Name: Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez une méthode combinant microARN artificiel et optogénétique pour caractériser l'effet du knockdown génique sur la fonction présynaptique dans les circuits neuronaux intacts. Cette technique permet d'étudier la transmission synaptique sélectivement.

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Nous remercions Benfenati F. (Istituto Italiano di Tecnologia, ITI) pour l’appui et Carmela Vitale pour aider à la manifestation. Ce travail a été financé par l’IIT et la Compagnia San Paolo (subvention n° 9734 à bac).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La co-expression d’une sonde optogenetic et une miR contre un gène présynaptique d’intérêt offre une approche puissante pour caractériser l’effet du gène fonction présynaptique dans les circuits de neurones intacts. Pour cette approche expérimentale, il est important d’identifier et de caractériser les miRs qui sont hautement efficaces et sélective pour faire tomber le gène d’intérêt dans les systèmes natifs. Si possible, deux ou plusieurs miRs indépendantes contre l’ARNm même d’intérêt devraient servir à contrôler pour les éventuels effets hors cible. Expériences de sauvetage, dans lequel un gène résistant à la miR est réintroduit dans le système, utilisable comme un contrôle pour la spécificité.
À l’aide de la même construction pour exprimer une optogenetic sonde et une miR permet stimulant optiquement seulement les neurones présynaptiques qui ont été manipulés. Ce n’est pas possible avec les stimulations électriques parce qu’ils ne distinguent pas entre les neurones infectés et non infectés, produisant ainsi des résultats mixtes et dilués. Parce que les stimulations optiques peuvent induire plusieurs potentiels d’action15, il est important de choisir seulement les sondes optogenetic plus rapide, parmi une palette en expansion15,19,20,21. En outre, il est essentiel de s’assurer que la stimulation optique n’induit pas une dépolarisation directe de boutons présynaptiques, afin d’éviter de contourner certaines des étapes de la transmission synaptique, on veut enquêter sur22.
L’approche expérimentale, nous décrivons ici, permet d’évaluer en parallèle la pertinence physiologique de multiples gènes présynaptiques d’intérêt dans une période de temps limitée (4 – 6 mois). Toutefois, il est important de garder à l’esprit que les passes rabattues atteignent rarement 100 %. En outre, rAAVs doivent être exprimées au moins deux semaines, permettant l’expression maximale de coup de masse et complet de la sonde d’optogenetic, ce qui peut représenter une contrainte de temps dans les enquêtes sur les processus de développement précoces. Bien que plus chez des souris knockout temps, conditionnelle limitées aux neurones présynaptiques, a généralement lieu à terminer la suppression du gène d’intérêt et offre donc une approche complémentaire valide.
Un avantage spécifique de la technologie de miR, c’est qu’il permet l’expression de multiples miRs du même promoteur. Cette propriété a été principalement utilisée pour augmenter l’efficacité défiant en insérant plusieurs copies du même miR ou différents miRs contre le même gène cible. Il peut cependant être utilisé également pour knockdown gènes multiples en exprimant miRs contre cibles différents gènes7,23. Cette propriété peut être utilisée pour faire taire les nombreuses protéines présynaptiques pour disséquer les voies de signalisation présynaptiques.
Ici, nous avons combiné optogenetics avec miRs artificiels pour caractériser les effets du gène sur la fonction présynaptique des tranches d’hippocampe aiguës. Une approche similaire pourrait également être utilisée pour manipuler et sonde circuit neuronal en vivo. En outre, alliant miRs artificiels chemogenetic approches permettrait d’interroger un circuit neuronal sur des échelles temporelles plus longues.

Ce protocole décrit une nouvelle approche pour caractériser l’effet du gène fonction présynaptique dans les circuits de neurones intacts. Une expérience sur une fonction présynaptique dans les circuits de neurones intacts est difficile car de nombreux boutons présynaptiques sont trop petites et loin de la soma pour permettre des interventions moléculaires et électrophysiologiques combinées. Même si l’interférence d’ARN offre un moyen puissant et flexible de précipitation de protéines synaptiques1, cette approche a été utilisée avec parcimonie pour étudier la fonction présynaptique parce qu’il est difficile de déceler les effets d’assommement traditionnelles les stimulations électriques, qui ne distinguent pas manipulé et naïve boutons présynaptique2. Ici, nous décrivons comment combiner des micro-ARN artificiel (miR)-mediated RNA interference avec technologie optogenetic récemment mis au point pour atteindre la stimulation sélective de manipuler boutons présynaptiques en tranches cérébrale aiguë.
Souris knock-out conditionnel en combinaison avec l’électrophysiologie pourraient également être utilisés pour étudier la fonction des protéines présynaptiques3,4, notre stratégie ne nécessite pas le développement et la maintenance de génétiquement modification des lignées de souris et peut également être facilement utilisée pour abattre les isoformes spécifiques d’un gène. Relative aux plus communément utilisé en épingle à cheveux court RNAs (interférents), miRs artificiels, qui nous occupent ici, offrent des avantages clés de précipitation dans les neurones. À la différence des interférents, elles peuvent être exprimées sous le contrôle d’une polymérase II promoteur1. Ainsi, un promoteur unique peut être utilisé pour piloter l’expression de miR et une sonde d’optogenetic, ainsi qu’un journaliste fluorescent. De cette façon, la taille de la construction peut être maintenue dans les limites de l’emballage des virus recombinants adéno-associés (rAAV, Figure 1 a). Aussi, l’utilisation d’une construction unique et un promoteur unique réduit la variabilité expérimentale parce qu’il permet une expression de la station miR, la sonde optogenetic et le journaliste fluorescent dans un rapport fixe.
Nous avons récemment appliqué cette technologie pour examiner le rôle des isoformes épissés alternativement des canaux calciques présynaptique dans l' hippocampe5. Une telle stratégie est généralement applicable à l’étude de la pertinence physiologique d’autres protéines exprimées de manière présynaptique dans n’importe quel circuit de cerveau d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>Acrylamide/Bis-acrylamide, solution à 30 %</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température d’animal toxique avec coussin chauffant</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de dosage de protéines</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Tranches de cerveau Préchambre</td><td>Appareil de Harvard</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD imageur basé sur</td> caméra <td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade ; </td><td></td>MP</tr><tr><td>Réactifs de culture cellulaire</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blot Réactifs, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Cytosine toxique</td></tr><tr><td>&beta ;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Foret</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pommade à la gentamicine</td><td>Pharmacie</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes d’injection</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Sels inorganiques & détergents</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- créatine phosphate</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade ; 0.2 &micro ; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipette</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant oculaire</td><td>Pharmacie locale</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de phosphate</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade ;, sans EDTA Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td></td></tr><tr><td>Gel de protéines Dispositifs d’électrophorèse et de transfert</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone iode</td><td>Pharmacie locale</td><td>Bétadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Réactif de lyse</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Kit de transcription</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Appareil stéréotaxique</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tétrodotoxine</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

alliant optogenetics artificiel microarn pour caractériser les effets du gène knockdown fonction présynaptique dans les circuits de neurones intacts

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Ce protocole vise à caractériser l’effet du gène fonction présynaptique dans les circuits de neurones intacts. Nous décrivons un flux de travail sur la façon de combiner des micro-ARN artificiel (miR)-mediated RNA interference avec optogenetics pour atteindre la stimulation sélective de manipuler boutons présynaptiques en tranches cérébrale aiguë. L’approche expérimentale implique l’utilisation d’une simple construction virale et un promoteur de neurone-spécifique unique pour piloter l’expression d’une sonde optogenetic et miR(s) artificiel contre un ou des gènes présynaptiques. Lorsqu’elle est injectée à le stereotactically dans la région du cerveau d’intérêt, la construction explicite rend possible de stimuler avec lumière exclusivement les neurones avec une expression réduite du ou les gènes incriminés. Cette stratégie ne requiert pas le développement et le maintien des lignées de souris génétiquement modifiées et peut en principe être appliquée à d’autres organismes et à n’importe quel gène neuronale de choix. Nous avons récemment appliqué afin d’étudier comment la précipitation d’isoformes d’épissage alternatif de présynaptiques canaux de calcium voltage-dépendant de type P/Q (VGCCs) régule la plasticité synaptique à court terme à CA3 de synapses excitatrices CA1 dans des tranches d’hippocampe aiguës. Une approche similaire pourrait également servir à manipuler et étudier le circuit neuronal in vivo.

Les procédures décrites ci-dessus fournissent une méthode robuste pour évaluer la transmission synaptique comment est affectée par la précipitation des protéines synaptiques des neurones présynaptiques. Les résultats représentatifs sur comment la précipitation d’alternative splice isoformes de présynaptique Cav2.1 VGCCs (type P/Q) réglemente la plasticité synaptique à court terme à CA3 de CA1 synapses excitatrices sont donnés ci-dessous à titre d’exemple.
Cav2.1 (type P/Q) canaux sont les VGCCs présynaptiques prédominants au niveau des synapses plus rapides dans le système nerveux central. Alternative d’épissage des exons mutuellement 37 bis et 37 b de la sous-unité de1 α formant des pores de Cav2.1 (α1 a) produit deux variantes principales, Cav2.1 [ALE] et Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Pour déterminer si Cav2.1 [ALE] Cav2.1 [EFb] différentiellement règlent la transmission synaptique et plasticité dans les neurones pyramidaux hippocampe de rat, nous avons développé tout d’abord miRs isoforme spécifique à la précipitation sélective Cav 2.1 [ALE] ou Cav2.1 [EFb]5. Malgré la taille courte (97 bp) et forte similarité (61.86 % d’identité au niveau du nucléotide) entre les exons 37 bis et 37 ter, nous pourrions concevoir trois séquences de miR contre rat Cav2.1 [ALE] (miR EFa1 : TCCTTATAGTGAATGCGGCCG ; miR Cfc2 : ATGTCCTTATAGTGAATGCGG ; miR EFa3 : TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) et deux contre rat Cav2.1 [EFb] (miR EFb1 : ATACATGTCCGGGTAAGGCAT ; miR EFb2 : ATCTGATACATGTCCGGGTAA) avec le rendement élevé knockdown prédit. Comme contrôle négatif (miR contrôle), nous avons utilisé le plasmide pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg contenant une séquence qui ne cible pas n’importe quel gène vertébré connu. Après un premier écran dans les cellules HEK 293 contre canaux hétérologue, nous sélectionné miR EFa1, miR EFa3 et miR EFb2 et clonés leurs cassettes d’expression dans la région 3' UTR du vecteur pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, qui est conçu pour la production de rAAVs et où la promoteur synapsin lecteurs expression de la channelrhodopsin ultrarapide ChETA, la protéine fluorescente rouge TdTomato et miR inséré (Figure 1). Nous avons également reproduit la cassette d’expression du miR EFb2 pour accroître l’efficacité défiant de ce miR.
Ensuite, nous avons préparé rAAV1/2 pour les constructions de quatre ci-dessus et quantifié leurs efficacité défiant et la sélectivité dans les cultures de neurones de rat primaire à l’aide de l’isoforme spécifique qRT-PCR. miR EFa1 et miR EFa3 réduit ARNm de native Cav2.1 [ALE] d’environ 70 %, mais pas celui de Cav2.1 [EFb], tandis que miR EFb réduits ARNm de native Cav2.1 [EFb] de ~ 60 % mais non celle du Cav2.1 [ALE] (Figure 2).
Nous avons ensuite stereotactically injectée chacune des quatre rAAV1/2 dans la région CA3 de l’hippocampe de rats P18 (Figure 3 a-C), avec point de coordonnées (A-P/M-L/D-V de Bregma) 2.6 / ± 2,9 / −2.9. Quinze à vingt-quatre jours après injection, nous avons préparé des tranches d’hippocampe aiguës des rats rAAV1/2-injecté et TdTomato fluorescence permettant de confirmer l’expression et la localisation de rAAVs (Figure 3 b). Afin d’étudier si knockdown présynaptique de Cav2.1 [ALE] ou Cav2.1 [EFb] affecté à court terme plasticité synaptique à CA3 aux synapses CA1, nous avons stimulé les neurones CA3 sélectivement infectés avec bref 473 nm impulsions de lumière laser (2 ms de long ; La figure 3) et enregistré les EPSCs qui en résulte par rapiéçage des neurones pyramidaux dans proximale au tractus médiale de la région CA1 (Figure 3). Nous avons trouvé que la précipitation d’isoformes d’épissure Cav2.1 affecté des réponses à la stimulation d’impulsions pairées dans des directions opposées : précipitation de Cav2.1 [ALE] (miR EFa1 ou miR EFa3) boosté impulsions pairées facilitation (du Pakistan PPF) tandis que knockdown de Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) abolie (Figure 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figure 1 : Schéma des constructions pour l’expression combinée de la sonde optogenetic ultrarapide ChETA et miRs isoforme spécifique contre Cav2.1 [ALE] et Cav2.1 [EFb]. (A) carte du rAAV construire pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, contenant un promoteur synapsin (Syn), le channelrhodopsin ultrarapide ChETA fusionnés à TdTomato et, dans le proximal 3' UTR, une miR Cav2.1 épissure isoforme spécifique. Montré des enzymes de restriction sont fraises unique. (B) haut de la page, schéma de la cassette d’expression. Le promoteur synapsin lecteurs expression du clerge-TdTomato et une miR isoforme spécifique. Bas, complément inverse des séquences cibles 21 nucléotides, qui font partie de la cassette de miR. Pour miR EFb2 deux cassettes de miR identiques ont été exprimés en tandem l’un après l’autre. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> La figure 2. Évaluation de l’efficacité défiant et la sélectivité des miRs isoforme spécifique pour Cav2.1 [ALE] et Cav2.1 [EFb]. Analyse de l’isoforme spécifique qRT-PCR d’ARN isolé des cultures primaires de 17-18 DIV infectés à 6 DIV rAAVs exprimant miRs ciblant soit Cav2.1 [ALE] (miR EFa1 et miR EFa3) ou Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Les données sont normalisées au témoin négatif (miR contrôle). miR EFa1 et miR EFa3 significativement et de façon sélective réduisent les ARNm de Cav2.1 [ALE] (n = cultures 8 et 7, respectivement), tandis que miR EFb significativement et de façon sélective réduit les ARNm de Cav2.1 [EFb] (n = 4 cultures ; *** p &lt; 0,001 ; aller simple analyse de test de variance suivie le post-test de Tukey-Kramer). Les données sont présentées en moyenne ± SEM Ce chiffre a été adapté de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> La figure 3. Évaluant le rôle des Cav2.1 [ALE] et Cav2.1 [EFb] dans l’hippocampe natif de ciblé la stimulation des neurones démontés avec optogenetics. Schéma (A) de la cassette d’expression des constructions rAAV utilisé pour in vivo de l’infection. (B) section hippocampe montrant cette fluorescence TdTomato est limitée à la région CA3 et ses projections. (C) configuration expérimentale : faisceau laser a été dirigé sur les corps cellulaires CA3 et patch clamp enregistrements ont été effectués de neurones pyramidaux CA1. (D) 2 ms-long bleu (473 nm) EPSCs dont PPF est augmenté de miRs ciblage Cav2.1 [ALE] et abolie par miR pour Cav2.1 [EFb] évoquent des impulsions de lumière laser brillées à 20 Hz. (E) Résumé du rapport d’impulsions pairées pour expériences comme dans (D), montrant une augmentation de PPF pour miR EFa1 et miR EFa3 et une diminution de miR EFb2, relative à la station miR contrôle (n = 9-11 enregistrements ; * p = 0,02 ; ** p = 0,01 ; *** p &lt; 0,0004 ; analyse de covariance). Les données sont présentées en moyenne ± SEM Ce chiffre a été adapté de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole prévoit un flux de travail sur la façon de combiner artificielle induite sur les micro-ARN interférence d’ARN avec optogenetics pour stimuler spécifiquement présynaptiques boutons avec une expression réduite de sélectives ou des gènes au sein des circuits de neurones intacts.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

L’objectif global de la combinaison de l’interférence de l’ARN médiée par des microARN artificiels avec l’optogénétique est de caractériser l’effet de l’inactivation des gènes sur la fonction présynaptique dans les circuits neuronaux intacts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie synaptique, comme le rôle physiologique des protéines présynaptiques dans les circuits cérébraux intacts. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de suivre sélectivement la transmission synaptique au niveau des neurones à expression réduite de la protéine présynaptique étudiée.De plus, nous avons utilisé cette méthode pour étudier la fonction présynaptique dans des tranches de cerveau aiguës. Il peut également être appliqué pour manipuler et sonder la sécurité neuronale in vivo. La démonstration de la procédure sera assurée par Carmela Vitale, une étudiante diplômée de notre laboratoire.Après avoir conçu les microARN et construit un vecteur recombinant pour exprimer les microARN et la sonde optogénétique, préparez des cultures neuronales primaires à partir de la région cérébrale d’intérêt. Pour ce faire, suivez un protocole de corticoculation établi par L.A.Cingolani and Company avec les modifications suivantes. Tout d’abord, utilisez des plaques à six puits, une plaque d’un demi-million de neurones par puits et utilisez 2,5 millilitres de milieu d’attache par puits.Après avoir incubé la plaque pendant quatre heures, passez à 3,3 millilitres de milieu d’entretien par puits, et si une prolifération d’astrocytes est observée, ajoutez 0,5 millilitre de milieu d’entretien complété par 7,5 micromolaires d’AraC à trois ou quatre DIV. À cinq ou six DIV, infectez trois puits pour chaque microARN à tester. Utilisez la dose infectieuse la plus faible qui infectera au moins 99 % des neurones.Ajoutez le virus directement dans les neurones, mélangez doucement et remettez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. À 17 à 18 DIV, lyser les neurones pour une extraction d’ARN. Inclinez les plaques et utilisez des pipettes en verre pour retirer tout le milieu de chaque puits.Ensuite, ajoutez immédiatement 700 microlitres de réactif de lyse dans chaque puits. Après un bref mélange, transférez le lysat cellulaire hors de chaque puits et dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 140 microlitres de chloroforme à chaque lysat.Fermez rapidement et secouez vigoureusement les tubes pendant 15 secondes pour émulsionner le contenu. Ensuite, centrifugez les tubes à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure contenant l’ARN dans un nouveau tube.Ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la phase organique. À la phase aqueuse, ajoutez 1,5 volume d’éthanol à 100 % et pipetez lentement la solution trois fois pour la mélanger. Ensuite, purifiez l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et quantifiez les rendements.Attendez-vous à au moins 3,5 microgrammes par échantillon. Les rapports de pureté sur les protéines et les composés organiques doivent tous deux être d’au moins 1,9. Ensuite, utilisez un kit pour rétrotranscrire 250, 500 ou 1 000 nanogrammes d’ARN.Ensuite, quantifiez l’efficacité d’inactivation du gène endogène d’intérêt par RTPCR quantitatif. Visez une efficacité d’inactivation d’au moins 60 %Pour ce protocole, utilisez un animal qui, 15 jours auparavant ou plus, s’est fait injecter du RAAV12 dans le cerveau selon un protocole précédemment publié par A.Cetin and Company. Isolez le cerveau et faites des coupes cérébrales aiguës avec un vibratome et un ACFF glacé gazé.Prélever les tranches de la région d’intérêt, et minimiser leur exposition à la lumière pour éviter l’activation de la sonde optogénétique. Laissez les tranches récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans le même ACFF. Utilisez une chambre spécialement conçue pour contenir des tranches de cerveau.Ensuite, remettez les tranches à température ambiante, où elles resteront saines pendant six à huit heures. Pour continuer, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement et superfusionnez-la à raison de deux millilitres par minute d’ACFF. Ensuite, vérifiez brièvement le signal du rapporteur fluorescent exprimé pour déterminer la localisation et l’intensité de l’infection.Ensuite, remplissez une électrode patch avec la solution intracellulaire. Maintenant, sous éclairage infrarouge, obtenez une configuration globale étanche sur un neurone qui reçoit des entrées synaptiques des neurones infectés. La résistance série peut être laissée non compensée, mais elle doit être constante et faible.Par exemple, si les neurones pyramidaux CA3 ont été infectés, patchez les neurones pyramidaux dans le tractus proximal à médial de la région CA1. Lorsque les cellules commencent à sembler rétrécies ou gonflées, lorsque le patchage devient difficile ou que les lots sont instables, les tranches sélectionnées ne sont plus assez saines pour être enregistrées. Ensuite, utilisez la pharmacologie pour isoler les courants synaptiques étudiés.Par exemple, si l’objectif est d’étudier la transmission synaptique excitatrice, bloquez la transmission synaptique inhibitrice en ajoutant de la biculline dans le bain. Ensuite, évoquez des courants synaptiques, tels que des courants postsynaptiques excitateurs, à l’aide d’un laser bleu de 473 nanomètres couplé à une fibre optique positionnée sur le somata des neurones infectés. Ne dirigez pas le laser sur les axones des neurones.Par exemple, évitez de mettre en lumière les garanties de Shaffer. La dépolarisation directe des axones n’est pas souhaitable. Ensuite, ajustez la durée de la stimulation au minimum pour réduire la possibilité d’évoquer plus d’un potentiel d’action par impulsion lumineuse.Ensuite, affinez l’intensité du laser pour évoquer un courant synaptique faible mais clairement détectable. Par exemple, pour la transmission synaptique excitatrice entre les neurones pyramidaux CA3 et CA1, ajustez l’intensité du laser pour évoquer des courants synaptiques de 20 à 50 picoampères. À la fin de l’expérience, appliquez de la tétrodotoxine à 0,5 micromolaire pour bloquer les canaux sodiques.La sensibilité des courants évoqués optiquement à la tétrodotoxine indique qu’ils sont entraînés par le potentiel d’action. Continuez à collecter des données jusqu’à ce qu’au moins huit neurones aient été corrigés pour une condition donnée chez au moins trois animaux différents. Il s’agit des données minimales nécessaires à l’analyse des résultats.En utilisant la méthode décrite, d’autres isoformes d’épissage des canaux calciques voltage-dépendants de type P/Q présynaptiques ont été éliminées. On pense que ces canaux régulent la plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses excitatrices CA3 à CA1. Quatre constructions différentes exprimant des microARN spécifiques à l’isoforme ont été réalisées ; chacun a été exprimé avec un canal ultra-rapide rhodopsine avec la protéine fluorescente Td-Tomato.Tout d’abord, il a été confirmé que chaque construction avait une efficacité et une sélectivité suffisantes dans les cultures neuronales primaires de rat à l’aide de RTPCR quantitative spécifique à l’isoforme. Ensuite, chaque construction a été injectée dans l’hippocampe de rats P18. En fin de compte, l’effet des constructions sur la plasticité synaptique à court terme au niveau des synapses CA3 à CA1 a été étudié en stimulant les neurones pyramidaux CA3 infectés avec de brèves impulsions de lumière de 473 nanomètres et en enregistrant les EPSC résultantes en configuration globale à partir de neurones pyramidaux de la région CA1.L’inactivation de différentes isoformes d’épissage a affecté les réponses à la stimulation pulsée appariée dans des directions opposées. Knockdown de l’isoforme A boosté par la facilitation d’impulsions appariées ; tandis que l’inactivation de l’isoforme B l’a abolie. La combinaison des interférences ARN optogénétique permet aux recherches dans le domaine de la physiologie synaptique d’explorer comment les protéines présynaptiques régulent la plasticité synaptique à court terme dans les circuits intacts.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider les microARN pour l’interférence ARN et de les combiner avec l’optogénétique pour étudier la transmission synaptique dans les tranches cérébrales aiguës.

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Cette vidéo démontre l’inhibition des courants synaptiques excitateurs par les microARN dans des tranches de cerveau d’hippocampe de souris. Les neurones CA3 ont été infectés par un vecteur viral recombinant hébergeant une construction pour exprimer un rapporteur fluorescent, un canal membranaire activé par la lumière et un microARN qui régule à la baisse l’expression des canaux calciques voltage-dépendants. Lors de la mise en place d’une tranche dans une chambre d’enregistrement et du patchage...

Inhibition médiée par les microARN des courants postsynaptiques excitateurs dans des tranches d’hippocampe de souris

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Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts (Vidéo) | JoVE Journal

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