Isolement et caractérisation de cardiaques cellules stromales mésenchymateuses d’endomyocardique Bioptic échantillons de Patients de la cardiomyopathie arythmogène

Les objectifs généraux de ce protocole sont d’isoler les cellules stromales mésenchymateuses cardiaques de patients atteints de cardiomyopathie arythmogène, de tester leur aptitude à la différenciation adipogénique et de phénotyper leurs marqueurs de surface. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cardiomyopathie arythmogène, telles que l’implication des cellules stromales cardiaques dans l’adipo-substitution et souligner les mécanismes moléculaires. Le principal avantage de cette technique est que l’isolement des cellules de stomie a pu être effectué avec peu de passages simples à partir de très petits échantillons cardiaques.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’étude de la cardiomyopathie arythmogène. Elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’étude des maladies cardiovasculaires pour lesquelles une biopsie endomyocardique est indiquée. Nous avons d’abord étudié l’idée de cette méthode lorsque nous avons compris que nous pouvions réduire la procédure d’isolement des cellules de stomie pour l’appliquer aux biopsies cardiaques et à l’électrophysiologie qu’elle pouvait nous fournir.

Pour ce protocole, prélever une biopsie endomyocardique du ventricule droit d’un patient atteint d’ACM à l’aide d’une cartographie électroanatomique intégrée et d’une fluoroscopie cardiaque. Prenez environ cinq grammes de tissu et envoyez-le au laboratoire dans un milieu TMES. Au laboratoire, mettre en place l’enceinte de sécurité biologique au besoin pour mener à bien la procédure jusqu’à la digestion ensomatique.

Transférez ensuite la biopsie dans une assiette et lavez-la deux fois avec du PBS. À ce stade, la biopsie peut être photodocumentée au microscope. Ensuite, transférez la biopsie dans un tube de deux millilitres contenant un millilitre de solution de collagénase.

Coupez l’échantillon en petits fragments d’une largeur comprise entre 0,5 et un millimètre. Ensuite, incubez le tissu pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius avec une agitation rotative continue. Ensuite, centrifugez la solution digérée, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS.

Ensuite, centrifugez à nouveau le tube, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de TMES. Maintenant, plaquez la suspension sur une plaque de 60 millimètres et remplissez la plaque jusqu’à trois millilitres à l’aide de TMES, mais pas plus. Ensuite, cultivez et élargissez les cellules selon le protocole de texte.

Avant de commencer, préparez-vous à l’emploi le réactif de dissociation cellulaire, le tampon de lavage et les anticorps requis. Lorsque le nombre estimé de cellules de la culture atteint trois millions, lavez deux fois la plaque de 100 millimètres avec 10 millilitres de PBS stérile. Ensuite, ajoutez cinq millilitres d’un réactif de dissociation cellulaire aux cellules et incubez la plaque pendant sept à 10 minutes à température ambiante pour détacher les cellules.

Une fois les cellules détachées, ajoutez 15 millilitres de PBS dans les cellules et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres. Maintenant, centrifugez les cellules et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lavage. Comptez ensuite les cellules et transférez-en trois millions dans un nouveau tube dans un volume final de 1,5 millilitre de tampon de lavage.

Ensuite, divisez la suspension en 12 tubes de fax. Dans chaque tube, ajoutez les anticorps utilisés pour caractériser les CMSC aux concentrations recommandées. Assurez-vous d’inclure les commandes d’isotype.

Une fois préparés, incubez les tubes pendant 15 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Plus tard, ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans chaque tube pour arrêter les réactions. Ensuite, centrifugez les cellules, retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 250 microlitres de tampon de lavage.

Procédez maintenant à la caractérisation des cellules à l’aide de la cytométrie en flux. Après la différenciation adipogénique des cellules, utilisez la coloration ORO pour tester l’accumulation de lipides. Avant de commencer, assurez-vous d’avoir la solution fonctionnelle ORO.

Avant de colorer les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS. Ensuite, couvrez les cellules de paraformaldéhyde à 4 % et laissez-les fixer pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le paraformaldéhyde et lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS.

Après le deuxième lavage, ajoutez suffisamment de solution de travail ORO pour couvrir les cellules. Incuber ensuite la plaque pendant une heure à température ambiante. Cette incubation doit être réalisée dans un environnement où l’autosolution ne fonctionnera pas, il n’est donc pas recommandé de remplir les salles.

Après l’incubation, aspirez la solution ORO et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS plusieurs fois jusqu’à ce que la coloration ne soit plus visible dans le lavage PBS et jusqu’à ce que, lorsqu’elle est observée au microscope, aucune coloration non spécifique ne soit détectée. Maintenant, à l’aide d’un microscope à contraste de phase de culture tissulaire inversée, capturez 20 images de chaque puits à un grossissement de 20x. Les détails sont fournis dans le protocole texte.

Les CMSC ont été isolés à partir de biopsies endomyocardiques comme décrit. Pour confirmer leur lignée mésenchymateuse, des cellules ont été incubées avec des anticorps conjugués florofour appropriés et analysées par cytométrie en flux. Les CMSC étaient positifs pour les antigènes mésenchymateux de surface spécifiques CD29, CD44 et CD105.

La fraction de cellules CD90 positives est connue pour être variable. Les marqueurs du patrimoine endothélial, du patrimoine monocytaire ou macrophage, du patrimoine onomatopéique, et du complexe majeur d’histocompatibilité n’ont pas été exprimés. Ensuite, les CMSC ont été cultivés dans un milieu T.ADIPO pour la différenciation adipogénique et colorés avec ORO pour rechercher des gouttelettes lipidiques intracellulaires.

Les CMSC de patients atteints de cardiomyopathie arythmogène ont accumulé plus de gouttelettes lipidiques que de cellules de témoins sains. Ces différences ont été mesurées dans des conditions de différenciation à 72 heures et à sept jours. Une fois maîtrisée, la résolution cellulaire peut être effectuée en trois heures, la coloration peut être effectuée en deux heures et l’analyse par fax peut être terminée en trois heures.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que des tests de dépistage de drogues pourraient être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que pouvons-nous utiliser des cellules de stomie des mêmes patients répondant à différents stimuli. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cardiomyopathie arythmogène pour explorer l’implication des cellules du stroma cardiaque humain dans la pathogenèse de la maladie.