Imagerie de la Neuroinflammation utilisant [11C] DPA-713 dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral ischémique d’animal familier

L’objectif global de cette expérience est de quantifier avec précision la distribution spatiale et l’étendue de la neuroinflammation dans un modèle murin d’AVC ischémique à l’aide de l’imagerie TSPO-TEP et IRM et de valider ces résultats in vivo à l’aide de l’autoradiographie ex vivo. Je suis vraiment ravi de partager avec vous ce guide étape par étape sur la façon d’utiliser l’imagerie TEP pour visualiser la neuroinflammation chez un sujet vivant. Ici, nous utilisons un modèle murin d’AVC à titre d’exemple.

Maintenant, pourquoi voudriez-vous utiliser cette technique ? Il y a plusieurs raisons. La première est que la neuroinflammation, qui n’est qu’une inflammation qui se produit dans le système nerveux central, est considérée comme intimement associée et est à la base de très nombreuses maladies du cerveau, y compris les accidents vasculaires cérébraux, mais aussi la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson, et la liste est longue.

Il est donc extrêmement important que nous disposions de ces techniques qui nous permettent vraiment d’étudier ces phénomènes biologiques. Deuxièmement, l’imagerie TEP offre un certain nombre d’avantages par rapport à certaines des techniques plus traditionnelles. Par exemple, la plupart de ces techniques traditionnelles reposent fortement sur l’utilisation de tissus cérébraux post-mortem humains et de souris, et bien qu’elles aient fourni un certain nombre d’informations importantes, ces techniques sont statiques par nature, ce qui signifie qu’elles ne peuvent vraiment nous donner des informations que sur un moment dans le temps.

Puisque nous savons que le cerveau et le système immunitaire sont tous deux très dynamiques, il est logique que nous voulions avoir une technique qui nous permette de vraiment capturer ces processus moléculaires dans des systèmes vivants et intacts, donc dans leur environnement d’origine en temps réel, et c’est exactement ce que fait l’imagerie TEP. Ici, nous allons vous montrer comment nous utilisons un radiotraceur PET spécifique, le DPA-713, qui est connu pour se lier à la TSPO ou protéine translocatrice. Nous allons vous montrer spécifiquement comment nous injectons une image non seulement dans une souris, mais dans quatre souris en même temps de manière dynamique, et pourquoi c’est si important, c’est que cela aide vraiment à augmenter le nombre de souris que vous pouvez imager n’importe quel jour avec le même lot de traceur, rationalisant ainsi vraiment vos expériences.

Bien que cela soit techniquement difficile, j’espère vraiment que cette vidéo pourra vous guider afin que vous puissiez le faire dans votre propre laboratoire. Commencez par positionner les souris anesthésiées sur le lit du scanner TEP/CT, en vous assurant qu’elles sont bien redressées et bien insérées dans les cônes nasaux. Collez la tête et le corps de chaque souris au lit avec du ruban chirurgical souple, en veillant à ce que la respiration ne soit pas limitée par le placement du ruban.

Une fois que les animaux sont en sécurité dans le lit et que la respiration est stable, allumez le réticule laser et déplacez le lit de balayage de manière à ce qu’il s’aligne avec le cerveau des quatre souris. Déplacez le lit du scanner en position d’acquisition avec le cerveau des souris aussi près que possible du centre du champ de vision. Acquérez une image d’éclaireur des souris pour vérifier leur position, et ajustez la position en faisant glisser la boîte de champ de vision sur l’interface si nécessaire.

Enfin, cliquez sur Démarrer le flux de travail dans le logiciel du scanner pour commencer la tomodensitométrie, en veillant à sélectionner Afficher les invites interactives de l’utilisateur, afin que la TEP puisse être démarrée manuellement avant l’injection de traceur. Une fois que les souris passent automatiquement de la TDM à la TEP, installez l’arrière du scanner pour l’injection du radiotraceur. Placez un rembourrage protecteur et absorbant sur un rebord et assurez-vous que des ciseaux et un briquet sont à portée de main.

Coupez le tube scellé du cathéter avec des ciseaux. Vérifiez que les lignes du cathéter sont exemptes de bulles et confirmez que la canule est toujours dans la veine en effectuant un rinçage salin de 10 à 20 microlitres, puis chargez des seringues de dose précédemment mesurées dans chacun des quatre cathéters, en gardant une trace de la dose administrée à chaque souris. Cliquez sur OK lorsque le scan PET est prêt à démarrer tout en démarrant simultanément une minuterie de 10 secondes.

Ayez deux chercheurs à l’arrière du scanner avec les seringues de dose à la main pour injecter les quatre souris simultanément lorsque la minuterie atteint zéro. Rincez chaque cathéter avec 50 à 100 microlitres de solution saline pour vous assurer que la dose complète pénètre dans la veine de la queue et refermez à nouveau le tube à l’aide d’un briquet. Ensuite, mesurez les seringues de dose à l’aide d’un calibrateur de dose pour obtenir une valeur de radioactivité résiduelle.

Prenez note des valeurs et de l’heure à laquelle elles sont enregistrées. Une fois le balayage terminé, remettez le lit en PET dans sa position d’origine à l’aide du bouton d’accueil horizontal dans le panneau de commande de mouvement. Retirez les souris du scanner et retirez délicatement le cathéter.

Appliquez doucement une pression sur le site de canulation pour éviter les saignements excessifs. Mesurez ensuite l’activité résiduelle dans le cathéter à l’aide d’un calibrateur de dose. Enfin, reconstruisez les données en ouvrant le logiciel de gestion de post-traitement, qui reconstruira automatiquement chaque numérisation à l’aide des données de l’histogramme généré à partir du premier fichier.

Pour l’analyse TEP, commencez par ouvrir le logiciel d’analyse d’images, cliquez sur l’icône Ouvrir les données pour charger l’image CT et sélectionnez l’icône Ajouter des données pour charger la TEP dynamique. Effectuez un contrôle visuel de la qualité des données via l’opérateur de séries chronologiques dans le menu déroulant. Sélectionnez référence et global, puis appliquez un minimum et un maximum appropriés pour l’échelle de couleurs.

Visualisez les données TEP dynamiques image par image, en vérifiant l’absorption de radioactivité et en vérifiant toute confusion de mouvement dans le balayage. Ensuite, créez une image TEP moyenne à l’aide de la fonction Arithmétique. Choisissez la moyenne sélectionnée, désélectionnez Référence et assurez-vous que les options Entrée 1, Entrée 2 et Entrée sont sélectionnées pour créer une moyenne de toutes les images PET.

Allez dans l’onglet Gestionnaire de données et faites glisser l’image moyenne jusqu’à la position Entrée 1 pour permettre la visualisation du signal PET à l’aide de l’image PET moyenne. Ensuite, redistribuez l’échelle de couleurs en cliquant sur le calcul automatique dans l’outil Min/Max. Ensuite, enregistrez le TC dans le fichier PET moyen à l’aide de la fonction 3D automatique dans le menu déroulant Enregistrement de réorientation.

Sélectionnez Réf et entrée 1, puis choisissez Rigide, Rapide, Entrée 1 à l’enregistrement de la référence. Vérifiez visuellement l’enregistrement dans les trois dimensions et ajustez manuellement si nécessaire dans l’onglet Manuel 3D à l’aide des fonctions Translation et Rotation. Lorsque vous êtes satisfait de l’enregistrement, sélectionnez Entrée 2 et Entrée et appliquez à tous les cadres PET en cliquant sur la coche.

Faites un clic droit sur les fichiers CT et PET dans le DM et enregistrez-les en tant que brut. Ensuite, sélectionnez Recadrage dans le menu déroulant et faites glisser les limites de l’image pour recadrer la tête d’une souris à la fois sous le tronc cérébral. Réorientez manuellement les images TEP et TDM afin que le crâne soit droit dans toutes les dimensions.

Chargez l’image MR de cette souris à l’aide du bouton Ajouter des données en haut à gauche de l’interface. Déplacez l’IRM à l’aide de la réorientation 3D manuelle et ajustez-la au crâne dans l’image CT. Ensuite, désactivez la visualisation PET en la désélectionnant dans l’onglet Visual Controller et utilisez uniquement le MR et le CT pour dessiner la région d’intérêt ou le ROI.

Dans l’outil ROI 3D, cliquez sur le bouton Ajouter un ROI pour créer un nouveau ROI et le nommer Infarct. Sélectionnez l’outil Spline, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour dessiner la bordure de la zone d’intérêt et cliquez avec le bouton droit de la souris pour la fermer. Ensuite, créez un nouveau retour sur investissement et étiquetez-le comme controlatéral.

Faites un clic droit sur le retour sur investissement Infarct et sélectionnez Exporter. Déplacez ensuite le ROI en position 2, Entrée 1, pour permettre la visualisation et la réorientation manuelle du nouveau ROI. Avec uniquement l’entrée 1 sélectionnée, cochez la case ROI et choisissez Afficher uniquement pour permettre la visualisation du ROI Infarct sans le réorienter.

Dans le menu Enregistrement de la réorientation, appliquez un retournement gauche-droite à l’aide de la fonction Opérateur et déplacez manuellement le nouveau retour sur investissement vers la région identique du côté controlatéral. Ensuite, sélectionnez l’opérateur Arithmétique et appliquez une multiplication scalaire de deux au nouveau ROI, permettant une quantification indépendante des ROI. Revenez à l’outil ROI 3D.

Allez dans l’onglet Expert et expérimental, puis cliquez sur le bouton Importer le retour sur investissement. Sélectionnez l’entrée 1 dans la boîte de dialogue pour charger le nouveau volume en tant que retour sur investissement controlatéral. Enfin, faites un clic droit sur l’image PET moyenne, déchargez-la et rallumez le PET.

Générez les résultats quantitatifs de l’adoption à l’aide de l’icône Exporter les résultats dans l’outil ROI 3D. Les images TEP/TDM résultantes et les courbes d’activité temporelle montrent une augmentation de l’absorption des radiotraceurs dans les hémisphères ipsilatéraux par rapport aux hémisphères controlatéraux. La quantification d’images cérébrales TEP dynamiques à l’aide de données additionnées de 50 à 60 minutes a révélé une augmentation significative de l’absorption du traceur dans l’hémisphère ipsilatéral par rapport à l’hémisphère controlatéral chez les souris dMCAO, mais pas chez les souris factices, en utilisant l’approche ROI dessinée manuellement.

Après avoir observé cette technique, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier avec précision et efficacité la neuroinflammation dans un modèle murin d’AVC ischémique via TSPO-PET, en utilisant des méthodes d’analyse d’images automatiques et manuelles. Il est important de noter que vous devriez également être en mesure de confirmer ces résultats in vivo à l’aide de l’autoradiographie numérique ex vivo. Étant donné que la demi-vie du carbone 11 est si courte, il est essentiel d’établir un plan expérimental et un calendrier clairs avant de tenter cette procédure afin de maximiser la quantité et la qualité de vos données.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la corrélation entre l’activation gliale et l’expression de TSPO. Gardez à l’esprit que l’utilisation de la radioactivité peut être extrêmement dangereuse. Pour minimiser votre exposition, utilisez des vêtements de protection, des écrans de plomb et augmentez votre distance lors de l’exécution de cette procédure.