Name: Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Apprenez la culture 3D de chondrocytes humains dans des échafaudages de peptides auto-assemblants RAD16-I. Cette méthode rapide favorise la différenciation physiologique et les applications en ingénierie tissulaire.

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Les recherches effectuées par les auteurs a été soutenu en partie par des subventions de l’Union européenne septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) au titre de la subvention contrat no 229239 et de la Fondation AO, exploratoire Recherche Collaborative Research Programme aiguë Cartilage blessure/lésion/défaut (CRP ACI) dans le cadre du projet Bioactive et biomimétiques échafaudages pour la régénération du Cartilage (BIOCART).

1. auto-assemblage Peptide échafaudage (SAPS) préparation
<ol><li>Préparer une solution à 0,5 % du peptide RAD16-j’en sucrose à 20 % (p/v), dans un tube à centrifuger-micro. Laisser agir la solution de peptide pendant 20 min dans un bain ultrasonique à la puissance maximale et à température ambiante (RT) afin d’assurer un mélange homogène. Remarque : Le volume de solution d’être prêt dépendra du nombre d’encapsulations désiré. RAD16-j’ai peptides ne souffrent pas de dégradation dans ces conditions la sonication.</li>
	<li>Diluer la solution de peptide préparée à l’étape 1.1 avec le volume nécessaire de 10 % (p/v) de sucrose pour obtenir la concentration finale souhaitée. Remarque : Un facteur important à prendre en considération est l’ajustement de la concentration initiale de peptide puisque la rigidité de la matrice finale dépendra de ce paramètre. Le RAD16-j’ai peptide solution devrait être 2 x plus concentré que la concentration finale souhaitée de la construction 3D. Normalement, le RAD16 final-j’ai utilisées des concentrations de peptide sont entre 0,15 et 0,5 % (p/v).</li>
	<li>Placez le micro-centrifuge tube contenant la solution de peptide dans un bain à ultrasons à ta pendant 20 min afin d’assurer un mélange homogène. Remarque : La solution de peptide, si ne pas utilisée immédiatement, peut être stockée pendant plusieurs mois à 4 ° C.</li>
</ol>2. cellule préparation de la solution
<ol><li>Centrifuger la suspension cellulaire (obtenue après traitement par la trypsine) 60 x g et RT pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur connectée à une ligne vide et suspendre le culot cellulaire en 3 à 5 mL de saccharose de 10 % (p/v) à l’aide d’une micropipette. Passez à compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules manuel ou automatique. Remarque : La solution de sucrose à 10 % (p/v) est un milieu isotonique et non ionique qui permet pour l’entretien de la cellule et évite la gélification de peptide pendant le malaxage.</li>
	<li>Centrifuger la suspension de cellules à 60 x g et RT pendant 5 min. Retirez le surnageant et le culot cellulaire de suspendre encore dans le volume nécessaire de 10 % (p/v) de sucrose pour obtenir double la concentration cellulaire finale désirée (recommandable environ 4 x 106 cellules / mL).</li>
	<li>Placer un nombre désiré d’inserts de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 6 puits (un insert par encapsulation).</li>
	<li>Laisser agir la solution de peptide préparée à l’étape 1 à la puissance maximale et RT pendant 5 min.</li>
	<li>Pipette et placer 40 µL de la suspension cellulaire (obtenue en 2.3) pour chaque encapsulation désirée plus environ 10 – 15 % de volume supplémentaire dans un tube à centrifuger-micro standard.</li>
</ol>3. 3D Cell Encapsulation dans les programmes d’ajustement structurel
<ol><li>Mélanger un volume égal de la RAD16-j’ai solution à 10 % de saccharose (p/v) (40 µL par encapsulation) avec un volume égal de la suspension cellulaire (40 µL par encapsulation) préparée à l’étape 2 pour obtenir une suspension de cellules dans la concentration de peptide désiré (dans 10 % de saccharose). La composition de pipetage lentement monter et descendre d’environ 10 fois. Eviter la formation de bulles lors du mélange. Remarque : Cette étape est essentielle et doit être effectuée avec beaucoup d’attention étant donné que les cellules sont dans des conditions hostiles en raison de la peptide de pH faible (environ 3,5 à 4,0).</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, soigneusement charger 80 µL de la suspension dans chaque insertion.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de milieu de culture au fond du puits de mouiller l’insert membrane, permettant aux médias diffusion promouvoir le peptide auto-assemblage et formation d’hydrogel. Laissez le peptide de gel pendant environ 20 min dans le cabinet de flux. Remarque : La manipulation des échantillons pendant le réglage heure pourrait se terminer par la rupture de gel.</li>
	<li>Très lentement, ajouter 40 µL de milieu à l’insert et laissez-le glisser vers le bas de la paroi interne au gel. Remarque : Normalement, le chargement de ce volume devrait prendre entre 20 et 30 s.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée) pendant 20 min. Cette étape et les additions moyennes successives favorisera le lessivage de la saccharose et équilibrage des cellules avec le milieu de culture.</li>
	<li>Ajouter 60 µL de milieu à la paroi interne de l’insert, ce qui lui permet de couler le long du mur. Aspirer le milieu du puits, qui est riche en saccharose, et ajouter 0,5 mL de milieu frais.</li>
	<li>Ajouter 60 µL de milieu lentement à l’insert et placer la plaque dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée) pendant 10 min.</li>
	<li>Aspirer le milieu du puits et ajouter 2,5 mL de milieu frais dans le puits. Ajouter 200 µL de milieu dans l’insert. Placer la plaque dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée) pour maintenir les cellules dans les conditions appropriées.</li>
	<li>Changer le support de tous les jours. Enlever le milieu ancien du fond du puits. Ajouter 2,5 mL de milieu frais pour le bien et 200 µL de l’insert. NOTE : Si la différenciation des cellules se poursuit, les médias inducteurs spécifiques seront ajoutés aux cultures, ce qui entraîne l’engagement de type cellule désirée (voir ci-dessous, la différenciation de cellules).</li>
</ol>4. cellule viabilité dans 3D-SÈVES
<ol> <li>Remarque : L’analyse de viabilité de cellules est connu comme le Live/Dead — viabilité/cytotoxicité ainsi.</li>
	<li>Dans un tube de 15 mL, préparer le volume nécessaire de solution fraîche de calcéine µM 2 AM et 2 µM d’éthidium homodimère-1 (EthD-1) dans du PBS au vortex pour 10 s. conserver dans l’obscurité. Remarque : Le volume à utiliser pour chaque échantillon dépendra de la taille bien selon ce qui suit : 2 mL pour chaque puits d’une plaque multiwell-6 ; 1 mL pour chaque bien d’une plaque de 12-multiwell et 0,5 mL pour chaque puits d’une plaque multiwell-24.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, rincez les échantillons 3D-SAPS 3 fois avec 2 mL de PBS et ensuite, couvrez-la avec la solution préparée à l’étape 4.1. Incuber à ta pendant 40 min dans le noir.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, rincer les constructions avec 2 mL de PBS 5 fois.</li>
	<li>Visualiser les échantillons sous un microscope à fluorescence à l’aide de 10 X ou 20 X grossissement.</li>
</ol>5. la différenciation cellulaire
<ol><li>Cellules en culture (37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée) en chondrocytes basale moyenne (CBM) avec une croissance complète. Remarque : La préparation du support est décrit dans les instructions du fabricant (voir Table des matières).</li>
	<li>Induire la différenciation de la cellule au jour 2 avec chondrogéniques moyen humain recombinant contenant transformant le facteur de croissance-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), l’acide L-ascorbique 2-phosphate [AA2P] (25 µg/mL) et de la dexaméthasone (100 nM).</li>
	<li>Maintenir la culture pendant 4 semaines dans un incubateur avec une atmosphère humidifiée à 37 ° C et 5 % de CO2. Changer chondrogéniques moyenne tous les deux jours.</li>
</ol>6. toluidine bleu coloration (TB)
<ol><li>Lavez les cultures 3D-SAPS deux fois en ajoutant et en supprimant puis 2 mL de PBS avec une micropipette. Fixez-les en ajoutant 2 mL de 2 % (p/v) p-formaldéhyde dans du PBS pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver deux fois avec 2 mL de 0,1 % de Triton X-100 dans PBS (PBST).</li>
	<li>Incubez avec 2 mL de TB de 0,05 % dans l’eau pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver plusieurs fois (au moins 3 fois) avec 2 mL de PBS jusqu'à ce que la solution de PBS supprimée est claire.</li>
	<li>Analyser des échantillons par inspection visuelle sous un microscope stéréoscopique11,13,14. NOTE : TB forme des complexes avec des glycoconjugués anioniques à la matrice extracellulaire, tels que des protéoglycanes (PG) et de glycosaminoglycanes (GAG), qui sont principalement sécrétée par les cellules chondrocytes. Les échantillons positifs sont colorés en bleus.</li>
</ol>7. Western Blot
Remarque : La procédure utilisée dans le présent protocole a été précédemment décrit dans référence11.
<ol><li>Lyse 3D-constructions dans RIPA tampon contenant inhibiteur de protéase cocktail de pipetage.</li>
	<li>Préparer l’acrylamide gel selon les exigences de gel-volume (de l’équipement en cours d’exécution de gel spécifique) et exécutez les lysats cellulaires pendant 90 min à 150 V16. Remarque : Le gel d’Acrylamide est habituellement préparé à une concentration de 7,5 à 10 % (p/v), en fonction du poids moléculaire de la protéine.</li>
	<li>Transférer les protéines contenues dans le gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) par application de 40 V pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane PVDF à ta pendant 2 h dans un tampon bloquant (4 % (p/v) de lait en poudre dans du PBST) dans un récipient séparé avec un volume suffisant pour couvrir la membrane.</li>
	<li>Incuber la membrane RT pendant 1 h avec des anticorps primaires à une concentration finale de 1 mg/mL dans du PBST. Voir Table des matières.</li>
	<li>Ajouter des anticorps secondaires à une concentration de 1 mg/mL. Consultez la Table des matières.</li>
	<li>Préparer la membrane pour la détection de hP avec un substrat chimioluminescent16. Voir Table des matières.</li>
	<li>Prendre des images par chimiluminescence16.</li>
</ol>

<ol><li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069283">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Can we build artificial stem cell compartments?</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li>
<li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization%3A+implications+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li>
<li>Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li>
<li>Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li>
<li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li>
<li>Hernández Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li>
<li>Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li>
<li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile%2C+soft%2C+self-assembling%2C+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+%28%CE%B5-Caprolactone%29%2FSelf-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472(2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603(2016).</li>
<li>Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+blotting+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Auparavant, notre groupe et autres ont décrit l’utilisation de plates-formes en trois dimensions (3D) culture avec cellule divers systèmes3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Dans le présent travail, nous décrivons une méthode simple et fiable d’obtenir culture 3D systèmes qui s’appliquent à n’importe quel type de cellules de mammifères y compris n’importe quel type de cellule fonctionnelle, adulte ou embryonnaire de cellules souches, ou par la suite, les cellules dysfonctionnelles isolement de des biopsies ou des tumeurs et ainsi de suite. En outre, de manière indépendante, si les cellules souches sont d’origine embryonnaire ou adulte ils auraient une meilleure capacité d’engagement de lignée dans l’environnement 3D que dans la culture classique 2D plats10,11,12, 13,14,15. Par conséquent, la culture de cellules dans ce système conduirait à différenciation dans des structures ressemblant à des tissus fonctionnels pouvant servir dans des applications différentes, de biomédecine réparatrice ou régénératrice aux plates-formes toxicologiques et pharmacologiques.
Nous avons montré un gain évident en fonction de la cellule, car le microenvironnement cellulaire est semblable à celle des tissus naturels en ce qui concerne la structure de la matrice et les paramètres biomécaniques, biophysiques et biologiques. Néanmoins, que le système devient plus complex, le nombre de paramètres qui doivent être réglementés également des augmentations, qui comprend la nécessité d’une plate-forme de support externe (par exemple, un système de perfusion active pour éviter les problèmes associés aux phénomènes de transfert de masse ). En trois dimensions des cellules plus performants en termes de régulation des activités essentielles, telles que la différenciation, la prolifération et la migration. Ils pourraient constituer des réseaux complexes permettant la diaphonie cellulaire accrue, qui est de loin une conséquence essentielle de la croissance et la différenciation en 3D. Le fait que les sucs pourrait créer des conditions in vitro semblable à ces matrice extracellulaire protéines représente un avantage depuis une étude rationnelle de l’effet produit pour chaque composant ajouté à l’échafaud (facteur de croissance, polysaccharide ou signalisation peptide) pourrait facilement être menée.
Les avantages évidents de l’utilisation des programmes d’ajustement structurel par rapport aux autres échafaudages naturels, tels que le collagène de type I et Matrigel, sont les suivants : 1) programmes d’ajustement structurel est un biomatériau synthétique avec une variation minimale du lot de production par lots ; 2) programmes d’ajustement structurel a la capacité d’être fonctionnalisés avec des motifs de peptide spécifique ; et 3) présente des programmes d’ajustement structurel faible biodégradabilité in vitro, qui permet le maintien de la construction 3D avec les mêmes propriétés biophysiques, biomécaniques et structurelles au fil du temps. Toutefois, la limitation de l’utilisation de sucs par rapport aux autres échafaudages se trouve durant l’étape de l’encapsulation, où les cellules sont dans un milieu hostile en raison de la faible pH. C’est donc une étape cruciale dans la méthodologie décrite. En outre, il est important de définir la concentration des programmes d’ajustement structurel pour chaque type de cellule spécifique avant de commencer toute expérience. En fait, c’est essentiel lorsque les cellules sont cultivées sur ou dans ces biomatériaux, étant donné que chaque type de cellule en particulier présentera les conditions optimales de croissance biomécaniques.
Enfin, nous pensons que la conception et la fabrication de ce type d’échafaudage de biomatériau renforcerait l’élaboration de modèles de tissu 3D plus physiologique et plus fiable pour aider l’industrie pharmaceutique pour développer de meilleures approches thérapeutiques pour la médecine régénérative, cancer ou tout traitement médical.

Pendant de nombreuses décennies, la culture de cellules de mammifères a été effectuée dans des conditions expérimentales utilisant des systèmes de la culture classique à deux dimensions (2D) en raison de problèmes pratiques et économiques, quels que soient les aspects non physiologiques. Même si ce système de culture permet d’étudier et de comprendre plus les mécanismes moléculaires et cellulaires, nous savons aujourd'hui que les nouveaux paradigmes de la culture de cellules sont nécessaires pour étudier les systèmes cellulaires plus complexes. Par conséquent, systèmes tridimensionnels (3D) sont nécessaires pour recréer un micro-environnement biophysiques, biomécanique et biologiquement plus semblable à celui des tissus naturels. Ces dernières années, les systèmes de culture 3D, en général, sont devenus plus répandues parmi les chercheurs et l’industrie parce qu’elles représentent un nouveau modèle d’étude ou de dépistage dans les cellules peuvent se développer dans l’espace, créer cellule-cellule ou interactions cellule-à-matrice, migrer et finalement la différence en lignées cellulaires spécifiques.
L’objectif global de cette méthodologie consiste à recréer un in vitro microenvironnement cellulaire qui s’en écarte le microenvironnement in vivo . En particulier, l’échafaud de peptide de l’auto-assemblage synthétique (SAPS) est un type de biomatériau ayant des propriétés uniques ; il forme un réseau des pores de taille nanométrique fabriqués à partir des interactions faibles entre les peptides aux propriétés mécaniques et structurales semblables celles des matrices extracellulaires naturelles. En d’autres termes, la rationalité derrière l’utilisation de ce matériau est qu’il crée un environnement 3D vraiment qui est idéal pour l’obtention de tissus de pseudo-3D ou des unités de l’orgue. Mais, surtout, le contexte 3D permet la structure 3D d’acquérir de nouvelles fonctions biologiques qui ne sont normalement pas présentes dans les plates-formes 2D de la culture, telles que les propriétés associées à l’architecture des tissus, des phénomènes de transfert de masse, structuration de cellules et, éventuellement, morphogenèse de tissus, qui sont des facteurs clés dans la recherche future et le développement des tissus fonctionnels et des organes1,2. En outre, un avantage des programmes d’ajustement structurel sur leurs homologues naturels (collagène, Matrigel) est qu’ils sont très stables à la température ambiante et ne nécessitent pas de conditions spéciales pour la post production, de distribution ou de stockage3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. programmes d’ajustement structurel est facile à manipuler, quand on le souhaite ; Gels 3D peuvent être obtenus simplement en augmentant la force ionique ou en ajustant le pH de neutralité1,2. Enfin, la méthode décrite ici a été largement utilisé in vitro pour promouvoir l’entretien, la croissance et la différenciation d’un certain nombre de types de cellules, y compris les chondrocytes, hépatocytes, cellules endothéliales, ostéoblastes, les cellules neuronales ainsi comme les cellules souches embryonnaires et somatiques3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. dans le présent travail, nous décrivons l’utilisation d’un système 3D-culture se différencier humains élargi des chondrocytes articulaires (hACh) en tissu cartilagineux comme décrit précédemment11.
Ici, on décrit une méthode de cellules en culture dans un système 3D à l’aide de programmes d’ajustement structurel. Dans ce biomatériau synthétique, les cellules sont mélangés au préalable avec une solution de peptide, qui est induite par la suite à s’auto-assembler, créant un réseau de dimensions nanométriques autour des cellules et créant ainsi un environnement véritablement 3D (Figure 1). Il est important de considérer que le comportement cellulaire est affectée par des valeurs de rigidité de matrice (c.-à-d., prolifération, migration et différenciation). Par conséquent, un contrôle méthodologique commun est aux cellules de culture sur le dessus de l’échafaud de peptide avec les mêmes valeurs de rigidité (culture sur deux dimensions).

<table><tbody><tr><td>Chondrocytes articulaires humains (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>Solution peptidique RAD16-I (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (qualité culture tissulaire)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire (0.4 &micro ; pore, 12 mm de diamètre)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Milieu Basal (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots de suppléments de croissance</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité vivant/mort</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance transformant humain-&beta ; 1 (TGF-&beta ; 1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampon</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF)</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescent</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actine</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagène I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagène II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagène X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chèvre IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-lapin IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culture de cellules mammifères dans les échafaudages de peptide en trois dimensions

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

On décrit une technique utile pour la culture des cellules dans un échafaudage d’auto-assemblage nanofibres en trois dimensions (3D). Ce système de culture recrée un environnement qui imite étroitement les caractéristiques structurales des tissus non polarisé. En outre, la structure particulière de nanofibres intrinsèque de l’échafaudage rend transparent à la lumière visuelle, qui permet de faciliter la visualisation de l’échantillon en microscopie. Cet avantage a été utilisé pour étudier la migration cellulaire, organisation, prolifération et différenciation et ainsi toute évolution de leur fonction cellulaire par coloration avec des colorants spécifiques ou des sondes. En outre, dans ce travail, nous décrivons la bonne performance de ce système pour étudier facilement la redifférenciation des chondrocytes articulaires humains élargis dans le tissu cartilagineux. Cellules ont été encapsulés dans auto-assemblage peptide échafaudages et cultivées dans des conditions spécifiques pour promouvoir chondrogenèse. Cultures en trois dimensions a montré la bonne viabilité pendant les quatre semaines de l’expérience. Comme prévu, les échantillons cultivés avec des inducteurs de chondrogéniques (par rapport aux témoins non induite) teint fortement positifs pour le bleu de toluidine (dont les taches glycosaminoglycanes (GAG) qui sont très présents dans la matrice extracellulaire du cartilage) et a exprimé des marqueurs moléculaires spécifiques, y compris le collagène de type I, II et X, selon analyse Western Blot. Ce protocole est facile à réaliser et peut être utilisé dans les laboratoires de recherche, industries et dans les cours de laboratoire à des fins éducatives.

Dans ce travail, un protocole simple et plus rapide aux cellules de culture en 3D à l’aide de programmes d’ajustement structurel est décrite pour obtenir des données qualitatives et quantitatives fiables. Programmes d’ajustement structurel crée un micro-environnement 3D ayant des propriétés uniques qui permettent à des cellules cultivées dans des conditions souhaitées pour procéder à l’entretien des cellules, prolifération et/ou différenciation3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. dans notre groupe, plusieurs études ont été effectuées en utilisant des tissus adipeux humains provenant des cellules progénitrices (hAPC), élargi les chondrocytes articulaires humains (hACh) et fibroblastes dermiques humains normaux (hNDF) à la culture, développez et différencier en tissu cartilagineux10,11,12. Nous décrivons ici la culture 3D et la re-différenciation des hACh élargi en tissu cartilagineux, comme décrit précédemment11. Par conséquent, nous encapsuler des cellules en 3D-programmes d’ajustement structurel et leur culture dans un milieu d’induction chondrogéniques, tel que décrit à la Figure 1 (et dans le protocole). Après 24h, les échantillons ont été évalués pour la viabilité avec le test de viabilité/cytotoxicité Live/Dead. Les résultats indiquent qu’un faible pourcentage de cellules était mort (rouge) après 5 jours d’encapsulation et presque pas les cellules mortes ont été observés après 4 semaines de culture (Figure 2). Ensuite, nous les colorés pour des dépôts de glycosaminoglycanes (GAG) à la matrice extracellulaire à l’aide de la méthode de coloration bleu de Toluidine. Comme prévu, le groupe d’induction répond bien au traitement, présentant une forte coloration (Figure 2).
Enfin, les marqueurs moléculaires des marqueurs chondrogenèse et hypertrophie, y compris le collagène de type I, II et X, ont été analysés par western blot (Figure 3). Le collagène de type qu'i (COL1) ai observé dans les systèmes 2D et 3D mais une bande inférieure de ~ 130 kDa (représentant les protéines transformées de COL1 mature pour être assemblés à la matrice extracellulaire) a été observé uniquement en 3D. Ce résultat indique clairement que les cellules subissant la différenciation en trois dimensions passe d’une manière plus physiologique. Fait remarquable, le collagène de type II (COL2) a été détecté - comme une seule bande d’attendus poids moléculaire présent à la matrice extracellulaire - seulement dans les constructions 3D cultivées dans des conditions chondrogéniques. Enfin, le collagène de type X (COL10) a été détectée dans les constructions de 2D et 3D, cultivées dans des conditions de chondrogéniques, ce qui indique une certaine hypertrophie après 4 semaines de culture.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figure 1 : représentation schématique de l’encapsulation de la cellule en 3D-SAPS. Représentation schématique de l’encapsulation de hACh est décrite afin d’obtenir des cellules dispersées au hasard dans les 3D-programmes d’ajustement structurel. 1. auto-assemblage préparation de peptide d’échafaudage (SAPS) ; 2. cellule de préparation de la solution ; et 3. 3D-cell encapsulation dans les programmes d’ajustement structurel. Notez que le schéma ne montre que des mesures 3.1 à 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figure 2 : cellule performance et chondrogéniques la différenciation dans les cultures de 3D-SAPS. La coloration de la viabilité de cellules effectué à 5 jours et 4 semaines de culture détecté sous un microscope à fluorescence (cellules vivantes dans les cellules vertes et mortes en rouge). Barreaux de l’échelle = 200 µm. engagement général chondrogenèse évalué par le bleu de Toluidine coloration (sulfatées glycosaminoglycanes en bleu) de constructions 3D-SAPS cultivées dans les médias de contrôle et chondrogéniques. Barreaux de l’échelle = 500 µm. Ce chiffre a été modifié par L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figure 3 : collagène I, II et X l’expression de hACh subissant chondrogenèse. hACh, cultivée dans une monocouche-2D et 3D-SAPS après 4 semaines de chondrogéniques médias et contrôles ont été évalués pour l’expression du collagène de type I (COL1), collagène de type II (COL2) et du collagène de type X (COL10). Actine expression a été utilisée comme témoin interne. Ce chiffre a été modifié par L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, telles que le comportement des cellules dans un microenvironnement 3D, l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice, comment elles prolifèrent, migrent, se différencient et forment des tissus fonctionnels. Cette technique est avantageuse, car elle crée un microenvironnement cellulaire plus proche des conditions physiologiques. La démonstration de la procédure sera assurée par Nausika Betriu, une étudiante diplômée de mon laboratoire.Les implications de la méthode s’étendent au traitement des tissus lésés, car elle peut être utilisée pour obtenir des équivalents tissulaires pour la médecine réparatrice ou régénérative. La méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les modèles tumoraux, le diabète ou les maladies neurodégénératives. Pour commencer, préparez 500 microlitres d’une solution à 0,5 % de peptide RAD16-I dans du saccharose à 20 % en poids par volume dans un tube de microcentrifugation.Sonicer la solution dans un bain à ultrasons à puissance maximale pendant 20 minutes. Ensuite, diluez 300 microlitres de la solution peptidique préparée précédemment avec 200 microlitres de 10 % de saccharose pour obtenir 500 microlitres de solution à 0,3 % de peptide RAD16-I. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation contenant la solution peptidique dans un bain à ultrasons à température ambiante pendant 20 minutes.Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire préalablement préparée. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à la conduite de vide, prélever le surnageant. Ajoutez deux millilitres de 10 % de saccharose à la pastille cellulaire.Ensuite, utilisez un compteur de cellules manuel pour compter les cellules. Après avoir remis les cellules en suspension, centrifugez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire dans le volume nécessaire de 10 % de saccharose pour obtenir la concentration souhaitée de quatre millions de cellules par millilitre.Ensuite, sonisez la solution peptidique préalablement préparée dans le bain à ultrasons à puissance maximale pendant cinq minutes à température ambiante. Placez un insert de culture tissulaire dans chaque puits d’une plaque à six puits. Ensuite, mélangez 120 microlitres de solution RAD16-I avec un volume égal de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation.Mélangez lentement, en évitant la formation de bulles, en pipetant de haut en bas. Un facteur important à prendre en considération est le mélange des cellules avec une solution peptidique. Il est crucial d’être doux pendant le mélange, lentement, pour éviter la formation de bulles, en pipetant de haut en bas.Ensuite, à l’aide d’une micropipette, chargez 80 microlitres du mélange RAD16-I et de suspension cellulaire dans chaque insert. Le chargement de 80 microlitres du RAD16-I et du mélange de suspension cellulaire dans chaque insert doit être effectué rapidement. Ajouter 500 microlitres de média au fond de chaque puits pour mouiller la membrane d’insertion.Laissez le peptide se gélifier pendant 20 minutes dans l’armoire à flux laminaire. L’ajout de 500 microlitres de milieu au fond de chaque puits pour mouiller la membrane d’insertion favorisera la formation de gel et l’équilibre de la culture 3D avec le milieu. Après 20 minutes, ajoutez très lentement 40 microlitres de fluide à l’insert et laissez-le glisser le long de la paroi interne jusqu’au gel.Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, ajoutez 60 microlitres de fluide à la paroi intérieure de l’insert et laissez-le s’écouler le long de la paroi. Ensuite, aspirez le milieu riche en saccharose hors du puits et ajoutez 500 microlitres de milieu frais.Ensuite, ajoutez 60 microlitres de fluide dans l’insert. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le fluide hors du puits.Ajoutez 2,5 millilitres de milieu frais dans le puits et 200 microlitres de milieu dans l’insert. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pour effectuer le test de viabilité cellulaire, préparez une solution de deux micromolaires de calcéine AM et de deux micromolaires d’éthidium homodimère-1 dans du PBS dans un tube de 15 millilitres.Agitez pendant 10 secondes et couvrez le tube d’une feuille d’aluminium. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, rincez trois fois les échantillons 3D-SAPS avec deux millilitres de PBS. Ajouter la solution d’homodimère de calcéine/éthidium sur les échantillons.Ensuite, couvrez les échantillons de papier d’aluminium et incubez à température ambiante pendant 40 minutes. Une fois l’incubation terminée, rincez les constructions avec deux millilitres de PBS cinq fois. Enfin, visualisez les échantillons au microscope fluorescent en utilisant un grossissement de 20X.Dans ce protocole, une méthode simple et rapide pour cultiver des cellules en 3D à l’aide de SAPS est décrite. Le test de viabilité cellulaire après la formation d’une construction 3D décrit peu de cellules mortes, comme l’illustrent les cellules colorées en rouge après cinq jours d’encapsulation. Après quatre semaines de culture, presque aucune cellule morte n’est observée.Les marqueurs moléculaires de la chondrogenèse et de l’hypertrophie sont analysés par western blot. La bande de collagène de type un est observée dans les systèmes 2D et 3D. Cependant, la bande inférieure représentant la protéine de collagène mature traitée n’est observée que dans le système 3D, indiquant que la différenciation se déroule de manière plus physiologique.De plus, le collagène de type deux n’est détecté que dans les constructions 3D. Le collagène de type 10 est détecté dans les constructions 2D et 3D, ce qui indique un certain degré d’hypertrophie après quatre semaines de culture. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’encapsulation cellulaire tridimensionnelle de collagène de type un peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le comportement cellulaire dans un échafaudage naturel dégradable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir votre culture tridimensionnelle du type de cellule souhaité. N’oubliez pas que travailler avec des cellules cancéreuses humaines peut être dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation d’installations de biosécurité de classe deux et la connaissance du travail dans des conditions stériles, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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