Transplantation de la feuille les cellules souches dérivées du tissu adipeux pour réduire les fuites après colectomie partielle dans un modèle de Rat

Parce qu’ils supposent un effet positif sur la cicatrisation des tissus, les feuilles d’ASC ont été testées dans de nombreux modèles de maladies, tels que l’infarctus du myocarde. Cette expérience montre que les feuilles d’ASC peuvent être utilisées par voie intra-abdominale et appliquées sur l’intestin. Le principal avantage des feuilles ASC est qu’aucun matériau synthétique n’est nécessaire.

De plus, la transplantation de feuilles ASC est relativement facile à réaliser, avec seulement une petite quantité de pratique. Cette nouvelle application de la transplantation en feuille d’ASC a été développée pour prévenir les fuites après la résection intestinale, et offre une première étape à laquelle une nouvelle stratégie thérapeutique s’ajoute. Les feuilles ASC appliquées à l’anastomose intestinale se sont révélées prometteuses pour prévenir les fuites.

Les feuilles ASC peuvent également être appliquées sur d’autres organes intra-abdominaux, tels que les voies urinaires. Commencez par disséquer le tissu adipeux abdominal sous-cutané humain en morceaux de 0,5 cm, à l’aide d’une lame chirurgicale stérile de taille 10, d’une pince à tissu Adson-Brown et de ciseaux Metzenbaum. Pesez la quantité totale de tissu disséqué dans une bouteille en verre stérile.

Ajouter 30 ml de milieu d’isolement par flacon. Et digérez le tissu adipeux disséqué dans un incubateur à secoueur à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, divisez la solution de tissu digéré dans des tubes de 50 ml et centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 390 G. Après la centrifugation, retirez le surnageant.

Ajouter un milieu pour remettre en suspension les granules cellulaires et ajouter d’autres milieux de culture, jusqu’à 45 ml. Centrifuger les cellules combinées pendant cinq minutes à 390 g et retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 10 ml de milieu de culture.

Et filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 100 microns. Ajouter 50 l de solution de bleu de méthylène d’acide à 3 %, à 50 l de suspension cellulaire, pour les poux des globules rouges. Après avoir mélangé la solution, pipetez 10 l sur un hémocytomètre et comptez les cellules.

Plaquez les cellules à une densité de 40000 cellules par cm carré, dans une fiole T175 contenant du milieu de culture. Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pendant 24 heures. Le lendemain, lavez les cellules avec une solution saline chaude tamponnée au phosphate pour éliminer les débris cellulaires.

Ensuite, remplacez le milieu par un milieu de culture FBS à 10 %, ainsi que de l’acide ascorbique-2-phosphate fraîchement ajouté et du facteur de croissance des fibroblastes recombinants humains deux. Incuber jusqu’à ce que les cellules atteignent 90 % de confluence. Sous-cultivez les cellules souches adipeuses à 90 % de confluence, en utilisant une solution standard de trypsine-EDTA à 0,25 %.

Après trois à cinq minutes, neutraliser la solution de trypsine-EDTA à 0,25 % avec 10 ml de milieu de culture. Transférez dans un tube à centrifuger et centrifugez les cellules pendant huit minutes à 250 G.Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 ml de milieu de culture. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, plaquez les cellules dans des flacons de culture T175, à une densité de 8000 cellules par cm carré.

Congelez les ASC restants dans de l’azote liquide, avec 10 % de diméthylsulfoxyde dans le milieu de culture avant de les utiliser ultérieurement. Pré-enrober des boîtes de culture thermoréactives de 3,5 cm de diamètre, avec 1 ml de sérum fœtal bovin. Placez ensuite les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius, pendant au moins 30 minutes avant l’ensemencement.

Pour favoriser l’adhésion de l’ASC à la boîte thermosensible et réduire le risque de détachement prématuré de la feuille d’ASC en culture, la boîte thermosensible doit être pré-enrobée de sérum fœtal bovin avant l’ensemencement cellulaire. Trypsinisez les ASC comme précédemment, s’il y a des amas de cellules après la trypsinisation, filtrez les cellules à travers un filtre de 100 microns avant de compter. Retirez la vaisselle de l’incubateur et transférez-la dans une plaque chauffante à 37 degrés Celsius.

Retirez le FBS du plat. Après avoir remis en suspension la pastille cellulaire dans du LG DMEM, avec 10 % FBS, et compté les cellules, diluer 3,52 fois 10 à la 6ème ASC dans 2 ml de milieu de culture par plat, pour ensemencer 400000 cellules par cm carré dans chaque boîte de 3,5 cm. Répartissez soigneusement les cellules aussi uniformément que possible, en balançant doucement le plat.

Ensuite, cultivez des feuilles d’ASC pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2. Le jour de la transplantation, laisser refroidir les boîtes de culture à température ambiante 40 minutes avant la transplantation in vivo pour faciliter le détachement de la feuille d’ASC. Une fois refroidi, retirez le milieu de culture et remplacez-le par 1 ml de LG DMEM sans sérum.

Pour transplanter la feuille cellulaire, saisissez doucement le bord de la feuille ASC avec une pince atraumatique et placez le côté de la boîte de la feuille ASC sur la ligne anastomotique. Une manipulation en douceur des feuilles et un placement correct des feuilles sont essentiels pour garantir une transplantation réussie de feuilles intactes. Étirez soigneusement la feuille ASC à environ 0,25 cm au-dessus et en dessous de la ligne anastomotique.

Enroulez la feuille autour du côlon, en soulevant le côlon, pour enrouler la feuille ASC autour de la face dorsale. Les animaux témoins, qui n’ont pas reçu de feuilles d’ASC transplantées, présentent des fuites fécales près de la ligne anastomotique, indiquée par la flèche blanche au troisième jour postopératoire. Les animaux avec des feuilles ASC transplantées, indiquées par la flèche noire, ont montré une réduction des fuites fécales et de la formation d’abcès au troisième jour postopératoire.

Le même résultat a été observé sept jours après l’opération. Cette image montre une coupe transversale représentative du site d’anastomose colorectale chez un animal transplanté coloré avec H et E.La structure en feuillet a pu être identifiée au site d’anastomose, jusqu’à sept jours après l’opération. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est bien exécutée.

feuille ASC adhère spontanément à la surface cellulaire zéro du côlon, il n’est pas nécessaire d’utiliser de la colle ou une suture pour ajuster la feuille ASC. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de transplanter des feuilles ASC sur l’anastomose colorectale chez le rat, afin de prévenir les fuites après une colectomie partielle.