Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca^{2 +}-imagerie et des essais de dégranulation

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation intracellulaire sur les cellules excitables, telles que les canaux ioniques essentiels à l’activation des cellules immunitaires et à la libération de médiateurs. Les principaux avantages de ces techniques sont leur relative simplicité et la possibilité d’analyser simultanément un grand nombre de cellules. Kathrin Ohlenschlager, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de l’imagerie calcique de Fura-2 dans les mastocytes.

Pour commencer cette procédure, vaporisez la souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70 % et fixez-la sur un bloc de mousse avec son côté dorsal vers le bas à l’aide d’épingles. À l’aide de ciseaux à bord émoussé, retirez la peau de l’abdomen de la souris et évitez d’endommager la cavité péritonéale. Ensuite, injectez sept millilitres de milieu RPMI glacé dans la cavité péritonéale en insérant soigneusement une aiguille de calibre 27 dans le péritoine.

Ne perforez aucun organe et utilisez un endroit dans la région de la graisse épididymaire pour réduire le risque de perforation d’organe. Après l’injection, secouez la souris pendant une minute pour détacher les cellules péritonéales dans le milieu RMPI. Ne secouez pas trop fort la souris pour éviter d’endommager les organes internes et de contaminer la cavité péritonéale avec le sang.

Ensuite, réutilisez la seringue en l’équipant d’une nouvelle canule de calibre 20. Déplacez les organes internes d’un côté en inclinant le bloc de mousse et en le tapotant doucement sur le banc pour faciliter l’aspiration moyenne de l’autre côté. Par la suite, insérez une aiguille de calibre 20 biseautée vers le haut pour aspirer le liquide de l’abdomen doucement et lentement afin d’éviter l’obstruction par les organes internes.

Recueillez autant de liquide que possible. Ensuite, retirez l’aiguille de la seringue et transférez la suspension cellulaire recueillie dans un tube de collecte sur de la glace. Jetez un tube d’échantillon s’il y a une contamination sanguine visible.

Centrifuger le tube avec une suspension à cellules propres à 300 g pendant cinq minutes. Sous une hotte stérile, aspirez le surnageant. Remettez les granulés d’échantillon en suspension dans un milieu PMC froid et transférez la suspension cellulaire dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés.

Par la suite, ajoutez les facteurs de croissance IL-3 et SCF aux concentrations finales de 10 nanogrammes par millilitre et 30 nanogrammes par millilitre, respectivement. Incuber les cellules pendant environ 48 heures à 37 degrés Celsius jusqu’à la prochaine procédure. Du 12e au 15e jour, si des expériences de stimulation des récepteurs IgE plasmalemmaux sont prévues, prétraitez les cellules pendant la nuit avec 300 nanogrammes par millilitre d’anti-DNP IgE dans un milieu de culture standard.

Pour préparer l’imagerie de Fura-2, diluez la solution mère de Fura-2, AM dans du HBSS de calcium jusqu’à une concentration finale de cinq micromolaires afin de préparer le tampon de chargement. Ensuite, mélangez 500 microlitres de tampon de chargement avec 500 microlitres de suspension de cellule PMC. Pipetez le mélange dans la chambre d’imagerie et incubez les cellules pendant 20 à 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Mettre en place le système d’application par gravité avec différentes solutions en fonction du protocole de stimulation. Ensuite, montez le système d’application sur la platine du microscope inversé. Préparez un objectif d’immersion dans l’huile à grande ouverture 40X en plaçant une petite goutte d’huile d’immersion dessus.

Placez la chambre d’imagerie avec les cellules chargées dans le système d’application et fixez-la pour éviter tout mouvement pendant l’enregistrement. Ensuite, allumez la lumière transmise et concentrez-vous sur les cellules. Par la suite, démarrez le programme d’acquisition d’imagerie en mode Acquisition Physiologique.

Ouvrez la fenêtre de configuration et ajustez la mise au point et le temps d’acquisition optimal. Créez la image d’une image de référence et marquez les cellules comme zones d’intérêt. Marquez le dernier retour sur investissement dans une zone où aucune cellule n’est présente et définissez-le comme arrière-plan.

Ensuite, terminez la configuration et démarrez la mesure avec un taux d’acquisition de cinq secondes. Ensuite, ajoutez des solutions au bon numéro de cycle selon le plan de l’expérience. Pour mesurer l’élévation de la concentration de calcium intracellulaire induite par l’antigène, appliquez la solution de seringue deux après le cycle 20 et arrêtez l’enregistrement après le cycle 150.

Pour mesurer l’élévation de la concentration intracellulaire de calcium induite par le composé 48/80, appliquez la solution de seringue trois après le cycle 20 et arrêtez l’enregistrement après le cycle 150. Pour mesurer l’élévation de la concentration de calcium intracellulaire évoquée par l’ECS, appliquez la solution de seringue-quatre après le cycle 10, appliquez la solution de seringue-cinq après le cycle 70, appliquez la solution de seringue-quatre après le cycle 120, appliquez la solution de seringue-un après le cycle 150 et arrêtez l’enregistrement après le cycle 220. Dans le programme d’acquisition, appuyez successivement sur les boutons Démarrer le cutter, Marquer tout, Convertir tout, Mesures de physiologie, OK, puis à nouveau OK.

Enregistrez les fichiers sous forme de tables et de piles d’images pour une analyse hors ligne. Pour mesurer la libération de bêta-hexosaminidase, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond en V de 96 puits. Ajoutez 25 microlitres de solution de stimulation ou de contrôle dans chaque puits.

Ensuite, incubez les cellules pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, arrêtez la réaction en plaçant la plaque à 96 puits sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez la plaque à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes à 120 g.

Transférez 120 microlitres de surnageant dans une plaque à fond plat de 96 puits et placez-la sur de la glace. Évitez soigneusement de toucher les pastilles de cellules, mais aspirez complètement le surnageant. Ensuite, ajoutez 125 microlitres de tampon de lyse aux pastilles de cellule.

Incuber les pastilles cellulaires pendant cinq minutes à température ambiante et les remettre en suspension après l’incubation par pipetage répété. Pipetez 25 microlitres de la solution pNAG de quatre millimolaires dans les puits requis d’une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits. Ajoutez 25 microlitres de chaque surnageant et 25 microlitres de chaque lysat cellulaire séparément à la solution de pNAG préparée.

Incuber les lots de réaction pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, pipetez 150 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction. Ensuite, analysez l’absorbance lumineuse de l’échantillon de plaque avec un lecteur de micro-plaques à 405 nanomètres avec une référence de 630 nanomètres pour la soustraction automatique du bruit de fond.

Dans le programme d’acquisition, cochez la case Référence, et dans le menu des éléments du programme d’absorbance, sélectionnez 630 nanomètres pour la soustraction automatique de l’arrière-plan. Un test de libération de bêta-hexosaminidase a été réalisé pour tester la capacité des PMC isolées qui subissent une dégranulation lors de la réticulation des récepteurs plasmalemmaux IgE de haute affinité ou de la stimulation des récepteurs Mrg PRB2. Les cellules ont été ajoutées à une plaque à fond en V de 96 puits et stimulées selon ce schéma pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius.

Après centrifugation et élimination du surnageant, les granulés ont été lysés. La teneur en bêta-hexosaminidase des surnageants individuels et des lysats de pastilles a ensuite été analysée par leurs réactions avec la pNAG au cours d’une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius. La quantité de produits de réaction a été détectée colorimétriquement et le pourcentage de bêta-hexosaminidase libérée a été calculé.

La libération spontanée était très faible, tandis que les réponses à de forts stimuli de dégranulation, tels que l’ionomycine 10 micromolaires et le composé 48/80 à 50 microgrammes par millilitre, étaient respectivement supérieures à 40 % et 60 %. Les réponses de dégranulation à la stimulation DNP étaient dose-dépendantes sur la plage de concentration de 10 à 300 milligrammes par millilitre. L’ensemble de ces données indique clairement un bon état de fonctionnement des PMC isolées.

En utilisant cette technique, vous obtiendrez une population très pure de mastocytes murins matures du tissu conjonctif dérivés du péritoine en deux semaines. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des conditions stériles pendant l’isolement et la culture des cellules pour éviter la contamination bactérienne. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que les mesures électrophysiologiques du courant ionique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les voies d’entrée du calcium dans les mastocytes.

Après son développement, la technique d’imagerie calcique intracellulaire Fura-2 a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie cellulaire de masse pour explorer la dépendance calcique de la dégranulation des mastocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences d’imagerie calcique Fura-2 et un test de dégranulation de la bêta-hexosaminidase avec des mastocytes. N’oubliez pas que travailler avec des rayons UV peut être dangereux pour les yeux et la peau, et qu’une exposition inutile doit être évitée lors de l’exécution de cette procédure.