Base de détection ultrasensible des biomarqueurs à l’aide d’une empreinte moléculaire biocapteur capacitif

L’objectif global de cette technique est de détecter et de quantifier des biomolécules peu abondantes dans des échantillons très complexes avec une sensibilité élevée, une simplicité, un faible coût, une vitesse et sans l’utilisation d’un quelconque marquage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biotechnologie, de la biochimie et de la biomédecine, tels que la surveillance environnementale, la sécurité alimentaire, la qualité de l’eau potable et le diagnostic médical. Les principaux avantages de cette technique sont sa rapidité inhérente, sa simplicité, sa sensibilité élevée, son faible coût, sa facilité de manipulation et sa détection en temps réel sans utiliser de réactifs de marquage.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des maladies en raison de sa capacité à quantifier des biomolécules peu abondantes. Par exemple, différents biomarqueurs en temps réel. Pour nettoyer les lamelles en verre, plongez-les dans 10 millilitres de HCl 1,0 molaire pendant 10 minutes dans un nettoyeur à ultrasons à température ambiante.

Ensuite, plongez-les dans de l’eau déminéralisée et de l’hydroxyde de sodium de 1,0 molaire dans les mêmes conditions. Séchez les lamelles en verre avec de l’azote gazeux. Ensuite, plongez les lamelles propres et séchées dans 10 millilitres d’une solution APTES pendant une heure pour introduire des groupes aminés sur la surface du couvre-objet à température ambiante.

Rincez les lamelles à l’eau déminéralisée avant de les sécher à nouveau avec de l’azote gazeux. Immergez les lamelles modifiées par l’APTES dans une solution de 10 millilitres de glutaraldéhyde pendant deux heures pour activer les groupes aminés à la surface à température ambiante. Après l’incubation, rincez les lamelles avec un tampon de phosphate de 10 millimolaires pour éliminer l’excès de glutaraldéhyde de la surface.

Séchez les lamelles avec de l’azote gazeux. Ensuite, préparez 1,0 millilitre de solution matricielle dans un tampon de phosphate de 10 millimolaires à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre. Déposez 200 microlitres de cette solution de gabarit sur les lamelles modifiées et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Pour nettoyer les électrodes, plongez d’abord les électrodes dans un petit bécher contenant cinq millilitres d’éthanol à 70 % pendant 10 minutes dans un nettoyeur à ultrasons à température ambiante. Ensuite, immergez séquentiellement les électrodes dans de l’eau désionisée, de l’acétone, de l’eau déminéralisée, une solution acide de piranha et de l’eau désionisée dans les mêmes conditions. Séchez les électrodes avec de l’azote gazeux.

Pour effectuer l’électropolymérisation de la tyramine, préparez huit millilitres de solution de tyramine de 10 millimolaires dans un tampon de phosphate de 10 millimolaires contenant deux millilitres d’éthanol. Effectuez 15 cycles de balayages voltampérométriques cycliques dans cette solution à l’aide d’un potentiostat couvrant une plage de potentiel de zéro à 1,5 volts et une vitesse de balayage de 50 millivolts par seconde. Ensuite, rincez les électrodes à l’eau désionisée avant de les sécher à l’azote gazeux.

Immergez les électrodes dans une solution contenant 30 millimolaires de chlorure d’acryloyle et 30 millimolaires de triméthylamine dans du toluène à température ambiante pendant une nuit avant de rincer et de sécher à nouveau les électrodes. Avant la polymérisation, préparez une solution de monimère contenant des monomères et un agent de réticulation dans 820 microlitres d’eau ultra-pure. Ensuite, préparez 5 % volume à volume TEMED dans de l’eau ultra-pure.

Ajoutez 20 microlitres de la solution TEMED dans la solution monomère et purgez avec de l’azote gazeux pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’APS fraîchement préparé dans la solution monomère. Pipeter 1,5 microlitre de la solution monomère sur la surface de l’électrode en or modifiée.

Maintenant, commencez la polymérisation en mettant le tampon de gabarit en contact avec la surface traitée au monomère et laissez-le pendant cinq heures à température ambiante. Après la polymérisation, retirez le tampon de gabarit de la surface avec précaution, à l’aide d’une pince. Ensuite, rincez l’électrode à l’eau déminéralisée et séchez-la avec de l’azote gazeux.

Plongez les électrodes dans un millilitre de dix millimètres d’un dodécanéthéol préparé dans de l’éthanol pendant vingt minutes afin de couvrir les trous d’épingle à la surface de l’électrode. Enfin, rincez les électrodes à l’eau désionisée et séchez les électrodes à l’azote gazeux avant de caractériser leurs surfaces par microscopie électronique à balayage. Insérez les électrodes capacitives en or imprimées dans la cellule d’écoulement électrochimique intégrée à un biocapteur capacitif.

Préparez 100 millilitres de tampon de régénération et un litre de tampon de fonctionnement. Démarrez l’analyse par l’injection du tampon de régénération pour régénérer le système et du tampon en cours d’exécution pour rééquilibrer le système pendant 25 minutes. Préparez des solutions de gabarit standard dans la plage de concentration souhaitée dans la mémoire tampon en cours.

Ensuite, injectez 250 microlitres de ces solutions standard de manière séquentielle dans le système dans des conditions optimales. La caractérisation de surface des électrodes d’or est réalisée par microscopie électronique à balayage. La surface nue en or est montrée.

Sont également illustrés des bactériophages adhérents à la surface de l’électrode dans différents grossissements. On voit ici la liaison en temps réel d’un bactériophage à l’électrode d’or imprimée à l’aide d’un sensogramme. Une ligne de base stable est établie après la régénération et le rééquilibrage du système avant l’injection de l’échantillon.

Il y a des cavités spécifiques aux phages sur l’électrode. L’injection des bactériophages induisant l’échantillon entraîne une capacité réduite, en raison de la liaison des bactériophages cibles aux cavités imprimées à la surface des électrodes d’or. Les courbes d’étalonnage montrent la variation de la capacité en fonction de l’injection de protéines dans l’injection de bactériophages.

À partir des équations de ces graphiques, il est possible de calculer la concentration de bactériophages ou de protéines dans un échantillon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer un système de détection ultra-sensible, rapide et en temps réel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures et trente minutes, à l’exclusion des temps d’attente entre les deux.

Lors de cette procédure, il est important de préparer tous les agents frais, le même jour. À la suite de cette procédure, d’autres mesures telles que la microscopie à force atomique, la microscopie électronique à balayage, l’ellipsomètre et les mesures d’angle quantique peuvent être effectuées pour déterminer si la polymérisation ou l’empreinte a réussi, et pour détecter toute différence significative entre les surfaces des électrodes en or nues et imprimées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biochimie, de la biotechnologie et de la biomédecine pour explorer une détection ultra-sensible d’une biomolécule dans la sécurité alimentaire et le diagnostic médical.

N’oubliez pas que travailler avec des monomères fonctionnels, des réticulants, des initiateurs et d’autres agents peut être extrêmement dangereux. De plus, des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et la réalisation des expériences de polymérisation à l’intérieur de la hotte doivent toujours être prises lors de la réalisation de ces expériences.