Reconfigurable canal microfluidique avec flancs Pin-discrétisé

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer un dispositif microfluidique reconfigurable avec des parois latérales constituées d’un réseau de broches. Le principal avantage de ce dispositif microfluidique est sa capacité à traiter des objets et des situations difficiles à écouler qui peuvent être inconnus au stade de la conception du canal. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal à graver de minuscules broches dans des formes d’os de chien.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’assemblage de nombreuses pièces microfluidiques et leur montage sur la base sont difficiles à apprendre à partir du protocole écrit. Cette photo est celle du dispositif microfluidique terminé avec un canal reconfigurable. Ici, la partie reconfigurable se trouve en haut de l’image.

Un schéma de vue éclatée révèle certains de ses principaux composants. Notez en particulier le microcanal et les broches utilisées pour le reconfigurer. Dans un premier temps, gravez les goupilles.

Commencez par des broches en acier inoxydable dégraissées de 0,3 millimètre d’épaisseur, en forme de L, de différentes longueurs. Préparez quatre millilitres d’acide nitrique à 10 % et plongez-y les broches. Ensuite, placez le récipient dans un four à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir récupéré les broches, transférez-les une par une à l’aide d’une pince à épiler dans un récipient rempli d’eau déminéralisée. Ensuite, mettez-les dans l’eau pendant cinq minutes. Une fois terminé, séchez-les avec une serviette en papier.

Préparez 0,5 millilitre d’agent de démoulage et plongez-y les goupilles. Au bout de deux heures, placez les broches dans de l’eau déminéralisée et sonicez-les pendant cinq minutes. La poursuite nécessite un plat de gravure.

Le plat de gravure est fabriqué en verre et en adhésif silicone. Commencez le processus de gravure en distribuant de l’adhésif silicone pour les extrémités des goupilles sur le plat. Placez les goupilles de manière à ce que les pointes de leurs extrémités droites soient immergées dans l’adhésif.

C’est le plat une fois que toutes les broches sont en place et prêtes pour l’étape suivante. Transférez le plat de gravure dans un fermenteur humidifié chauffé à 38 degrés Celsius et attendez toute la nuit pour durcir l’adhésif. Lorsqu’il est prêt, placez le plat de gravure avec des épingles sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius.

Versez 0,8 millilitre d’acide de gravure sur la région découverte des broches. Après 10 minutes, transférez l’acide dans un bécher à l’aide d’une micropipette. Ensuite, ajoutez plus d’acide de gravure dans le plat pour répéter l’étape de gravure.

Après la gravure, vérifiez que la largeur de la zone gravée est d’environ 0,2 millimètre. Si c’est le cas, micropipetez cinq millilitres de solution de bicarbonate de sodium sur le plat de gravure pour neutraliser l’acide restant. Ensuite, utilisez une pince à épiler pour retirer les goupilles en tirant longitudinalement.

Commencez avec un moule fabriqué. Comme dans ce schéma, le moule est destiné à un appareil avec une paroi latérale fixe et un espace pour les broches. Créez le moule sur une lame de verre à l’aide de la lithographie.

Placez la diapositive préparée au fond d’un plat en plastique. Maintenant, versez le prépolymère de PDMS sur le moule à une épaisseur de trois millimètres. Placez le plat dans un dessiccateur sous vide pendant 10 minutes.

Après cela, placez-le dans un four à 65 degrés Celsius pendant une heure. Le résultat est une dalle partiellement durcie. À l’aide d’un scalpel, démoulez la dalle pour les prochaines étapes.

Placez la plaque dans un four à 120 degrés Celsius pendant une heure pour la durcir complètement. Maintenant, travaillez avec la dalle entièrement durcie. Il aura des bords irréguliers le long du motif de la ligne directrice.

À l’aide d’un scalpel, coupez avec précision et propreté les bords irréguliers. Portez une attention particulière à la surface des fentes d’insertion des goupilles pour créer le meilleur appareil. Perforer les trous d’entrée/sortie de la chambre principale et ailleurs à l’aide de poinçons de biopsie.

Maintenant, fabriquez un assemblage de microcanaux. Chauffez une solution de nettoyage à 60 degrés Celsius et procurez-vous un verre de protection numéro quatre. Le couvre-objet mesure 10 millimètres sur 20 millimètres.

Immergez le verre de protection dans la solution pendant 10 minutes. Placez le verre de protection rincé et séché et la plaque PDMS sur l’électrode inférieure d’une coucheuse par pulvérisation cathodique - effectué. Générez du plasma sous vide d’air pendant 30 secondes.

Collez l’article récupéré de manière à ce que les bords s’alignent et que les caractéristiques du canal soient visibles à travers le verre de protection. Utilisez un récipient stérile pour amener les couches collées dans un capuchon laminaire pour les stériliser. Lorsque vous avez terminé, insérez les broches dans la fente.

Les goupilles adjacentes doivent être de longueurs différentes. Les goupilles forment l’autre paroi latérale de la microchambre. Continuez à travailler dans le capot laminaire.

Pour les prochaines étapes, ayez une base prête pour l’appareil. Préparez le remplissage d’espace en homogénéisant un mélange de vaseline blanche et de poudre de polytétrafluoroéthylène. Versez le mélange homogénéisé dans une seringue distributrice et insérez un piston.

Poussez le piston pour remplir l’embout de la seringue. Ensuite, fixez une aiguille et poussez le piston jusqu’à ce que l’aiguille soit remplie. Préparez une deuxième seringue avec un adhésif silicone de la même manière et connectez chacune à un distributeur pneumatique.

Maintenant, versez de l’adhésif silicone sur la base. Placez-le le long de l’une des poches. Ensuite, placez un verre de protection numéro quatre sur la poche et appuyez fermement dessus pour le coller.

Ensuite, distribuez de l’adhésif silicone le long des deux fentes extérieures de la base en dessinant des segments d’environ un millimètre de profondeur. Le long d’une autre fente au milieu, distribuez le remplissage d’espace dans un segment d’un millimètre de profondeur. Mettez plus d’adhésif sur le bord de l’autre poche.

Placez un ensemble de microcanaux sur la poche et appuyez fermement. Encore une fois, placez du remplissage dans la fente au milieu de la base. Ensuite, appliquez de l’adhésif sur les fentes adjacentes.

Laissez l’appareil reposer pendant une journée dans la hotte stérile. Après durcissement, dans le capot laminaire, déplacez chaque goupille jusqu’à un millimètre le long de ses goupilles adjacentes pour les libérer de la barrière élastomère. Mettez en place un test de fluorescence pour détecter les fuites en diluant un colorant fluorescent vert dans de l’eau ionisée.

Ensuite, ouvrez le microcanal pour avoir une largeur cohérente partout. À l’aide d’une micropipette, transférez le colorant vers un orifice d’extrémité du microcanal et remplissez-le de la solution. Dans un grand plat en plastique, placez deux morceaux de papier absorbant mouillé d’eau déminéralisée et l’appareil à l’intérieur.

Incuber le plat dans 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures à 37 degrés Celsius. Visualisez l’appareil récupéré à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée et enregistrez des images. Utilisez-les pour confirmer qu’il n’y a pas de fuite autour des goupilles.

Ces images sont celles d’un échantillon qui fuit et qui ne fuit pas. Un autre test consiste à ensemencer des cellules. Ouvrez le microcanal pour faire un canal droit de 400 microns de large avec la paroi latérale aussi plate que possible.

Ajoutez une suspension de cellule à un port d’extrémité pour remplir le canal. Localisez les broches qui définissent la paroi latérale de la région pour démarrer la culture cellulaire et fermez-les pour enfermer les cellules de la région. En commençant près de la région, fermez toutes les broches afin d’expulser les cellules du canal.

Après avoir aspiré la suspension à partir des orifices d’extrémité, ajoutez du fluide. Placez l’appareil dans un récipient en plastique avec du papier absorbant humide. Incuber pendant un minimum de 24 heures.

Recherchez que les cellules soient d’environ 10 cellules par zone fermée. Ensuite, rétractez lentement une goupille pour élargir la zone de culture. Ces images sont des cellules COS-7 cultivées dans un microcanal reconfigurable.

En neuf jours, la zone de culture des microcanaux a été agrandie. Les données collectées permettent de tracer le nombre de cellules et la densité en fonction du temps. Les points bleus et l’ajustement de la courbe sont pour le nombre de cellules.

Les symboles rouges et les ajustements sont pour la densité. Pour la densité, les flèches verticales indiquent l’expansion de la zone de culture cellulaire à deux, cinq et six jours. Les densités sont calculées pour les mêmes aires de culture.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire une paroi latérale sans fuite d’un canal microfluidique à partir de petites broches. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’effectuer chacune des étapes du protocole avec soin et minutie.

N’oubliez pas que travailler avec de l’acide fort peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la préparation d’une quantité adéquate d’agent neutralisant doivent toujours être prises. À la suite de ces procédures, d’autres cellules contenant du liquide peuvent être introduites afin d’établir des cultures cellulaires plus complexes.