Name: Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez l'isolement des mastocytes péritonéaux murins et leur caractérisation fonctionnelle par imagerie calcique Fura-2 et dosage de dégranulation β-hexosaminidase. Ces méthodes simples permettent l'analyse simultanée de nombreuses cellules.

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Les auteurs aimerait Julia Geminn d’assistance technique dans la préparation de cellules de mât et de culture. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche Collaborative transrégional (TR-SFB) 152.

<ol><li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+mast+cells%3A+negative%2C+as+well+as+positive%2C+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li>
<li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li>
<li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li>
<li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7508174">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%22tunable%22+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+mast+cells%3A+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li>
<li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li>
<li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150(2014).</li>
<li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-specific+Cre%2FloxP-mediated+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li>
<li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+cell-derived+mast+cells%3A+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3838314">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li>
<li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li>
<li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H%281%29-antihistamines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li>
<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
<li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).</li>
<li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li>
<li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li>
<li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2531691">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li>
<li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators%3A+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Modèles de MC peuvent servir avec succès pour étudier la dégranulation de MC, chimiotactisme, adhérence, aussi bien quant à élucider les voies de transduction signalisation intracellulaire impliqués dans l’activation MC. Certains chercheurs utilisation humaine MCs modèles, tels que des lignées immortalisées (LAD2 et HMC1) ou MCs humaines dérivées de cordon de sang des cellules progénitrices (CD133 +) et les cellules souches du sang périphérique (CD34 +). D’autres préfèrent les rongeurs MC modèles, tels qu’immortalisés (l...

MCs jouent un rôle de premier plan au cours de la réponse immunitaire innée et acquise. Plus précisément, MCs participent à la mise à mort des agents pathogènes, tels que les bactéries et les parasites et aussi dégradent les peptides endogènes potentiellement toxiques ou des composants de venins (pour examen voir Galli et al. 20081). Le rôle physiologique de la PSC dans l’immunité innée et adaptative fait l’objet de débats houleux. Par conséquent, les nombreux écarts de données dans les études réalisées avec différents modèles de souris déficientes en MC nécessitent une réévaluation systématique des fonctions immunologiques de MCs au-delà allergie2. Mature MC est principalement localisés dans les tissus et les organes comme la peau, des poumons et intestins et se trouvent habituellement qu’en petit nombre dans le sang. MCs dérivent de précurseurs hématopoïétiques, tels que les progéniteurs de MC et terminer leur différenciation et maturation dans les micro-environnements de presque tous les tissus vascularisés1. T-cell-facteur dérivé de l’interleukine (IL) -3 favorise sélectivement la viabilité, la prolifération et la différenciation d’une population de pluripotentes de souris MCs de leurs progéniteurs hématopoïétiques3. Stem cell factor (SCF) est produite par des cellules structurelles dans les tissus et joue un rôle crucial dans le développement, survie, migrations et fonction4MC. Les propriétés de la PSC individuels peuvent différer selon leur capacité à synthétiser et stocker diverses protéases ou les protéoglycanes. Chez la souris, le MCs dits du tissu conjonctif-types se distinguent des muqueuses MCs selon leur localisation anatomique, la morphologie et contenu de l’héparine et protéases5.
Selon MCs, une augmentation de libre cytosolique Ca2 + ([Ca2 +]i) est indispensable pour la dégranulation et la production des eicosanoïdes, ainsi que pour la synthèse de cytokines et l’activation de facteurs de transcription en réponse à l’antigène et divers sécrétagogues6. Une cible majeure en aval de ces stimuli est phospholipase C, qui hydrolyse la phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycérol (DAG) et inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG active la protéine kinase C et IP3 libère des ions de Ca2 + du réticulum endoplasmique. L’appauvrissement de ces magasins active influx de Ca2 + par la membrane plasmique Ca2 + voie, menant à le pour entrée de calcium exploités (SOCE) de stocker. Ce processus est évoqué à travers l’interaction du Ca2 +-capteur, stromales interaction molécule-1 (Stim1), dans le réticulum endoplasmique avec Orai17 , ainsi que par le biais de l’activation du récepteur transitoire potentiels canonique (TRPC) canal protéines (pour examen, voir Freichel et al. 20148) dans la membrane plasmique.
Afin d’étudier le rôle physiologique de ces canaux, plusieurs pharmacologique (application de bloqueurs des canaux calciques) ou les approches génétiques sont généralement utilisés. Dans ce dernier cas, suppression de l’expression des protéines est obtenue en ciblant l’ARNm (précipitation) ou la modification de l’ADN génomique globale ou spécifique aux tissus9 suppression d’un exon codant un pore formant la sous-unité d’un canal (knockout). La disponibilité d’un bloqueur avec suffisamment de précision pour que ces canaux est limitée. En outre, l’approche knockdown exige un contrôle minutieux de son effectivité en utilisant, par exemple., Western blot de l’analyse et est entravée par l’absence d’anticorps spécifiques de la protéine ciblée canal dans de nombreux cas. Ainsi, l’utilisation de modèles de souris knock-out est toujours considérée comme l’étalon-or pour une telle analyse. Un modèle préféré in vitro pour l’étude des fonctions de MC est culture de PMC peut être isolé ex vivo comme une population en pleine maturité (par opposition à différencier les MCs in vitro de, par exemple., cellules de moelle osseuse)10 . Par rapport à la moelle osseuse provenant de MCs (BMMCs), qui sont aussi couramment utilisées pour étudier la fonction MC in vitro, la stimulation des FcεRI et bêta-hexosaminidase libération est augmentée 8 fois et 100 fois dans PMC, respectivement. Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement et culture des PMC murine, qui permet d’obtenir après que 2 semaines de culture un nombre élevé de pure du tissu conjonctif type MCs, suffisantes pour une analyse ultérieure.
Malgré les récents progrès dans l’élaboration et l’application des indicateurs de calcium génétiquement encodé, leur utilisation est encore limitée par les difficultés de livraison de gènes aux cellules cibles, en particulier, dans les cellules hautement spécialisés comme MCs cultivés primaires. En outre, ce groupe d’indicateurs fluorescents pour [Ca2 +]je mesures manque encore ratiométrique colorants avec une plage dynamique élevée. Pour ces raisons, la méthode préférée pour ratiométrique [Ca2 +]je mesure est toujours l’utilisation du colorant fluorescent « Fura-2 »11.
Actuellement, la plus couramment utilisée approche pour l’évaluation de l’activation de MC et dégranulation est la mesure de l’activité β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, un médiateur allergique, est l’un des composants de granule MC est publié conjointement avec l’histamine dans une proportion constante du MCs12. Β-hexosaminidase peut être mesuré facilement et avec précision par le biais de sa réaction avec un substrat spécifique, ce qui produit une quantité mesurable d’un produit de colorigenic qui est facilement détectable dans un dosage colorimétrique de la microplaque. Dans cet article, une application de cette technique d’analyse de dégranulation PMC en réponse à divers stimuli est signalée.
Agrégation des récepteurs haute affinité IgE plasmiques (FcɛRI) active dans MCs, une voie de signalisation intracellulaire versatile, conduisant à une libération du contenu des granules sécréteurs dans l’espace extracellulaire environnant. En plus de l’antigène spécifique, beaucoup d’autres stimuli peut activer MCs pour libérer un éventail varié d’immunomodulateurs médiateurs, comme complément anaphylatoxines (e.g., C3a et C5a)13, l’endothéline de peptide vasoconstricteur 1 (ET1)14 , bien que de nombreuses substances cationiques et médicaments provoquant des réactions pseudoallergic (e.g., icatibant)15 en se liant à MRGPRX216. Des voies de signalisation intracellulaire impliqué dans MCs MRGPR induite par la dégranulation sont mal caractérisés par rapport à la signalisation intracellulaire induite par le FcɛRI ; ces voies n’a commencé à étudier intensivement pendant les dernières d’années quelques17 après l' identification de récepteurs16. Dans une large mesure, les canaux ioniques de la membrane plasmique impliqués dans l’entrée de calcium suivie d’une stimulation MRGPRX2 restent à être compris. Par conséquent, le présent article se concentre également sur la signalisation calcique intracellulaire et dégranulation de MCs stimulée par les agonistes de la MRGPR.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-DNP&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Compound 48/80&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrophényle 2-acétamido-2-désoxy-&bêta ;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’imagerie</td><td>CoverWell Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits, fond en forme de V&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 96 puits, fond plat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques de microtitration avec logiciel « i-control"&nbsp ;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, infini M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger en plastique</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture (25 cm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-verres ronds ; &oslash ; 25 mm ; N° 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 Huile</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC Set de filtres Fura 2&nbsp ;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse monochromatique</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Programme d’acquisition d’images</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Système d’application de solution alimentée par gravité</td><td></td> Tubes de centrifugation en plastique <td>4 canaux</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td> sur mesure <td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de banc</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mastocytes (STM), dans le cadre du système immunitaire, joue un rôle clé dans la défense de l’hôte contre plusieurs agents pathogènes et à l’initiation de la réponse immuno-allergique. L’activation de la PSC via la mise en réseau de surface IgE lié au récepteur de haute affinité IgE (FcεRI), ainsi que par le biais de la stimulation de plusieurs autres récepteurs, initie la montée de la libre niveau2 + Ca intracellulaire ([Ca2 +]i) qui favorise la libération de médiateurs inflammatoires et allergiques. L’identification des constituants moléculaires impliquées dans ces voies de signalisation est cruciale pour comprendre la régulation de la fonction de MC. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement du type murin du tissu conjonctif MCs par lavage péritonéal et culture du MCs péritonéales (PMC). Cultures de MCs de divers modèles de souris knock-out par cette méthodologie représentent une approche utile pour l’identification des protéines impliquées dans les voies de signalisation de MC. En outre, nous décrivent également un protocole pour la seule cellule Fura-2 imagerie comme une technique importante pour la quantification du Ca2 + signalisation au MCs. basés sur la Fluorescence suivi de [Ca2 +]j’ai est un fiable et communément utilisé approche étude de Ca2 + signalisation des événements, y compris entrée magasin fonctionnant de calcium, qui est d’une importance capitale pour l’activation du MC. Pour l’analyse de dégranulation MC, nous décrivons un β-hexosaminidase test de libération. Le montant de la β-hexosaminidase libérée dans le milieu de culture est considéré comme un marqueur de dégranulation pour tous les trois différents sécrétoires sous-ensembles décrit dans MCs. β-hexosaminidase peut facilement être quantifié par sa réaction avec un substrat de colorigenic dans un test colorimétrique plaque de microtitration. Cette technique hautement reproductible est rentable et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Dans l’ensemble, le protocole fourni montre un rendement élevé de MCs exprimant des marqueurs de surface MC typiques, affichant des caractéristiques morphologiques et phénotypiques typiques de MCs et démontrant des réponses hautement reproductibles à sécrétagogues Ca2 +- tests d’imagerie et de la dégranulation.

PMC ont été isolées de 3 souris de type sauvage (C57BL/6N) par lavage intrapéritonéale et plus cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 20 % de FCS et 1 % Pen-Strep en présence de facteurs de croissance (IL-3 à 10 ng/mL) et le SCF à 30 ng/mL sous stérile humidifiée conditions à 37 ° C et 5 % de CO2. Le milieu a été changé 2 et 9 jours après l’isolement cellulaire. La morphologie de la cellule a été analysée à l’aide de transmission lumière imagerie DIC (voir <strong class...

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation intracellulaire sur les cellules excitables, telles que les canaux ioniques essentiels à l’activation des cellules immunitaires et à la libération de médiateurs. Les principaux avantages de ces techniques sont leur relative simplicité et la possibilité d’analyser simultanément un grand nombre de cellules. Kathrin Ohlenschlager, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de l’imagerie calcique de Fura-2 dans les mastocytes.Pour commencer cette procédure, vaporisez la souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70 % et fixez-la sur un bloc de mousse avec son côté dorsal vers le bas à l’aide d’épingles. À l’aide de ciseaux à bord émoussé, retirez la peau de l’abdomen de la souris et évitez d’endommager la cavité péritonéale. Ensuite, injectez sept millilitres de milieu RPMI glacé dans la cavité péritonéale en insérant soigneusement une aiguille de calibre 27 dans le péritoine.Ne perforez aucun organe et utilisez un endroit dans la région de la graisse épididymaire pour réduire le risque de perforation d’organe. Après l’injection, secouez la souris pendant une minute pour dét

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Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

Le but de ce protocole est d'isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l'aide de collagène. Ce protocole permet l'isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l'immunophénotypage robuste.

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

Les techniques de génération d’une bibliothèque de peptides courts pouvant activer les mastocytes via le récepteur MRGPRX2 sont décrites. Les techniques associées sont faciles, peu coûteuses et peuvent être étendues à d’autres récepteurs cellulaires.

Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Découvrez l'isolement des mastocytes péritonéaux murins et leur caractérisation fonctionnelle par imagerie calcique Fura-2 et dosage de dégranulation β-hexosaminidase. Ces méthodes simples permettent l'analyse simultanée de nombreuses cellules.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca^{2 +}-imagerie et des essais de dégranulation

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