Un modèle de lapin d’Expression du transgène durables dans la veine jugulaire à des greffes d’Interposition artère carotide commune

Cette méthode peut répondre à des questions clés sur la pathogenèse de l’échec de la greffe veineuse. Par exemple, il pourrait identifier les médiateurs de l’échec de la greffe et tester des stratégies visant à prévenir l’échec de la greffe. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à obtenir une expression transgénique durable et stable dans l’endothélium du greffon veineux.

Après avoir anesthésié un lapin selon le protocole textuel, rasez l’animal de l’encoche sternale jusqu’au bord de la mandibule. Une fois la configuration chirurgicale terminée, utilisez l’électrocautérisation pour couper la peau le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et la mandibule, d’environ sept à neuf centimètres de longueur. Fixez ensuite des pinces à serviettes pour maintenir l’incision ouverte.

Disséquez étourdis sous le fascia sur toute la ligne médiane. Ensuite, utilisez l’électrocautérisation pour couper la couche fasciale disséquée le long de la ligne médiane. Ensuite, en commençant par le côté droit, disséquez entre le muscle hyoïdien sternal recouvrant la trachée et le muscle sterno-péphalique pour exposer l’artère carotide commune.

Ensuite, disséquez soigneusement un segment de quatre à cinq centimètres de l’artère carotide commune et ses plus grandes branches libres des tissus environnants. Utilisez des sutures en soie 5-0 pour ligaturer les plus grandes branches de l’artère carotide commune avant de couper chaque branche distale à la suture. Après avoir répété la dissection sur la carotide commune gauche, utilisez une pince de maintien des tissus pour fermer temporairement la couche de tissu sous-cutané.

Ensuite, disséquez le fascia superficiel de la peau du côté droit jusqu’à ce que la veine jugulaire externe soit exposée. Disséquez un segment de quatre à cinq centimètres de la veine jugulaire externe et libérez ses branches du tissu environnant. Utilisez des sutures en soie 5-0 pour ligaturer les branches, puis coupez les branches.

Ensuite, ligaturez la veine isolée aux deux extrémités, coupez l’extrémité crânienne et rincez la lumière avec une solution saline héparinisée. Pour réaliser une greffe veineuse, utilisez un clip vasculaire pour clamper l’artère carotide commune droite à l’extrémité crânienne du segment isolé. Placez ensuite un clip vasculaire sur l’extrémité caudale.

Effectuez maintenant une artériotomie caudale juste crânienne à la pince caudale égale en longueur au diamètre de l’extrémité crânienne du segment veineux. Ensuite, insérez un cathéter IV relié à une seringue de solution saline normale héparinée à travers l’artérioratomie caudale et rincez la lumière de l’artère carotide. Le liquide sortira par l’artériotomie.

En revenant à la veine jugulaire, excisez la veine et posez-la à côté de l’artère carotique. À l’aide de points simples de polypropylène 7-0, suturez l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale jusqu’à l’extrémité crânienne du segment veineux. Placez ensuite un deuxième point à 180 degrés du premier point pour suturer le bord crânien de l’artérioratomie caudale à l’extrémité crânienne du segment de veine.

Placez un troisième point de suture à un point équidistant des deux premiers points de suture sur le côté latéral de l’anastomose. Placez ensuite un quatrième point sur le côté médial de l’anastomose à égale distance des deux premiers points et en face du troisième point. Placez quatre mailles supplémentaires entre chacune des mailles une à quatre.

Effectuez l’artériotomie crânienne du côté caudal du clip distal. La distance entre l’extrémité crânienne de l’artériotomie crânienne et l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale doit être la même que la longueur du segment veineux. La longueur de l’artériotomie crânienne est égale au diamètre de l’extrémité caudale du segment veineux.

Avec la veine prolongée crânienne à partir de l’anastomose le long de la carotide, assurez-vous que la veine n’est pas tordue. Ensuite, utilisez une solution saline normale héparinée pour rincer l’artère carotide et la veine via l’artériotomie crânienne. Ensuite, placez un premier point de suture pour suturer l’extrémité caudale de l’artériotomie crânienne à l’extrémité caudale du segment veineux.

Placez ensuite un deuxième point à 180 degrés du premier point pour suturer le bord crânien de l’artériotomie crânienne jusqu’à l’extrémité caudale du segment veineux. Complétez l’anastomose comme démontré plus tôt dans la vidéo. Relâchez temporairement le clip crânien pour permettre à la greffe veineuse de se remplir de sang et appliquez une légère pression avec de la gaze sèche pour arrêter tout saignement.

Répétez cette étape jusqu’à ce que l’anastomose ne saigne plus. Retirez ensuite les clips crânien et caudal. Utilisez de la gaze pour arrêter tout saignement supplémentaire au niveau des anastomoses.

Utilisez une suture en soie 3-0 pour ligaturer les deux extrémités du segment de l’artère carotide commune entre les anastomoses. Divisez ensuite la carotide à mi-chemin entre les ligatures. Des pulsations vives doivent être observées dans la greffe veineuse.

Répétez le placement de la greffe veineuse sur le côté gauche. Avec une suture PGA 5-0, fermez le tissu sous-cutané avec un motif continu. Ensuite, utilisez une suture PGA 3-0 pour fermer la peau avec un motif intradermique et enterrez les nœuds aux deux extrémités.

Effectuer les soins postopératoires et l’échographie transcutanée selon le protocole texte. Pour effectuer une chirurgie de transfert de gènes, isolez soigneusement la greffe veineuse droite, y compris 1,5 à deux centimètres de l’artère carotide adjacente à la greffe sur les côtés crânien et caudal. Répétez la dissection sur le côté gauche de la même manière.

Utilisez une solution saline normale pour remplir la cavité de la plaie chirurgicale du côté droit afin de permettre la transmission des ondes sonores. Connectez une sonde de débit périvasculaire de deux millimètres à un débitmètre volumique et immergez la sonde dans la solution saline de la cavité de la plaie. Réglez le débit sur zéro.

Placez la sonde de flux autour de l’artère carotide, caudale ou crânienne, jusqu’à la greffe veineuse. Utilisez ensuite un système d’acquisition de données électronique pour enregistrer les données de la sonde de débit. Après avoir injecté de l’héparine dans le lapin via le cathéter IV et l’avoir rincé avec une solution saline, utilisez un clip vasculaire pour clamper l’artère carotide commune à l’extrémité crânienne de la greffe veineuse.

Et puis appliquez un deuxième clip sur la carotide d’environ 10 millimètres caudale à l’anastomose caudale pour laisser place à l’artériotomie. Ensuite, placez deux attaches en soie autour de l’artère carotide juste caudale à la greffe veineuse. Ensuite, à l’aide d’une aiguille pliée de calibre 21 préalablement préparée, percez la caudale carotidienne à la greffe et juste le crâne à la pince vasculaire caudale.

Faites avancer l’aiguille dans la lumière d’avant en arrière deux fois pour vous assurer que la lumière est claire. Retirez ensuite délicatement l’aiguille. Après avoir préparé une seringue et un cathéter IV avec du DMEM selon le protocole de texte, insérez-le dans l’artériotomie carotidienne commune jusqu’au point de courbure et lavez la lumière de la greffe veineuse en la remplissant deux fois de 0,5 millilitres de DMEM.

Retirez le DMEM de la greffe à l’aide d’un doigt ganté pour appuyer légèrement sur l’extrémité crânienne du greffon. Ensuite, faites glisser délicatement le doigt le long du greffon vers l’extrémité caudale du greffon pour évacuer le contenu luminal via l’artériotomie. Retirez la seringue DMEM du cathéter en laissant le cathéter dans le récipient.

Connectez la seringue contenant la solution virale en vous assurant qu’aucun air ne pénètre dans le cathéter. Déplacez les attaches en soie légèrement nouées le long de l’artère jusqu’à ce qu’elles soient autour de l’extrémité du cathéter, mais ne les serrez pas. Perfaction 0,03 millilitre de solution virale pour expulser le DMEM restant du cathéter.

Ensuite, à l’aide d’un doigt, retirez tout le liquide de la lumière de la greffe veineuse en appuyant doucement du crâne vers le caudal. Serrez les deux attaches autour de l’artère et de l’extrémité du cathéter pour sceller la lumière. Perfuser ensuite la solution virale jusqu’à ce que la veine soit distendue.

Posez doucement la seringue sur un nid de gaze. Après 20 minutes, à l’aide d’une seringue vide, aspirez doucement la solution contenant le virus du greffon jusqu’à ce que le vaisseau s’effondre. Retirez la seringue en laissant le cathéter en place.

Ensuite, coupez et dénouez les sutures en soie et retirez le cathéter du vaisseau. Utilisez maintenant une suture en polypropylène 7-0 en X pour fermer l’artériotomie. Ensuite, tirez doucement sur les extrémités de la suture et attachez-les ensemble avec deux nœuds carrés.

Après avoir rétabli le flux sanguin dans la greffe veineuse droite comme décrit dans le protocole de texte, répétez la perfusion du virus sur le côté gauche. Pour prélever les greffons transduis, disséquez les greffes veineuses et les artères carotides communes et effectuez des mesures de débit sur les côtés gauche et droit, comme démontré précédemment. Utilisez une suture en soie 3-0 pour ligaturer l’artère carotide commune droite du crâne au greffon.

Ensuite, utilisez une suture en soie 3-0 pour ligaturer la caudale carotide à la greffe. Exciser le greffon veineux droit en divisant l’artère carotide adjacente entre chacune des ligatures et l’anastomose adjacente. Retirez ensuite la greffe veineuse du lapin et utilisez une solution saline pour rincer la lumière.

La première étape qu’un nouvel opérateur doit franchir est une perméabilité constante de la greffe veineuse après la chirurgie de greffe veineuse initiale et la chirurgie de transduction retardée qui s’ensuit. Lorsqu’une greffe veineuse est brevetée, l’échographie révélera un gros vaisseau sanguin avec un flux sanguin caudal à crânien rapide. Les greffons ont été récoltés trois jours après la transduction, coupés en sections et colorés au X-gal.

L’imagerie faciale des surfaces luminales a montré des greffes veineuses avec une transduction efficace et une mauvaise transduction. Comme le montre ce graphique, les niveaux d’ARNm de la bêta-galactosidase dans les greffes veineuses transduites par le nouvel opérateur n’étaient pas significativement différents des niveaux d’ARNm de la bêta galactosidase dans les greffes veineuses transduits par un opérateur expérimenté. Lors de la réalisation de ce protocole, il est important de ne pas oublier d’inverser la greffe veineuse crânienne à caudale avant de contracter l’anastomose.

Ceci est nécessaire pour éviter l’obstruction de la circulation sanguine par le bolus veineux. Une fois maîtrisées, ces chirurgies peuvent être réalisées en environ trois heures pour la procédure de greffe veineuse, deux heures pour la procédure de transfert de gène de greffe veineuse et 45 minutes pour la procédure de récolte. N’oubliez pas que, comme ce protocole nécessite de travailler avec des vecteurs viraux et des objets tranchants, des procédures appropriées de biosécurité et d’objets tranchants doivent être suivies.