Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

L’objectif global de la combinaison de l’interférence de l’ARN médiée par des microARN artificiels avec l’optogénétique est de caractériser l’effet de l’inactivation des gènes sur la fonction présynaptique dans les circuits neuronaux intacts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie synaptique, comme le rôle physiologique des protéines présynaptiques dans les circuits cérébraux intacts. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de suivre sélectivement la transmission synaptique au niveau des neurones à expression réduite de la protéine présynaptique étudiée.

De plus, nous avons utilisé cette méthode pour étudier la fonction présynaptique dans des tranches de cerveau aiguës. Il peut également être appliqué pour manipuler et sonder la sécurité neuronale in vivo. La démonstration de la procédure sera assurée par Carmela Vitale, une étudiante diplômée de notre laboratoire.

Après avoir conçu les microARN et construit un vecteur recombinant pour exprimer les microARN et la sonde optogénétique, préparez des cultures neuronales primaires à partir de la région cérébrale d’intérêt. Pour ce faire, suivez un protocole de corticoculation établi par L.A.Cingolani and Company avec les modifications suivantes. Tout d’abord, utilisez des plaques à six puits, une plaque d’un demi-million de neurones par puits et utilisez 2,5 millilitres de milieu d’attache par puits.

Après avoir incubé la plaque pendant quatre heures, passez à 3,3 millilitres de milieu d’entretien par puits, et si une prolifération d’astrocytes est observée, ajoutez 0,5 millilitre de milieu d’entretien complété par 7,5 micromolaires d’AraC à trois ou quatre DIV. À cinq ou six DIV, infectez trois puits pour chaque microARN à tester. Utilisez la dose infectieuse la plus faible qui infectera au moins 99 % des neurones.

Ajoutez le virus directement dans les neurones, mélangez doucement et remettez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. À 17 à 18 DIV, lyser les neurones pour une extraction d’ARN. Inclinez les plaques et utilisez des pipettes en verre pour retirer tout le milieu de chaque puits.

Ensuite, ajoutez immédiatement 700 microlitres de réactif de lyse dans chaque puits. Après un bref mélange, transférez le lysat cellulaire hors de chaque puits et dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 140 microlitres de chloroforme à chaque lysat.

Fermez rapidement et secouez vigoureusement les tubes pendant 15 secondes pour émulsionner le contenu. Ensuite, centrifugez les tubes à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure contenant l’ARN dans un nouveau tube.

Ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la phase organique. À la phase aqueuse, ajoutez 1,5 volume d’éthanol à 100 % et pipetez lentement la solution trois fois pour la mélanger. Ensuite, purifiez l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et quantifiez les rendements.

Attendez-vous à au moins 3,5 microgrammes par échantillon. Les rapports de pureté sur les protéines et les composés organiques doivent tous deux être d’au moins 1,9. Ensuite, utilisez un kit pour rétrotranscrire 250, 500 ou 1 000 nanogrammes d’ARN.

Ensuite, quantifiez l’efficacité d’inactivation du gène endogène d’intérêt par RTPCR quantitatif. Visez une efficacité d’inactivation d’au moins 60 %Pour ce protocole, utilisez un animal qui, 15 jours auparavant ou plus, s’est fait injecter du RAAV12 dans le cerveau selon un protocole précédemment publié par A.Cetin and Company. Isolez le cerveau et faites des coupes cérébrales aiguës avec un vibratome et un ACFF glacé gazé.

Prélever les tranches de la région d’intérêt, et minimiser leur exposition à la lumière pour éviter l’activation de la sonde optogénétique. Laissez les tranches récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans le même ACFF. Utilisez une chambre spécialement conçue pour contenir des tranches de cerveau.

Ensuite, remettez les tranches à température ambiante, où elles resteront saines pendant six à huit heures. Pour continuer, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement et superfusionnez-la à raison de deux millilitres par minute d’ACFF. Ensuite, vérifiez brièvement le signal du rapporteur fluorescent exprimé pour déterminer la localisation et l’intensité de l’infection.

Ensuite, remplissez une électrode patch avec la solution intracellulaire. Maintenant, sous éclairage infrarouge, obtenez une configuration globale étanche sur un neurone qui reçoit des entrées synaptiques des neurones infectés. La résistance série peut être laissée non compensée, mais elle doit être constante et faible.

Par exemple, si les neurones pyramidaux CA3 ont été infectés, patchez les neurones pyramidaux dans le tractus proximal à médial de la région CA1. Lorsque les cellules commencent à sembler rétrécies ou gonflées, lorsque le patchage devient difficile ou que les lots sont instables, les tranches sélectionnées ne sont plus assez saines pour être enregistrées. Ensuite, utilisez la pharmacologie pour isoler les courants synaptiques étudiés.

Par exemple, si l’objectif est d’étudier la transmission synaptique excitatrice, bloquez la transmission synaptique inhibitrice en ajoutant de la biculline dans le bain. Ensuite, évoquez des courants synaptiques, tels que des courants postsynaptiques excitateurs, à l’aide d’un laser bleu de 473 nanomètres couplé à une fibre optique positionnée sur le somata des neurones infectés. Ne dirigez pas le laser sur les axones des neurones.

Par exemple, évitez de mettre en lumière les garanties de Shaffer. La dépolarisation directe des axones n’est pas souhaitable. Ensuite, ajustez la durée de la stimulation au minimum pour réduire la possibilité d’évoquer plus d’un potentiel d’action par impulsion lumineuse.

Ensuite, affinez l’intensité du laser pour évoquer un courant synaptique faible mais clairement détectable. Par exemple, pour la transmission synaptique excitatrice entre les neurones pyramidaux CA3 et CA1, ajustez l’intensité du laser pour évoquer des courants synaptiques de 20 à 50 picoampères. À la fin de l’expérience, appliquez de la tétrodotoxine à 0,5 micromolaire pour bloquer les canaux sodiques.

La sensibilité des courants évoqués optiquement à la tétrodotoxine indique qu’ils sont entraînés par le potentiel d’action. Continuez à collecter des données jusqu’à ce qu’au moins huit neurones aient été corrigés pour une condition donnée chez au moins trois animaux différents. Il s’agit des données minimales nécessaires à l’analyse des résultats.

En utilisant la méthode décrite, d’autres isoformes d’épissage des canaux calciques voltage-dépendants de type P/Q présynaptiques ont été éliminées. On pense que ces canaux régulent la plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses excitatrices CA3 à CA1. Quatre constructions différentes exprimant des microARN spécifiques à l’isoforme ont été réalisées ; chacun a été exprimé avec un canal ultra-rapide rhodopsine avec la protéine fluorescente Td-Tomato.

Tout d’abord, il a été confirmé que chaque construction avait une efficacité et une sélectivité suffisantes dans les cultures neuronales primaires de rat à l’aide de RTPCR quantitative spécifique à l’isoforme. Ensuite, chaque construction a été injectée dans l’hippocampe de rats P18. En fin de compte, l’effet des constructions sur la plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses CA3 à CA1 a été étudié en stimulant les neurones pyramidaux CA3 infectés avec de brèves impulsions de lumière de 473 nanomètres et en enregistrant les EPSC résultantes en configuration globale à partir de neurones pyramidaux de la région CA1.

L’inactivation de différentes isoformes d’épissage a affecté les réponses à la stimulation pulsée appariée dans des directions opposées. Knockdown de l’isoforme A boosté par la facilitation d’impulsions appariées ; tandis que l’inactivation de l’isoforme B l’a abolie. La combinaison des interférences ARN optogénétique permet aux recherches dans le domaine de la physiologie synaptique d’explorer comment les protéines présynaptiques régulent la plasticité synaptique à court terme dans les circuits intacts.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider les microARN pour l’interférence ARN et de les combiner avec l’optogénétique pour étudier la transmission synaptique dans les tranches cérébrales aiguës.