécutée, vont entraver la collecte de données réussie. Les étapes critiques commencent en amont de la demande réelle du stimulus bouffée. Dissection minutieuse, culture et soins de la culture de neurones primaires sont primordiaux. Si les neurones en culture ne sont pas en bonne santé, ils ne réagiront pas systématiquement, car ils pourrai...

Varicosité formation, ou gonflement/perler, le long des axones, est une caractéristique importante de la neurodégénérescence observée dans de nombreux troubles ou de lésions du système nerveux central, y compris la sclérose en plaques, maladie d’Alzheimer, de Parkinson et traumatique Brain injury1,2. Malgré les impacts physiologiques importantes de varicosités axonales sur la propagation du potentiel d’action et de la transmission synaptique3, comment naissent les varicosités reste inconnue. Récemment, à un dosage microbiomechanical nouvellement créé sur les neurones hippocampal cultivés contre les rongeurs, nous avons constaté que des stimuli mécaniques peuvent induire des varicosités dans ces neurones avec intriguant très caractéristiques. Tout d’abord, l’induction de la varicosité est rapide (< 10 s) et ce processus est réversible de façon inattendue. Deuxièmement, initiation varicosité dépend de la puissance soufflant la pression : plus la pression, plus vite l’initiation. En troisième lieu, initiation varicosité dépend de l’âge neuronale. Les axones des neurones plus jeunes semblent plus sensibles aux contraintes mécaniques, comparées à celles des neurones plus âgés. Quatrièmement, la forme de varicosités le long des axones des neurones de l’hippocampe, tandis que les dendrites et les segments de l’axone initiale de ces neurones n’afficher aucun changement dans les mêmes conditions de bouffées. Ainsi, notre étude a révélé une nouveauté de la polarité neuronale. Ces résultats avec le système in vitro sont physiologiquement pertinents. À l’aide d’un modèle in vivo pour léger traumatisme crânien léger (TCL), nous a montré que les varicosités axonales élaboré d’une manière multi-focale dans le cortex somatosensoriel des souris immédiatement après le choc de clôture-crâne, conforme à notre in vitro résultats4. Il est important de noter que notre coloration et d’imagerie des souris TCCL fournissent seulement un instantané des changements morphologiques neuronales, depuis l’exécution en vivo imagerie Time-lapse de la morphologie neuronale lors d’un impact mécanique n’est toujours pas réalisable.
Ce système fluide-bouffant nous a permis non seulement de capturer les particularités associées à la formation mécanique varicosité induite par le stress, mais aussi de déterminer le mécanisme sous-jacent. En testant différentes solutions extracellulaires, les bloqueurs et les ouvreurs de différents candidats des canaux ioniques mécanosensibles et de l’électrophysiologie cellulaire, nous avons identifié que le cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 4 (TRPV4) canal est perméable aux Ca2 + et Na+ et activables par bouffées est principalement responsable de la détection des contraintes mécaniques initiales au cours de la varicosité axonale formation4. Ceci a été confirmé plus loin avec une approche d’élimination directe de siARN. Pris ensemble, ce nouveau système de test, que nous avons mis au point avec la culture de neurones hippocampiques, est très précieux pour l’étude des propriétés de micromécanique des neurones centraux, en particulier en combinaison avec d’autres techniques.
Ce système de micromécanique, que nous avons mis en place est unique et diffère des systèmes déjà existants sous plusieurs aspects importants. Tout d’abord, dans ce système, les neurones expérience hors-plan des contraintes mécaniques dans les formes de compression et de cisaillement. Lors de l’impact mécanique, processus neuronaux restent attachées à la surface de la lamelle couvre-objet et ne bougent pas. Cela diffère des autres systèmes qui occupe principalement la flexion et l’extension dans le plan expérimental (ou tension), par exemple, la déviation des axones groupés comme se déplaçant chaînes5,6 ou l’étirement des axones cultivés sur micromotifs canaux et membranes extensible7,8. En outre, même si les varicosités axonales peuvent également être induites dans ces épreuves comme dans notre système fluide-bouffant, le processus dans ces milieux prend beaucoup plus de temps (à partir de 10 min à plusieurs heures6,7,8) et apparaît irréversibles. Enfin, notre système à l’aide locale fluide soufflant permet l’examen des caractéristiques spatiales de formation varicosité (e.g., dendrites, des épines dendritiques, soma, axonales segments initiaux bornes axonales), outre ses caractéristiques temporelles. Grâce à ce système, nous avons découvert plusieurs fonctionnalités inattendues et uniques de formation de varicosité axonale, surtout un début rapide, lente réversibilité et polarité axon-dendrite.
Le système que nous discutons dans cet article est compatible avec nombreuses techniques de moléculaire et biologie cellulaire. Par exemple, pour étudier les effets du stress mécanique sur la morphologie neuronale et la fonction, il peut être utilisé avec la co-culture de myelin, Time-lapse d’imagerie de fluorescence (FRBR), de la réflexion totale interne et de transfert d’énergie de fluorescence de résonance (FRET) imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Dans cet article, nous nous concentrons sur les composants principaux du système. Culture de neurones hippocampiques, le fluide-bouffées d’installation, une imagerie Time-lapse pour le transport axonal et imagerie calcique sont illustrées étape par étape ci-dessous.

<table><tbody><tr><td>lamelles de 12 mm&nbsp ;</td><td>Warner Instruments&nbsp ;</td><td>64-0702</td><td>pour plaque à 24 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>lamelles de recouvrement de 25 mm&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12-545-102&nbsp ;</td><td>pour plaque à 6 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de queue de rat&nbsp ;</td><td>Roche ;</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp ;</td><td>Diagnostics nationaux&nbsp ;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4Fisher</td> <td>Scientific&nbsp ;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme protéase&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Sels d’Earle&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosine (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Média Opti-MEM&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>réactif</td> de <td>transfection</td> 1854313</tr><tr><td>Barres en borosilicate&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp ;</td><td>PG52151-4</td><td>pour pipette à souffler</td></tr><tr><td>tube en caoutchouc&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>Seringue et piston en plastique 10cc</td><td>Becton Dickinson&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Sutter Instruments&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>Fluo-4 AM</td><td>F14201</td><td>pour l’imagerie calcique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Construction Mito-YFP&nbsp ;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp ;</td><td></td><td>pour la transfection cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Construction YFP-N1&nbsp ;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp ;</td><td></td><td>pour la transfection cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Modèle P-1000 Extracteur de micropipette flamboyant/brun</td><td>Sutter Instruments&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mcroscope Eclipse TE2000-U&nbsp ;</td><td>Objectif Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Objectif 062933 Nikon</td><td></td><td>·</td></tr><tr><td>Objectif à l’huile Apo TIRF 100x/1.49</td><td>Objectif MRD01991 Nikon</td><td></td><td>·</td></tr></tbody></table>

un système de microbiomechanical pour l’étude de la formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Varicosités axonales sont des structures élargies sur les arbres des axones avec un haut degré d’hétérogénéité. Ils sont présents dans le cerveau avec des blessures ou de maladies neurodégénératives, mais aussi dans le cerveau normal. Nous décrivons ici un système nouvellement créé micromécaniques pour rapide, fiable et réversible induisent des varicosités axonales, ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui régissent la formation varicosité et composition en protéines hétérogènes. Ce système représente un moyen novateur d’évaluer les effets des contraintes de compression et de cisaillement sur les différents compartiments subcellulaires des neurones, différents des autres systèmes in vitro qui portent principalement sur l’effet de l’étirement. Ce qui est important, en raison des particularités de notre système, nous avons récemment fait une découverte montrant que l’application du fluide sous pression peut rapidement et de façon réversible induire axonales varicosités par l’activation d’un canal de potentiel récepteur transitoire. Notre système biomécanique peut être idéalement utilisé en combinaison avec la perfusion de médicaments, l’imagerie de cellules vivantes, imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Par conséquent, cette méthode peut adopter pour l’étude des canaux ioniques mécanosensibles, règlement transport axonal, dynamique du cytosquelette axonal, calcium de signalisation et les changements morphologiques liés à un traumatisme crânien.

Avant de souffler, les axones présentent normalement peu formation varicosité. Suivant soufflant avec notre pression standard (hauteur de2O 190 mmH), le début des axones à développer de nombreuses perles comme varicosités. La formation de varicosités est partiellement réversible, comme illustré par les régions de l’axone, retournant à leur état préalablement gonflé après une période de récupération de 10 min (Figure 2A-B). Après un...

Ce protocole décrit une approche fluide pressurisée physiologiquement pertinente pour l’induction rapide et réversible de varicosités dans les neurones.

Un système de Microbiomechanical pour l’étude de la Formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

L’objectif global de cette configuration de fluide pressurisé est de produire des gonflements reproductibles et cohérents le long des axones des neurones en culture. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions cérébrales, telles que les mécanismes à l’origine des changements morphologiques subcellulaires dans les neurones après une lésion. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit des changements morphologiques cohérents et reproductibles qui se rétablissent avec le temps.C’est une technique très importante que nous avons développée en laboratoire. En effet, nous pouvons non seulement utiliser le système pour identifier le mécanisme moléculaire régissant le changement de morphologie axonale induit par le stress mécanique comme une nouvelle forme de plasticité neuronale, mais aussi utiliser le système comme outil de dépistage pour identifier de nouveaux médicaments et la stratégie de traitement des lésions cérébrales légères ou traumatiques. Pour commencer cette procédure, placez une ou plusieurs boîtes de lamelles de 12 millimètres ou 25 millimètres dans un bécher en verre contenant 70 % d’acide nitrique, et incubez les la

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En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

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Cette vidéo présente une méthode de suivi du transport axonal dans les motoneurones à l’aide d’un système de chambre microfluidique. Il s’agit de cultiver des tissus embryonnaires de la moelle épinière de souris dans des puits recouverts de polymères avec un milieu nutritif pour induire la croissance axonale. Le mouvement des organites colorés par fluorescence dans l’imagerie en direct confirme le transport axonal bidirectionnel.

Suivi du transport axonal d’organites dans les motoneurones à l’aide d’un dispositif microfluidique

Cette vidéo démontre l’induction de varicosités axonales en appliquant un stimulus micromécanique sur les neurones. Le système comprend une micropipette fixée à une seringue contenant un tampon via un tube. À l’aide d’un micromanipulateur, la micropipette est positionnée au-dessus des neurones. Une pression de fluide est ensuite appliquée pour induire des varicosités dans les axones.

Induire des varicosités axonales avec un stimulus micromécanique sur les neurones

Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Imagerie à deux photons, couplé à nanodissection laser, sont des outils utiles pour étudier les processus dégénératifs et régénératifs dans le système nerveux central avec une résolution subcellulaire. Ce protocole indique comment étiqueter, image, et disséquer fibres grimpantes simples dans le cortex cérébelleux in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Nous présentons un protocole utilisant la microscopie time-lapse à excitation de deux photons pour visualiser simultanément la dynamique des lésions axonales et myélines en temps réel. Ce protocole proposé permet d’étudier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui peuvent influencer le destin des axones myélinisés centraux après une blessure et contribuer à une invalidité clinique permanente.

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Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.

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