Un système de Microbiomechanical pour l’étude de la Formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux

L’objectif global de cette configuration de fluide pressurisé est de produire des gonflements reproductibles et cohérents le long des axones des neurones en culture. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions cérébrales, telles que les mécanismes à l’origine des changements morphologiques subcellulaires dans les neurones après une lésion. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit des changements morphologiques cohérents et reproductibles qui se rétablissent avec le temps.

C’est une technique très importante que nous avons développée en laboratoire. En effet, nous pouvons non seulement utiliser le système pour identifier le mécanisme moléculaire régissant le changement de morphologie axonale induit par le stress mécanique comme une nouvelle forme de plasticité neuronale, mais aussi utiliser le système comme outil de dépistage pour identifier de nouveaux médicaments et la stratégie de traitement des lésions cérébrales légères ou traumatiques. Pour commencer cette procédure, placez une ou plusieurs boîtes de lamelles de 12 millimètres ou 25 millimètres dans un bécher en verre contenant 70 % d’acide nitrique, et incubez les lamelles à température ambiante pendant la nuit.

Le lendemain, transférez toutes les lamelles dans un bécher de quatre litres rempli de 2,5 litres d’eau doublement distillée. Secouez le bécher contenant les lamelles pendant une heure à 100 tr/min, et n’oubliez pas d’utiliser des élastiques pour maintenir le bécher pendant le secouage. Ensuite, transférez les lamelles nettoyées dans une fiole sèche avec le couvercle métallique.

Faites cuire les lamelles dans un four à 225 degrés Celsius pendant six heures. Ensuite, laissez-les refroidir à température ambiante et conservez-les dans un récipient en plastique stérilisé jusqu’à utilisation. Maintenant, placez une lamelle dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.

Ajoutez 30 microlitres de solution de revêtement de lamelle sur une lamelle de 12 millimètres et faites tourbillonner. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS stérile dans chaque puits. La plaque peut être utilisée immédiatement ou conservée à quatre degrés Celsius dans du PBS stérile jusqu’à une semaine.

Le jour de la dissection, retirez le PBS de la plaque. Sécher à l’air libre et placer la plaque sous lumière UV pendant deux à quatre heures. Pour dissocier les neurones de l’hippocampe pour la culture, décongelez la solution d’enzyme protéase et préchauffez le milieu de placage à 37 degrés Celsius.

Ensuite, rincez l’hippocampe disséqué avec SLDS. Ensuite, retirez-le et ajoutez deux millilitres de solution d’enzyme protéase et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, lavez deux fois les explants de l’hippocampe avec cinq à 10 millilitres de milieu de placage et ajoutez cinq millilitres de milieu de placage.

Dissociez les explants de l’hippocampe en cellules uniques en générant un petit vortex à l’aide d’une pipette avec un embout en plastique d’un millilitre. Pipette de haut en bas environ 40 fois en évitant la formation de bulles d’oxygène jusqu’à ce que la solution devienne trouble et qu’il ne reste plus de gros morceaux d’explant. Ensuite, centrifugez les cellules à 1, 125 fois la gravité pendant trois minutes.

Retirez le surnageant avec les cellules immergées dans le milieu et remettez les cellules en suspension dans 145 millilitres de milieu de placage. Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire par puits dans une plaque de 24 puits. Incuber les cellules dans le milieu de placage à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.

Ensuite, retirez le milieu de placage et remplacez-le par un produit d’entretien frais. Après deux jours, remplacez la moitié du milieu par deux RSC micromolaires dissous dans un milieu d’entretien pour inhiber la croissance des cellules fibroblastes, endothéliales et gliales. Ensuite, après avoir exposé les cellules à la RSC pendant deux jours, remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais.

Pour effectuer une transfection pour la visualisation de la morphologie cellulaire, diluez la construction à partir du stock à un microgramme par microlitre dans un milieu Opti-MEM et vortex. Ensuite, diluez le réactif de transfection médié par les liposomes dans un milieu Opti-MEM et un vortex. Par la suite, préparez une dilution de construction et une dilution de transfection pour chaque puits.

Ensuite, préparez un mélange individuel de la construction et du milieu Opti-MEM et du réactif de transfection et du milieu Opti-MEM et du vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, retirez la moitié du milieu de chaque puits et transférez ce milieu dans un tube conique propre.

Conservez le tube dans l’incubateur, puis ajoutez 100 microlitres du mélange préparé à l’étape précédente au milieu restant dans le puits. Laissez les cellules incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Pendant l’incubation, ajoutez un volume de milieu d’entretien frais au milieu dans le tube conique et placez le mélange dans le même incubateur.

Après l’incubation, retirer des puits les milieux contenant la solution de transfection et les remplacer par le mélange individuel de milieu d’entretien ancien et frais dans le tube conique. Dans cette procédure, insérez la pipette dans le haut de la vis du micromanipulateur pour la maintenir en place. Vissez la vis plate en métal fixée au bras du micromanipulateur de manière à ce qu’elle maintienne l’extrémité non tirée de la pipette juste au-dessus de l’endroit où le tube en caoutchouc est fixé.

Inclinez la pipette à un angle de 45 degrés avec la surface du neurone contenant les lamelles. Activez le filtre fluorescent. Ouvrez l’ouverture et assurez-vous qu’un point fluorescent peut être vu à travers l’objectif.

À l’aide du micromanipulateur, déplacez la pipette dans une position qui aligne la pointe avec le point fluorescent et abaissez la pipette dans une position juste au-dessus de la hauteur de la boîte de culture cellulaire. Une fois qu’il est en place, allumez la lumière transmise et éteignez la fluorescence. À l’aide d’une pince à épiler, transférez une lamelle avec les cellules tournées vers la pipette de la plaque de culture cellulaire à la boîte de culture cellulaire contenant 2 millilitres de tampon de Hank à température ambiante.

À l’aide du bouton de mise au point fine et de l’objectif 20 fois, faites la mise au point sur un plan à environ quatre tours complets au-dessus des cellules. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, positionnez la pointe de la pipette de manière à ce qu’elle soit focalisée et au centre gauche du plan, comme on le voit à travers les oculaires. Une fois la pipette en place, focalisez le microscope sur un plan qui contient la région d’intérêt.

Dans l’imagerie de sept neurones hippocampiques de souris transfectés par GFP, ils ont montré un avant-bras et un post-gonflement de l’axone, ainsi qu’une période de récupération de 10 minutes. Voici le Kymographe de l’imagerie en accéléré du même neurone. Les flèches rouges indiquent les varicosités qui se sont formées après 150 secondes de bouffée de 190 millilitres de H2O, à partir de 30 secondes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’enregistrement de cellules entières, l’imagerie FRET et TIRF en accéléré, et l’imagerie calcique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les impacts du stress mécanique sur la signalisation neuronale et électrique et calcique, le trafic et les interactions protéiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des lésions cérébrales phototraumatiques pour expliquer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la formation de varicosités axonales dans les neurones vivants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser les expériences pour étudier les mécanosensations des neurones centraux.