Lipides Index détermination par Fluorescence liquide de récupération dans le champignon pathogène Ustilago Maydis

L’objectif global de cette procédure est de déterminer l’indice de gouttelettes lipidiques de cellules cultivées dans différentes conditions nutritionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des gouttelettes lipidiques et des lipides, telles que la dynamique d’accumulation et les différentes conditions nutritionnelles. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs échantillons peuvent être lus simultanément, car elle peut être mise en œuvre dans la microplaque.

Avec le début de cette méthode, lorsque nous observons la réfraction des cellules d’Ustilago maydis cultivées sous une carence en azote, nous réalisons ensuite que cela pourrait signifier que ces instructeurs pourraient être des gouttelettes lipidiques. Nous avons donc contacté Monica Montero de l’Universidade Federale do Rio de Janeiro au Brésil, qui a mis en œuvre le test de récupération de la fluorescence liquide des gouttelettes lipidiques chez Saccharomyces cerevisiae, afin de commencer une collaboration visant à adapter la procédure pour Ustilago maydis. La première étape de ce protocole est la préparation des tampons et des solutions nécessaires.

Pour préparer une solution mère de BO-DP de 10 millimolaires, dissoudre 10 milligrammes de BO-DP 493-503 et 3,8 millilitres de sulfoxyde de diméthyle. Diviser en aliquotes de 100 microlitres. Ensuite, restez dans l’obscurité à moins 70 degrés Celsius.

Préparez une solution d’extinction BO-DP à cinq micromolaires pour la récupération de la fluorescence liquide, ou dosage LFR, en ajoutant un microlitre de BO-DP 493-503 de 10 millimolaires à deux millilitres de solution d’extinction de 500 millimolaires. Cultivez les cellules umeda pour cette étude en commençant une culture avec une densité optique initiale de 600 nanomètres de 05. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius et 180 tr/min pendant 24 heures.

À des moments choisis, prélevez une aliquote des cellules. Pendant les huit premières heures, prélevez cinq millilitres toutes les deux heures. Après huit heures de croissance, des aliquotes de deux millilitres suffisent.

Mesurer la densité optique à 600 nanomètres de chaque aliquote. Centrifugez la suspension cellulaire à 14 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Et, jetez le surnageant.

Suspendre la pastille cellulaire dans un millilitre de solution de fixation contenant 3,7 % de formaldéhyde dans du PBS. Incuber les cellules à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, centrifugez la suspension cellulaire à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant une minute.

Jetez le surnageant. Lavez la pastille cellulaire avec un millilitre d’eau distillée. Centrifugez la suspension cellulaire pendant une minute.

Jetez le surnageant et ajoutez un millilitre d’eau distillée pour un deuxième lavage. Centrifuger à nouveau. Retirez le surnageant du deuxième lavage.

À l’aide d’eau distillée, ajustez la densité optique de la pastille de cellules à 600 nanomètres à cinq, ce qui équivaut à 1,5 fois 10 puissance huit cellules par millilitre. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Commencez cette procédure en allumant le spectrophotomètre.

Ouvrez le logiciel SkanIt. Cliquez sur une nouvelle session. Dans l’arborescence de session, sélectionnez protocole, entrez les paramètres de la longueur d’onde de fluorescence et choisissez gain multijoueur photo automatique.

Pour la bande passante d’excitation, sélectionnez 12 nanomètres. Dans l’optique, sélectionnez le haut pour l’excitation de l’échantillon à partir du haut du puits. Entrez à 300 tr/min et bas pour une agitation douce et continue.

Sélectionnez Exécuter la plaque, faire une pause et, jusqu’à l’action de l’utilisateur, répéter le protocole cinq fois. Cliquez sur Enregistrer et, dans le champ Nom de la session, écrivez un nom pour la session. Le protocole est maintenant prêt pour l’analyse des échantillons.

Ajouter 200 microlitres de la solution de trempe BO-DP à 5 micromolaires dans chaque puits d’une plaque noire à fond transparent de 96 puits. Placez la plaque à l’intérieur de la chambre du spectrophotomètre et incubez à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. À partir de là, protégez la plaque de la lumière autant que possible.

Cliquez sur le bouton de démarrage et lisez la fluorescence et la densité optique à 600 nanomètres, correspondant aux blancs. Pendant le temps de pause, ajoutez cinq microlitres de suspension à cellules fixes de formaldéhyde dans les puits et mélangez soigneusement les échantillons à l’aide d’une pipette. Remettez la plaque à l’intérieur du spectrophotomètre et cliquez sur Continuer.

Répétez trois ajouts successifs de cinq microlitres de suspension cellulaire. Mélangez à l’aide d’une pipette pour vous assurer que les cellules ne précipitent pas avant de poursuivre la lecture. Dans cette démonstration, le logiciel Excel est utilisé pour calculer et tracer un graphique de la fluorescence et de l’absorbance en fonction du volume de chaque addition successive pour chaque échantillon dans la microplaque.

Entrez les données de volume, de florescence et d’absorbance dans la fiche technique. Sélectionnez ensuite l’ensemble des données avec le curseur, cliquez sur Insérer et sur X Y scatter. Sélectionnez les points de chaque ligne dans le graphique et insérez la ligne de tendance correspondante avec la case Afficher l’équation sélectionnée.

Notez les valeurs des pentes des deux droites selon l’équation. Pour obtenir la gouttelette lipidique, ou indice LD, divisez la pente de la ligne de fluorescence par la pente de la ligne de densité optique. Pour analyser la qualité des données, calculez le coefficient de corrélation de chaque ligne droite.

Cliquez sur l’assistant de fonction et choisissez corail. Les lectures sont fiables si R est égal ou supérieur à 0,9. Il est important de corroborer la sensibilité de cette méthode au microscope confocal.

Lorsque les cellules ont été cultivées dans le milieu YPD, il y a eu une augmentation de l’indice LD pendant la phase exponentielle suivie d’une baisse dans la phase stationnaire. En revanche, les cellules cultivées sous une carence en azote ont montré une augmentation constante de l’indice LD dans les phases exponentielles et stationnaires. En cas de carence en azote, l’augmentation de l’indice LD a été inhibée par le Soraphen A, un inhibiteur spécifique de l’enzyme acétyl-CoA carboxylase, essentielle à la synthèse des acides gras, contenus dans les triacylglycérols stockés dans les gouttelettes lipidiques.

Étant donné que les deux cultures ont été lancées avec la même densité optique, les résultats montrent la capacité du test à détecter de petits changements dans la teneur en lipides. La sensibilité de cette méthode a été corroborée par la microscopie confocale. Les cellules YPD contiennent de nombreuses petites LD dans toute la cellule, tandis que la privation d’azote a produit de grandes LD, généralement quatre à cinq par cellule.

Pour étudier plus en détail la mobilisation des LD chez les U.Maydis, des cellules cultivées sous une carence en azote pendant 72 heures ont été transférées dans un milieu YPD. Comme on le voit, l’indice LD a diminué suite à une fonction exponentielle. Comme les cellules ont été capables de mobiliser les LD accumulées lors de la privation d’azote, le résultat suggère une réduction de la teneur en triacylglycérol.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de protéger les cellules de la lumière et de les mélanger entre les ajouts. Après cette procédure, d’autres méthodes, par exemple la détermination du triacylglycérol ou de la teneur totale en lipides, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme la teneur exacte en lipides dans les cellules.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biotechnologie des lipides pour explorer des organismes nouveaux ou présumés afin d’augmenter la production de biocarburants ou de lipides dans des applications pharmaceutiques. Même les cellules cancéreuses malignes peuvent être étudiées avec cette technique pour explorer la participation du métabolisme des lipides dans le développement de la maladie. Après avoir regardé cette vidéo, vous avez également une bonne compréhension de la façon de déterminer l’indice de gouttelettes lipidiques de ces cellules.

N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.