Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement génétique et neurologique, comme pendant le développement postnatal. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique simple avec un appareil fait maison. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la réalisation d’injections ciblées dans le cerveau nécessite une attention totale aux détails.

Pour commencer, faites un support pour utiliser les chiots nouveau-nés dans un appareil stéréotaxique. Préparez d’abord le plateau de tête. Coupez environ 1/5 du fond d’un tube à centrifuger de 1,5 millilitre pour faire une ouverture pour la tête d’un chiot nouveau-né.

Ensuite, sélectionnez une boîte d’embout de pipette vide qui s’adapte au piédestal de l’appareil stéréotaxique. Utilisez ensuite de la colle chaude pour fixer le plateau de tête à la base de la boîte à pointes. Ensuite, collez une cassette d’enrobage de tissu sur la boîte où elle peut soutenir le torse du chiot pendant que sa tête est fixée.

Préparez maintenant des aiguilles en acier inoxydable de calibre 30 pour l’injection. Tout d’abord, pré-nettoyez-les en les trempant dans du chloroforme pendant trois jours dans un flacon en verre. Trois jours plus tard, retirez soigneusement les aiguilles et lavez-les avec de l’éthanol absolu pendant 20 minutes et avec 50 tr/min d’agitation.

Ensuite, lavez-les trois fois dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes par lavage, également avec agitation. Après les lavages, laissez les aiguilles sécher à l’air libre et rangez-les dans une boîte propre à température ambiante jusqu’à utilisation. Pour l’assemblage de microinjection, utilisez un segment de cinq centimètres de tube en polyéthylène PE20 pour relier le tube PE10 à une seringue de calibre 26 de 10 microlitres.

Fixez la jonction avec du cyanoacrylate. Ensuite, montez la nouvelle aiguille d’injection de calibre 30 sur l’autre extrémité du tube PE10. Chargez maintenant la seringue de micro-injection de 10 microlitres.

Retirez le piston et utilisez une autre seringue de calibre 25 pour charger l’ensemble avec de l’eau distillée autoclavée afin d’évacuer l’air du tube. Remettez ensuite le piston dans la seringue d’un microlitre et poussez le piston jusqu’à ce qu’il ne reste plus que deux microlitres d’eau distillée dans le fût et pas moins. Ensuite, montez avec précaution la seringue d’un microlitre sur le pousse-seringue à microflux.

Ensuite, pipetez de petites quantités de colorant vert rapide filtré à 0,1 % dans les liquides viraux expérimentaux sur un morceau de parafilm. Aspirez maintenant une petite quantité d’air dans la seringue jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit visible entre l’aiguille d’injection et la tubulure. Chargez ensuite 0,7 microlitre de solution Fast Green filtrée pour tester l’écoulement des fluides dans le tube de micro-injection.

Si le débit est bon, aspirez un autre petit volume d’air pour faire une deuxième bulle d’air et suivez en chargeant la solution d’injection dans le tube de micro-injection. Fixez et fixez l’aiguille de micro-injection à l’appareil stéréotaxique et procédez à la micro-injection des souris néonatales. En préparation de l’opération, essuyez soigneusement l’instrument stéréotaxique avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, anesthésie un nouveau-né par hypothermie. Placez le chiot dans un gant en latex et plongez-le dans de la glace pilée jusqu’au cou pendant cinq minutes. Pincez ensuite les pattes du chiot avec une pince pour vous assurer qu’il n’y a pas de réflexe de pédale.

Ensuite, placez le chiot avec le gant dans le plateau de tête et mettez de la glace pilée autour du manchon en latex pour maintenir l’anesthésie d’hypothermie. Ensuite, frottez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70 % et localisez le point de repère lambda. Marquez-le avec un marqueur.

Ensuite, dirigez la pointe de l’aiguille vers le lambda et réglez les coordonnées antérieure/postérieure et médiale/latérale à zéro. Ensuite, en consultant un atlas cérébral, déplacez le bras d’injection vers le site cible. Par exemple, le striatum des petits P2 est de 2,4 millimètres en avant du lambda, de 1,0 millimètre de chaque côté de la ligne médiane et de 1,7 millimètre ventral.

Ensuite, marquez la position du colorant Fast Green sur le tube PE10 à l’aide d’un stylo. Ensuite, commencez lentement à pénétrer l’aiguille à travers la peau et le crâne jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille entre en contact avec la surface du crâne. Définissez la coordonnée dorsale/ventrale sur zéro.

Abaissez ensuite lentement l’aiguille jusqu’au site cible. Une fois en position, attendez une minute pour permettre au parenchyme de reprendre sa forme normale. Exécutez ensuite le programme de micro-injection à 100 nanolitres par minute.

Pendant l’injection, observez le colorant Fast Green se déplacer dans le tube en PE. Il est essentiel de pénétrer lentement l’aiguille à travers la peau et le crâne jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille entre en contact avec la surface du crâne. Pendant l’injection, il est impératif de surveiller le colorant Fast Green se déplacer dans le tube PE.

Une fois l’injection terminée, attendez une minute, puis remontez lentement l’aiguille jusqu’à 1/2 de la profondeur DV pénétrée. Attendez ensuite encore 30 secondes avant de procéder au retrait lent de l’aiguille de la tête du chiot. Une fois l’injection terminée, il est important d’attendre une minute avant de remonter lentement l’aiguille à 1/2 de la profondeur de la DV pénétrée.

Attendez ensuite encore 30 secondes avant de retirer lentement l’aiguille de la tête du chiot. Une fois que tous les sites ciblés ont été injectés, réchauffez le chiot pendant 20 minutes dans un incubateur à 33 degrés Celsius. Vérifiez le chiot toutes les cinq minutes jusqu’à ce qu’il ait retrouvé sa position couchée sternale.

Ensuite, renvoyez le petit à sa mère. 200 nanolitres de virus exprimant la recombinase de l’ADN Cre fusionnée avec la GFP ont été injectés dans le striatum P2 de souris Ai14. Ces souris ont exprimé le gène rapporteur tdTomato lors de la délétion médiée par Cre d’une cassette d’arrêt flanquée de loxP.

Les cerveaux ont été récoltés à P14 pour l’immunomarquage de la GFP et de la tomate. De nombreuses cellules positives à la GFP transduites par l’AAV étaient présentes dans tout le striatum, indiquant une infection étendue des cellules striatales par les virus AAV EGFP Cre. Une expression extensive similaire de tdTomato a également été observée dans le striatum.

Lors d’un examen microscopique à fort grossissement, il est clair que toutes les cellules striatales positives à la GFP co-expriment le gène rapporteur tdTomato. De plus, les signaux tdTomato ont été détectés dans les terminaisons axonales du globus pallidus, dans la substantia nigra pars reticulata, les régions cibles des neurones de projection striatonigral et striatopallidal. Ensemble, ces résultats suggèrent une recombinaison réussie de l’ADN médiée par Cre loxP induite par l’expression de l’activité Cre médiée par AAV dans les neurones striataux néonatals.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour une injection striatale bilatérale si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’une chirurgie cérébrale néonatale délicate qui nécessite de la patience et de la prudence. À partir de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’optogénétique et la chimiogénétique peuvent être effectuées afin d’analyser la maturation au cours du développement postnatal.