Name: Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez l'endomicroscopie confocale à balayage laser couplée à des fibres in vivo pour imager la dynamique microvasculaire dans l'hippocampe de souris éveillées. Cette technique permet d'étudier les anomalies vasculaires fonctionnelles en neurosciences.

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Le projet a été financé par un prix de l’initiative de recherche de l’American Epilepsy Society et un prix de la Commission de recherche biomédicale de l’Arizona à S.L.M., ainsi qu’une subvention de défi de Research to Prevent Blindness Inc. au département d’ophtalmologie de l’Université des sciences de la santé de l’État de New York, le programme d’innovation Empire de l’État de New York. et d’autres subventions de la National Science Foundation (0726113, 0852636 et 1523614), de la Barrow Neurological Foundation, de Mme Marian Rochelle, de Mme Grace Welton et des prix SEED de Dignity Health, et de subventions fédérales de la National Science Foundation (0726113, 0852636 et 1523614) et de l’Institut national de la santé (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), à S.L.M et S.M.C. <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Ce travail a également été soutenu par le Bureau du secrétaire adjoint à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du prix No. W81XWH-15-1-0138, à S.L.M.<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: red; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">L.-C. a bénéficié d’une bourse José Castillejo du ministère espagnol de l’Éducation. Nous remercions O. Caballero et M. Ledo pour leurs conseils techniques et leur assistance.

Le protocole suit les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut neurologique Barrow.
1. Positionnement stéréotaxique pour la craniotomie
<ol><li>Peser puis anesthésier la souris avec un cocktail de kétamine-xylazine (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en observant son absence de réaction au pincement de la queue et/ou des orteils.</li>
	<li>Placez un coussin chauffant sous la souris et utilisez un thermomètre rectal pour surveiller en permanence sa température corporelle pendant la chirurgie d’implantation anesthésiée initiale (Figure 2A).</li>
	<li>Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire.</li>
	<li>Stabilisez la tête de l’animal dans un cadre stéréotaxique pour rongeurs, équipé d’un adaptateur de souris. Pour orienter correctement la souris dans le cadre stéréotaxique, placez les dents de l’animal à l’intérieur du trou de la barre de morsure (Figure 2A et Figure 3A, élément g). Serrez le serre-nez jusqu’à ce qu’il soit bien ajusté (Figure 2A, B et Figure 3A, point h). Le positionnement du corps de la souris doit être aussi droit que possible (comme dans la figure 2A).<ol><li>Fixez davantage la tête de l’animal à l’aide de barres auriculaires de souris munies de brassards de maintien de la mâchoire (figure 2A et figure 3A, point i), afin de serrer fermement les apophyses zygomatiques du crâne. REMARQUE : Une fois fixée, la tête de la souris ne doit pas avoir d’amplitude de mouvement horizontal.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois que la souris est ajustée au cadre stéréotaxique (Figure 3B, point j), nettoyez et stérilisez le cuir chevelu en l’essuyant avec un gommage au chlore-hexédine 2 à 3 fois, suivi à chaque fois d’un rinçage à l’alcool. Ensuite, appliquez de la lidocaïne topique sur le dessus de la tête.</li>
	<li>Faites une incision le long de la ligne médiane de l’arrière vers l’avant (commencez l’incision à la base du crâne et complétez-la entre les yeux ; 12-15 mm) le long de la ligne médiane sagittale du crâne, à l’aide de ciseaux fins ou d’une lame. Rétractez les bords du cuir chevelu à l’aide de quatre pinces serrefine bouledogue de 28 mm pour exposer le crâne et maximiser la zone de travail (Figure 2B et Figure 3C).</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel ou d’une microspatule (figure 3C), grattez le périoste jusqu’aux bords de l’incision. Utilisez des ciseaux ou une pince pour séparer les tissus (figure 3C) pour rétracter soigneusement les muscles à l’arrière du cou (figure 2B).</li>
	<li>Séchez le sommet du crâne à l’aide d’un applicateur à embout en coton, humidifié avec de l’alcool ou du peroxyde d’hydrogène à 30 %, afin d’optimiser la visualisation des sutures crâniennes. Appliquez une solution saline sur le crâne une fois que le tissu conjonctif a été retiré.</li>
	<li>Une fois que la tête de la souris est stabilisée dans l’appareil stéréotaxique, placez une pointe d’aiguille de seringue (21 G) dans le porte-électrode (Figure 3B, article l) et fixez le porte-électrode au micromanipulateur stéréotaxique, en abaissant la pointe de l’aiguille au niveau du crâne (Figure 2D).</li>
	<li>Ajustez la direction médiale-latérale du crâne en mesurant la hauteur du crâne à n’importe quelle distance postérieure au bregma (c.-à-d. -2,0 mm) et à deux distances égales latérales de la ligne médiane de chaque côté du crâne (c.-à-d. ± 1,5 mm) (Figure 2D). Visez une différence de hauteur entre les emplacements inférieure à 0,05 mm dans la direction dorsale-ventrale.<ol><li>S’il est supérieur à 0,05 mm, faites pivoter le crâne de la souris à l’aide de la barre de morsure, ou repositionnez la tête de la souris en desserrant soigneusement les barres auriculaires, en déplaçant latéralement la tête et les barres auriculaires au besoin, puis en resserrant les barres auriculaires.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois que le crâne est positionné dans le dispositif stéréotaxique, déterminez et enregistrez les coordonnées stéréotaxiques des sutures crâniennes bregma et lambda le long des axes antéropostérieur (AP), latéral médial (ML) et dorsal ventral (DV).</li>
	<li>Identifiez le point cible (hippocampe droit) à l’aide d’un atlas stéréotaxique. Ensuite, trouvez sur le crâne les coordonnées du point cible par rapport au bregma (AP : -2,7 mm, ML : -2,7 mm) (Figure 2E).</li>
	<li>À l’aide d’un marqueur chirurgical, marquez les quatre coins d’une fenêtre d’imagerie de 1,4 mm x 2 mm sur le crâne avec des points, centrés autour du point cible directement au-dessus de l’hippocampe (Figure 2F), pour une craniotomie ultérieure.</li>
	<li>À l’aide du marqueur chirurgical, tracez deux points supplémentaires : l’un sur l’os pariétal supérieur gauche (figure 2G) et l’autre sur l’os frontal droit (figure 2H), pour indiquer l’emplacement futur de deux vis à os (figure 3A, élément b) qui ancreront la tête (figure 3B, élément m) au crâne.</li>
	<li>À l’aide du marqueur chirurgical, tracez trois autres points indiquant l’endroit où les électrodes d’enregistrement de l’EEG péridural seront insérées : un point positionné à 1 mm de chaque côté de la ligne médiane et un point supplémentaire sur la ligne médiane positionné à 1 mm derrière Lambda (Figure 2E, Figure 4A et Figure 5B).</li>
</ol>2. Installation du capuchon de tête
<ol><li>À l’aide d’une fraise de 0,7 mm de diamètre (figure 3C), percez soigneusement deux petits trous dans le crâne, à la position des points indiquant l’emplacement des vis à os (voir l’étape 1.15 ci-dessus). Ensuite, prenez deux vis en os (fendues en acier inoxydable, longueur : 4 mm ; diamètre : 0,85 mm) préalablement désinfectées à l’éthanol à 70-80 % et vissez-les sur le crâne pour une stabilité supplémentaire de la tête (Figure 2I-J et Figure 3A, point b).<ol><li>Assurez-vous que les pointes des vis ne dépassent pas du bas de l’os dans la cavité crânienne, ce qui risquerait d’endommager le cerveau. Notez que l’une des deux vis à os sera antérieure aux deux vis tête-capuchon et l’autre postérieure à celles-ci (Figure 2G-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Vaporisez du sérum physiologique sur le crâne pour le refroidir et le nettoyer. Ensuite, séchez complètement le crâne et appliquez une fine couche de cyanoacrylate autour des vis.</li>
	<li>Utiliser une pièce d’alignement personnalisée (figure 3A, article c) fixée au microentraînement monté sur le dispositif stéréotaxique (figure 2F-J et figure 3A, élément d), de manière à ce que la position de l’embout de tête soit alignée le long de la ligne médiane, avec la crête antérieure recouvrant le bregma. Cette pièce en acier inoxydable sur mesure est en forme de L (inclinée à 90°), avec deux trous séparés de 4 mm (figure 2F-J et figure 3A, article c).<ol><li>Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la pièce d’alignement en forme de L, avec deux vis d’entraînement à fente à tête cylindrique fixées (M1,6 x 0,35 métrique grossière, longueur de 12 mm ; Figure 3A, point a) au-dessus du bregma, jusqu’à ce que la base des vis repose à plat sur le crâne, en prenant soin de ne pas exercer de pression sur le crâne (Figure 2I-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Appliquez du cyanoacrylate suivi d’un ciment dentaire pour fixer la base des vis au crâne. Veillez à ne pas obstruer les repères de référence de la fenêtre d’imagerie au-dessus de l’hippocampe (Figure 2K).</li>
</ol>3. Chirurgie de craniotomie de fenêtre d’imagerie
<ol><li>À chacune des positions des repères de craniotomie qui indiquent les coins de la fenêtre d’imagerie (voir l’étape 1.14 ci-dessus), percez un trou de bavure de 0,7 mm de diamètre, puis délimitez doucement la périphérie de la fenêtre de craniotomie de 1,4 mm x 2 mm avec la perceuse, avec des coupes itératives plus profondes (Figure 2L).</li>
	<li>Veillez à ne pas percer trop profondément ou avec trop de force sur le crâne, qui est mince et fragile, ayant une épaisseur d’environ 300 μm. Une fois que le lambeau osseux est terminé, soulevez le lambeau lâche avec la pointe d’un scalpel, en veillant à ne pas endommager la dure-mère sous-jacente.</li>
	<li>Recouvrez la fenêtre ouverte avec de la cire d’os (figure 2M).</li>
	<li>À l’aide d’une fraise de 0,9 mm de diamètre, percez trois trous pour la mise en place future des électrodes EEG péridurales (voir l’étape 1.15 ci-dessus) en prenant soin de ne pas couper la dure-mère (Figure 2E,L).</li>
	<li>Couvrez les trois trous avec de la cire d’os.</li>
	<li>Appliquez délicatement du cyanoacrylate sur les bords de la fenêtre d’imagerie recouverte de cire d’os et des trous EEG, en prenant soin de ne pas sceller les craniotomies (Figure 2L).</li>
	<li>Construisez un mur de ciment dentaire qui englobe la fenêtre d’imagerie et les trous EEG et le lie à l’embout de tête préalablement cimenté (Figure 2M et Figure 3B, élément m).</li>
	<li>Laissez sécher le ciment pendant au moins 10 minutes.</li>
	<li>Fermez les bords lâches de la plaie avec de simples sutures interrompues, en utilisant de la soie tressée noire 4-0 ou 5-0 (Figure 2N et Figure 3C).</li>
</ol>4. Post-chirurgie
<ol><li>Utilisez un applicateur à embout de coton pour appliquer une pommade à la lidocaïne autour de la peau exposée afin d’atténuer la sensation autour du bord de la plaie.</li>
	<li>Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour appliquer Neosporin sur la peau exposée.</li>
	<li>Retirez l’animal du cadre stéréotaxique (Figure 2N).</li>
	<li>Injecter du kétoprofène (5 mg/kg) IP ou IM pour l’analgésie post-chirurgicale.</li>
	<li>Observez l’animal jusqu’à ce qu’il soit alerte et en mouvement (cela se produit généralement en quelques minutes).</li>
	<li>Placez l’animal dans une cage chaude et continuez à surveiller son rétablissement jusqu’à ce qu’il boive ou mange et qu’il soit prêt à être transféré dans un logement pour animaux.</li>
	<li>Surveillez l’animal au moins une fois par jour pendant environ une semaine après l’opération, en surveillant tout signe de comportement apathique et/ou de nourriture/boisson inadéquate (Figure 2O).</li>
</ol>5. Injection de colorant et enregistrement EEG
<ol><li>Attendez au moins un jour après la chirurgie d’implantation du capuchon de tête pour commencer les enregistrements.</li>
	<li>Placez la souris dans un dispositif de retenue en mousse moulé à son corps, à l’intérieur du cadre stéréotaxique (figure 3B, éléments n et j).</li>
	<li>Fixez le capuchon de tête (Figure 3 B-I, article m) à une barre de montage personnalisée qui est fixée au cadre stéréotaxique (Figure 3A, B, éléments e et j et Figure 4A). La section longue de l’article e (figure 3A,B) doit avoir une longueur comprise entre 9,4 et 13 mm. Fixez l’élément f (une plaque de montage de dimensions 1,5 cm x 0,5 cm, avec deux trous séparés de 4 mm d’un centre à l’autre) à l’élément e (Figure 3A, B, éléments e, f et k). Ce système d’alignement positionnera la souris éveillée en toute sécurité sur le cadre stéréotaxique tout au long des séances d’imagerie (Figure 4).</li>
	<li>Insérez les électrodes d’enregistrement EEG péridurale (Figure 5A), en plaçant les électrodes de masse (fils blancs) dans le trou central postérieur et les électrodes d’enregistrement (fils rouges) dans les trous antérieurs gauche et droit (Figure 2E, Figure 4E et Figure 5E). Positionnez chacun des fils en forme de L entre le crâne et la dure-mère (figure 5C) pour optimiser le contact électrique.</li>
	<li>Injecter dans la veine caudale du dextran fixable à la lysine à la fluorescéine verte (0,2 mL/25 g en poids corporel de fluorescéine à 5 % p/p), pour visualiser le flux sanguin dans l’hippocampe.<ol><li>Pour améliorer la dilatation de la veine centrale de la queue de la souris avant l’injection, utilisez une ou plusieurs des stratégies suivantes : a) Appliquer de l’éthanol à 70 % sur la veine centrale à l’aide d’un applicateur à embout en coton ; b) Trempez la queue dans de l’eau tiède (35-40 °C) pendant 1 à 3 minutes ; c) Exposez la queue à une lampe chauffante pendant quelques minutes.</li>
		<li>Fixez la queue de la souris avec deux doigts et localisez la veine centrale, qui se trouve immédiatement sous la peau. Insérez l’aiguille (seringue à insuline ultrafine avec aiguille intégrée 30G), avec le biseau vers le haut, dans la veine, à environ mi-chemin ou aux deux tiers de la base de la queue. Gardez l’aiguille parallèle à la queue pendant l’injection.</li>
		<li>Injectez le colorant lentement et régulièrement, en prenant soin d’éviter tout changement de position de l’aiguille ou de la queue. REMARQUE : Il ne doit y avoir aucune résistance lorsque vous appuyez sur le piston de la seringue.</li>
		<li>Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille et appliquez une légère pression sur le site de ponction pour sceller le vaisseau.</li>
		<li>Permettre à la coagulation de se produire.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Endomicroscopie confocale confocale à balayage laser (pCLE) confocale in vivo couplée à des faisceaux de fibres optiques
<ol><li>Directement après l’injection de la veine caudale (étape 5.5.3 ci-dessus), serrez le faisceau de fibres optiques biseautées de 300 μm (contenant 5000 à 7000 fibres de 3 μm dans chaque faisceau) dans l’orientation vers le bas du bras mobile du variateur stéréotaxique robotisé.</li>
	<li>Retirez la cire osseuse de la craniotomie.</li>
	<li>Retirez la dure-mère à l’aide de l’extrémité pliée d’une aiguille de seringue.</li>
	<li>À l’aide du système de positionnement robotisé, déplacez d’abord l’objectif de la fibre à l’emplacement stéréotaxique antéro-postérieur et gauche-droite approprié, avec la pointe mise à zéro sur l’axe z à la surface du cortex.</li>
	<li>Lancez l’enregistrement EEG (Figure 5D).</li>
	<li>Lancez un balayage laser confocal du fond de l’objectif à fibre, suivi directement en descendant lentement l’objectif sur l’axe z à l’aide des commandes z du micromoteur robotique, jusqu’à ce qu’il atteigne la profondeur cible dans le cerveau (Figure 4C). Visualisez les résultats d’imagerie dans le logiciel microscopique pendant la descente.<ol><li>Si l’extrémité de la fibre se trouve dans la région d’enregistrement cible X-Y-Z et que deux vaisseaux ou plus pénètrent dans le champ de vision de la fenêtre d’imagerie, arrêtez la descente et lancez les enregistrements vidéo. Obtenez des vidéos en accéléré plein champ en direct du flux sanguin à 11,7 Hz à l’aide du logiciel d’imagerie de Cellvizio Lab. (Des vitesses plus élevées peuvent être obtenues avec un champ de vision plus petit). Les enregistrements peuvent avoir lieu pendant 4 à 5 heures d’affilée, en jours consécutifs si nécessaire.</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’un tube en silicone biseauté fixé à l’extrémité de l’aiguille, nourrir l’animal pendant les enregistrements en lui fournissant périodiquement de la pâte faite de pastilles de souris broyées avec de l’eau.</li>
	<li>À la fin de la session d’imagerie, mettez fin aux enregistrements.</li>
	<li>Retirez délicatement les sondes EEG et nettoyez-les avec Tergazyme.</li>
	<li>Retirez lentement le faisceau de fibres optiques du cerveau de l’animal en inversant la fibre le long de l’axe z d’entrée.</li>
	<li>Libérez l’animal du poteau de tête et des dispositifs de retenue.</li>
	<li>S’il y a lieu, suivez les protocoles d’euthanasie et de traitement tissulaire nécessaires pour visualiser les vaisseaux sanguins et effectuer l’immunohistochimie.</li>
	<li>Si vous prévoyez d’enregistrer à partir du même animal lors d’une session ultérieure, couvrez la fenêtre d’imagerie avec de la cire d’os ou du silastic.</li>
</ol>

<ol><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
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<li>Smart, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+K%28V%291.1+potassium+channel+causes+epilepsy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice.</a> Neuron. 20, 809-819 (1998).</li>
<li>Zuberi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+human+voltage-gated+potassium+channel+gene+%28Kv1.1%29+associates+with+episodic+ataxia+type+1+and+sometimes+with+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy.</a> Brain. 122, 817-825 (1999).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Nous avons mis au point un système de retenue de la tête pour des expériences simultanées de pCLE électrophysiologique et à fibre optique chez des souris éveillées, réduisant ainsi la contamination potentielle de la réponse due aux médicaments anesthésiques. Le capuchon de tête et l’appareil de montage sont simples à construire et sont réutilisables pour les expériences d’imagerie chronique au comportement éveillé. Nous avons vérifié la qualité des enregistrements par rapport à l’étalon-or de l’imagerie microscopique du ...

Contrairement à d’autres méthodes d’imagerie microscopique 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopie confocale in vivo à base de fibres optiques permet de mesurer la dynamique du flux sanguin dans n’importe quelle région du cerveau, à n’importe quelle profondeur, à grande vitesse (jusqu’à 240 Hz selon la taille du champ de vision9). Une sonde à fibre optique permet l’imagerie confocale à balayage laser in vivo à une résolution de 3 μm, car la pointe de la sonde (un objectif sans lentille composé d’un faisceau de 5000 à 6000 fibres individuelles de 3 μm de diamètre) peut être positionnée avec la précision d’une microélectrode, à moins de 15 μm de la cible fluorescente d’intérêt. Comme pour l’imagerie in vivo à deux photons, les fluorophores doivent être préalablement introduits dans la cible d’imagerie. Par exemple, du dextran de fluorescéine (ou des points quantiques) peut être injecté dans le système vasculaire, ou des protéines fluorescentes génétiquement codées peuvent être transfectées dans les cellules, ou des colorants fluorescents tels que le vert d’Oregon BAPTA-1 peuvent être chargés en vrac dans les cellules, avant l’imagerie.
Des recherches récentes utilisant ces techniques ont montré que l’activité motrice des cellules murales conduisant à des vasospasmes capillaires ictaux – des constrictions soudaines qui se produisent à la position des cellules murales pendant les crises 9 – peut contribuer à la neurodégénérescence de l’hippocampe ictal9. Alors que des études d’imagerie antérieures ont montré des constrictions péricytaires in vitro et in vivo liées à des applications médicamenteuses 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. ont trouvé la première preuve de constrictions capillaires spontanées in vivo dans le cerveau murin. Pour établir la pertinence de l’épilepsie du lobe temporal humain, ils ont étudié des souris mâles (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), un modèle génétique de l’ataxie épisodique humaine de type 115. Les péricytes ont entraîné des vasoconstrictions murales de l’hippocampe pathologiques et physiologiques9 chez les animaux spontanément épileptiques et leurs compagnons de portée de type sauvage (WT). Ces observations ont été reproduites chez des animaux WT rendus épileptiques avec de l’acide kaïnique, indiquant ainsi leur généralisation à d’autres formes d’épilepsie. Leal-Campanario et al. ont en outre déterminé, à l’aide de nouvelles approches de microscopie stéréologique, que les neurones apoptotiques – mais pas sains – chez les animaux épileptiques étaient spatialement couplés à la microvascularisation de l’hippocampe. Étant donné que l’excitotoxicité n’a pas d’association spatiale connue avec le système vasculaire, ce résultat indique que l’hypoxie anormale induite par l’ischémie vasospasmique capillaire anormale contribue à la neurodégénérescence dans l’épilepsie. La figure 1 montre un schéma de la configuration générale.

<table><tbody><tr><td>Meule de 0,7 mm de diamètre</td><td>Outils de science fine</td><td>19007-07</td><td>Pour vis n° 19010-00</td></tr><tr><td>Meule de 0,9 mm de diamètre</td><td>Outils de science fine</td><td>19007-09</td><td></td></tr><tr><td>ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS</td><td>de Solution de pièce à main</td><td>AEU12C</td><td></td></tr><tr><td>Bouledogue serrifine agglomérée</td> Outils <td>de science fine</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>CellVizio double bande</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellVizio monobande</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsonde confocale 300 microns (Série S)</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pièce d’alignement sur mesure</td><td>en forme de L (inclinée à 90 degrés) et en acier inoxydable avec deux trous percés dessus, avec une séparation de 4 mm d’un centre à l’autre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barre</td> <td>de montage sur mesureLa section longue de la barre de montage doit être comprise entre 9,4 et 13 mm. Fixé à cette pièce de la barre de montage, positionnez une plaque en acier inoxydable de 1,5 cm de long et 0,5 cm de large qui comporte deux trous percés séparés de 4 mm de centre à centre, à la même distance que la pièce d’alignement en forme de L.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhésif cyanoacrylate-Super Glue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>DuraLay Inlay Résine &ndash ; Forfait standard</td><td>Reliance Dental Mfg Co.</td><td>602-7395 (de patterson dental)</td><td></td></tr><tr><td>Tête de remplissage, entraînement plat, M1.6x0.35 métrique grossier, 12mm de longueur sous la tête, vis mécanique</td><td>MSC industrial direct co.</td><td></td><td></td>2834117</tr><tr><td>Ciseaux à pointe fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine 5 % w/p lysine fixable dextran (2MD)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D7137</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille lisse Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de suture Kalt 3/8 incurvée</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>standard de laboratoire stéréotaxique, rat et souris</td><td>Stoelting Co. 51704</td><td>51670</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2 %</td><td>Omnivision GmbH</td><td>PZN : 04682367</td><td>Pommade oculaire pour prévenir la sécheresse.</td></tr><tr><td>Souris Contrôleur de température, sonde (YSI-451), petit coussin chauffant-TC-1000 Souris</td><td>CWE Inc.</td><td>08-13000</td><td></td></tr><tr><td>PhysioTel F20-EET émetteurs</td><td>DSI</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr><tr><td>Robot stéréotaxique, bras manipulateur, ADD-ON, 3 axes, GAUCHE</td><td>Stoelting Co.C13</td><td>51704</td><td></td></tr><tr><td>Sel-Tapping Vis à os</td><td>Outils de science fine</td><td>19010-10</td><td></td></tr><tr><td>Barres d’oreille standard et embouts en caoutchouc pour souris Stereotaxic</td><td>Stoelting Co</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Suture Fil - Soie tressée/Taille 4/0</td><td>Outils de science fine</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Microspatule de séparation de tissu</td><td>Outils de science fine</td><td>10091-121</td><td></td></tr></tbody></table>

endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pcle) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

L’objectif de ce protocole est de décrire l’endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des faisceaux de fibres optiques (pCLE) dans son application spécifique pour élucider les effets du flux sanguin capillaire pendant les crises, entraînés par les cellules murales. L’imagerie corticale in vitro et in vivo a montré que les constrictions capillaires induites par les péricytes peuvent résulter d’une activité neuronale locale fonctionnelle, ainsi que de l’application de médicaments, chez des animaux sains. Ici, un protocole est présenté sur la façon d’utiliser la pCLE pour déterminer le rôle de la dynamique microvasculaire dans la dégénérescence neurale dans l’épilepsie, à n’importe quelle profondeur tissulaire (en particulier dans l’hippocampe). Nous décrivons une technique d’appuie-tête qui a été adaptée pour enregistrer la pCLE chez les animaux éveillés, afin de traiter les effets secondaires potentiels des anesthésiques sur l’activité neuronale. Grâce à ces méthodes, des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie peuvent être effectués pendant plusieurs heures dans les structures neuronales profondes du cerveau.

Nous avons développé ces méthodes pour évaluer si des vasospasmes capillaires anormaux induits par le péricyte dans l’hippocampe – survenant à la suite de convulsions – pourraient provoquer une hypoxie franche qui contribue à la mort cellulaire dans le foyer ictal 9,13.
Le développement de la coiffe et son installation correcte ont permis une grande stabilité dans les enregistrements, permettant l’enregistrement simultané de l’EEG et d...

Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.

Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Ce protocole nous a permis d’utiliser l’endomicroscope confocal à fibre optique à balayage laser pour effectuer simultanément des enregistrements d’imagerie et d’électrophysiologie in vivo pendant plusieurs heures à partir de structures neuronales à n’importe quelle profondeur du cerveau chez l’animal éveillé ou relativement anesthésié. Nous avons mis au point une méthode de contention indolore qui permet d’obtenir une imagerie cérébrale profonde chez les animaux éveillés en utilisant des méthodes similaires à celles utilisées précédemment pour les enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode a été utilisée pour étudier les anomalies vasculaires fonctionnelles dans des modèles d’épilepsie et de dégénérescence maculaire liée à l’âge chez les rongeurs.C’est une technique viable pour évaluer la contribution de la pathologie du flux sanguin dans de nombreux organes, sinon la plupart des maladies. Bien que cette technique ait été développée pour une étude en temps réel de la dynamique du flux sanguin dans le cerveau, nous l’avons utilisée pour étudier le flux sanguin dans la rétine in vivo. Elle ne se limite pas aux études vasculaires dans le tissu neural.La démonstration de la

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Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Source : Maruoka, H., et. al.  Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp..  (2022) Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

Source : Ulivi, A. F., et. al. Imagerie longitudinale à deux photons de l’hippocampe dorsal CA1 chez des souris vivantes. J. Vis. exp. (2019) &lt;p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'&gt;Cette vidéo fait la démonstration de l’imagerie longitudinale à deux photons de neurones pyramidaux marqués par fluorescence chez une souris vivante, montrant la préparation, l’alignement des canules et l’imagerie des dendrites et des...

Imagerie longitudinale à deux photons de neurones marqués par fluorescence dans l’hippocampe d’une souris vivante 

Source : Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocamp. J. Vis. Exp. (2022)La vidéo montre la configuration et le processus d’imagerie pour la microscopie à deux photons in vivo de la dynamique microgliale dans l’hippocampe CA1 (Cornu ammonis 1) et le gyrus denté, assurant un alignement optique optimal et une évaluation de l’intégrité structurelle.

Imagerie in vivo à deux photons de la dynamique microgliale dans l’hippocampe de souris

Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l'hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l'imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l'activité sur une période de plusieurs semaines.

Imagerie longitudinale à deux photons de l'hippocampe dorsal CA1 chez les souris vivantes

L'imagerie optique transcrânienne permet l'imagerie à large champ du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cortex des souris vivantes à travers un crâne intact.

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo

Cet article démontre la préparation d’une fenêtre de formation image faite sur mesure complétée avec la canule d’infusion et son implantation sur la région CA1 du hippocampe chez les souris.

Procédure de craniotomie pour visualiser les activités neuronales dans l’hippocampe de souris se comportant

Nous présentons un protocole pour l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des liposomes dans l’œil après injection sous-conjonctivale.

Imagerie spatio-temporelle in vivo de systèmes d’administration de médicaments oculaires à l’aide d’une microendoscopie laser confocale à fibre optique

Cet article décrit une méthode d’observation chronique in vivo de la microglie au repos dans l’hippocampe de souris CA1 à l’aide d’une chirurgie contrôlée avec précision et d’une microscopie à deux photons.

In vivo Imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

À l’aide d’une approche entièrement optique, l’AVC ischémique est induit tout en enregistrant simultanément l’activité neuronale Ca2+ à l’aide d’un biocapteur fluorescent dans le noyau d’AVC émergent d’une souris éveillée et comportementale.

Photothrombose et photométrie à fibres simultanées pour induire et surveiller l’AVC ischémique chez des souris au comportement

Ce protocole fournit une description complète d’une méthode permettant l’enregistrement simultané des signaux calciques provenant des neurones et des astrocytes à travers plusieurs régions cérébrales liées à la mémoire et démontre son application dans un paradigme d’apprentissage et de comportement mémoire.

Une méthode de photométrie à fibres bicolores pour enregistrer l’activité astrocyte-neurone dans plusieurs régions cérébrales lors de l’apprentissage et des comportements de mémoire

Découvrez l'endomicroscopie confocale à balayage laser couplée à des fibres in vivo pour imager la dynamique microvasculaire dans l'hippocampe de souris éveillées. Cette technique permet d'étudier les anomalies vasculaires fonctionnelles en neurosciences.

Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées (Vidéo) | JoVE Journal

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Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

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