Name: Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des macrophages alvéolaires murins et humains pour la recherche en pulmono-immunologie. Cette méthode fournit des populations hautement purifiées pour étudier les infections respiratoires et l'inflammation.

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Nous remercions Clare Prendergast d’assistance avec l’édition du manuscrit. DKN est pris en charge par une recherche concession (#2095) de la Fondation Flinn et TM est pris en charge par des subventions du National Institutes of Health (R01HL056643 et R01HL092514). DKN mis au point des méthodes, destiné à l’étude et a écrit le manuscrit ; OM a aidé avec les études chez l’animal et l’approvisionnement de l’échantillon clinique ; SB a contribué à l’analyse en cytométrie en flux et tri de cellules ; TM a supervisé les études et ont examiné le manuscrit.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) et l’Institutional Review Board (IRB) à St-Joseph hôpital et centre médical.
1. isolement de l’AMs de fluide Murine lavage broncho-alvéolaire (LBA)
<ol><li>Anesthésier une souris C57BL/6 de huit semaines avec la kétamine (87,5 mg/kg de poids corporel) et cocktail par une injection intrapéritonéale de xylazine (12,5 mg/kg de poids corporel). Aller de l’avant lorsque la souris atteint anesthésie chirurgicale avec perte des réflexes et de la relaxation des muscles.</li>
	<li>Placez la souris sur une surface de dissection avec la face ventrale vers le haut. Pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter la déshydratation et essuyez toute la surface ventrale de la souris avec des tampons de préparation alcool stérile saturés avec de l’isopropanol 70 % pour désinfecter.</li>
	<li>Montez la souris avec les quatre pattes maîtrisés.</li>
	<li>Ouvrir délicatement la cavité abdominale avec outils de dissection micro. Il faut pour ouvrir zone aussi bien que possible sans endommager les organes viscéraux ou la création de tissus surplombante.</li>
	<li>Ouvrir délicatement la cavité thoracique par incision lentement la cage thoracique dans le médiastin. Idéalement, la cage thoracique peut être excisée du côté à côté. Il faut en extrême ne pas de blesser la plèvre des poumons lors de l’ouverture de la cavité thoracique.</li>
	<li>Recherchez la veine cave inférieure et faites une incision à saigner la souris. Tampons de coton hydrophile permet d’absorber du sang.</li>
	<li>Injecter 10 mL glacee tamponné phosphate salin (PBS) dans le ventricule droit (à l’aide de la seringue de 10 mL et une aiguille 25G) pour vider les cellules circulantes du sang. Absorber l’écoulement du sang avec des tampons de coton hydrophile. Une fois complètement perfusé, les poumons apparaîtront blanchies et sont alors prêtes pour le lavage.</li>
	<li>Doucement fend la peau et des muscles du cou pour exposer les voies respiratoires. L’accise soigneusement les muscles adjacents, les cartilages et les tissus adipeux sans endommager la trachée.</li>
	<li>Faire une petite incision (< 2 mm) sur la trachée postérieure au larynx. Cette incision doit être juste assez pour insérer un cathéter en tandis que la trachée est encore attachée au larynx. Insérer un cathéter de 22G 1 pouce sans aiguille dans la trachée vers les poumons. Le cathéter avec une suture tressée en soie (4-0 ; non résorbable) avec un noeud carré. Remarque : Le cathéter doit être coupé basé sur la taille de la souris. Cathéters extrêmement courts ou longs ont tendance à fuir ou déchirer les voies aériennes pendant le lavage. Longueur du cathéter doit être telle qu’une fois inséré à fond la pointe reste bien en deçà de la trachée et n’atteignent pas les bronches primaires.</li>
	<li>Fixer une seringue de 1 mL remplie avec le tampon de BAL glacé (Ca2 + et Mg2 + gratuit PBS + 1 mM de l’acide éthylènediaminetétraacétique, EDTA) au cathéter et instiller lentement la mémoire tampon dans les poumons. Il se gonfle les poumons. Conserver la seringue jointe au cathéter pendant cinq secondes et puis aspirer le liquide de lavage en tirant doucement sur le piston. Cela se dégonfle les poumons. Recueillir le liquide dans un tube conique de 15 mL, mis dans la glace.</li>
	<li>Répétez l’étape 1.10 pour neuf fois plus et le liquide de lavage de piscine. Ne pas dépasser 1 mL de tampon par chasse d’eau, qui peut dépasser la capacité pulmonaire et conduire à sa rupture.</li>
	<li>Euthanasier la souris avec CO2 surdosage par protocole IACUC approuvé.</li>
	<li>Centrifuger le liquide 10 mL BAL à 250 x g à 4 ° C pendant 10 minutes. Le culot cellulaire contient des cellules de BAL. Mise en garde : Le plomb peut être très petit, donc faire preuve de prudence quand aspirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules BAL de 100 μL de tampon (PBS + 2 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF) + EDTA 1 mM + 25 mM acide N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de tri/débit.</li>
	<li>Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique aux récepteurs Fc par adjonction de ce bloc de souris Fc (cloner 2.4G2, 10 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.</li>
	<li>Effectuer des anticorps coloration avec fluorescence moins un (FMO) et single-tache contrôle11,25. Évaluer le BAL des cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivie par analyse en cytométrie en flux d’unicellulaires logiciel d’analyse approprié (voir la Table des matières).</li>
	<li>Isoler les AMs par une cellule activée par fluorescence trieuse (voir Table des matières) directement dans la souris 1 mL suis milieu de culture quand AMs sont destinés à la culture in vitro ou in vivo transfert de cellule. Par ailleurs, tri AMs dans le tampon de lyse de 1 mL (voir Table des matières) additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol pour extraction de l’ARN.</li>
</ol>2. isolement du MAM souris poumon, Suspension monocellulaire
<ol><li>Anesthésier une souris C57BL/6 de huit semaines avec la kétamine (87,5 mg/kg de poids corporel) et cocktail par une injection intrapéritonéale de xylazine (12,5 mg/kg de poids corporel). Aller de l’avant lorsque la souris atteint anesthésie chirurgicale avec perte des réflexes et de la relaxation des muscles.</li>
	<li>Placez la souris sur une surface de dissection avec la face ventrale vers le haut. Pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter la déshydratation et essuyez toute la surface ventrale de la souris avec des tampons d’alcool stérile saturés avec de l’isopropanol 70 % pour désinfecter.</li>
	<li>Montez la souris avec les quatre pattes maîtrisés.</li>
	<li>Ouvrir délicatement la cavité abdominale avec outils de dissection micro. Il faut pour ouvrir zone aussi bien que possible sans endommager les organes viscéraux ou la création de tissus surplombante.</li>
	<li>Ouvrir délicatement la cavité thoracique par incision lentement la cage thoracique dans le médiastin. Idéalement, la cage thoracique peut être excisée du côté à côté. Il faut en extrême ne pas de blesser la plèvre des poumons lors de l’ouverture de la cavité thoracique.</li>
	<li>Recherchez la veine cave inférieure et faites une incision à saigner la souris. Tampons de coton hydrophile permet d’absorber du sang.</li>
	<li>Injecter 10 mL de PBS glacée dans le ventricule droit (à l’aide de la seringue de 10 mL et une aiguille 25G) pour vider les cellules circulantes du sang. Une fois complètement perfusé, les poumons paraîtra blanchies et sont prêtes à être récoltées.</li>
	<li>Disséquer les poumons en coupant la trachée, des vaisseaux sanguins et des ligaments dans un tube conique de 15 mL à 5 mL de froid moyen d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Maintenir sur la glace jusqu’au niveau suivant.</li>
	<li>Euthanasier la souris avec CO2 surdosage par protocole IACUC approuvé.</li>
	<li>Transférer les poumons perfusés dans une boîte de Petri stérile et apyrogène de 60 mm avec 3 mL DMEM. Avec l’aide de pinces de dissection taquiner les voies respiratoires et autre matériel de tissu de poumon non dur, s’il est présent. Émincer le tissu pulmonaire avec un scalpel pour < taille de 1 mm.</li>
	<li>Ajouter 300 µg/mL Liberase TL et 5 U/mL DNase I, de la composition de pipetage et incuber à 37° C dans un incubateur pendant 25 minutes. Mélanger doucement une fois en pipettant également, au bout de 10 minutes.</li>
	<li>Passer les poumons dissociés à travers un tamis de cellule 100 µm installé sur un tube conique de 50 mL. Utilisez le dos d’un piston de la seringue de 1 mL pour écraser des amas de cellules sur le filtre. Laver le filtre avec 20 mL de tampon de lavage (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifuger à 500 g à 4 ° C pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon de lavage.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.12 et 2.13 deux fois, changer le filtre et le tube chaque fois. Trempage préalable le filtre dans le tampon de lavage pendant plus de cinq minutes augmente le rendement de l’AM. Préparer la suspension monocellulaire en ajoutant 100 μL de tampon pour le culot de flux/tri.</li>
	<li>Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique au récepteur Fc en ajoutant souris Fc bloc (cloner 2.4G2, 10 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.</li>
	<li>Effectuer des anticorps coloration ainsi que de la FMO et single-tache contrôles11,25. Évaluer le poumon cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivi d’unicellulaires écoulement cytometry analyse par logiciel.</li>
	<li>AMs de la sorte par un trieur de cellules (voir Table des matières) directement dans la souris 1 mL suis milieu de culture quand AMs sont destinés à la culture in vitro ou in vivo transfert de cellule. Vous pouvez également trier AMs dans 1 mL de tampon de lyse additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol pour extraction de l’ARN.</li>
</ol>3. isolement de l’AMs de LBA humaine
<ol><li>Organiser le transfert du fluide humain BAL de la clinique au laboratoire à 4 ° C.</li>
	<li>Centrifuger le liquide BAL (10-50 mL) à 250 g à 4 ° C pendant 10 minutes. Le culot cellulaire contient BAL cellules11.</li>
	<li>Laver le culot avec 20 mL de tampon de lavage (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS + 2 mM EDTA) et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 minutes.</li>
	<li>Remettre les cellules de BAL sont en 100 μL de tampon de flux/tri (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS, EDTA 1 mM + 25 mM HEPES).</li>
	<li>Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique au récepteur Fc en ajoutant humaine Fc bloc (clone, Fc1.3070, 25 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.</li>
	<li>Effectuer des anticorps coloration ainsi que de la FMO et single-tache contrôles11,24. Évaluer la BAL cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivi d’unicellulaires écoulement cytometry analyse par logiciel.</li>
	<li>AMs de la sorte par un trieur de cellules (voir Table des matières) directement dans le milieu de culture de 1 mL AM humaine ou tampon de lyse 1 mL additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol.</li>
</ol>4. in vitro Culture d’AMs
<ol><li>Après le tri cellulaire, récolter les cellules par centrifugation à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Remettre en suspension AMs humaines dans 1 mL de milieu de culture humaine AM [Roswell Park Memorial Institute moyen FBS (RPMI) 1640 additionné de 10 %, 20 % surnageant (comme source de facteur (M-CSF), concentration finale de 100 U/mL stimulant des colonies de macrophages), de la culture L-929 pyruvate de sodium 1 mM, 10 mM de l’acide N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) et 1 x pénicilline/streptomycine (facultatif)]. De même, resuspendre souris AMs dans 1 mL souris milieu de culture AM [DMEM additionné de 10 % FBS, 20 % L-929 culture surnageante (comme source de M-CSF, concentration finale de 100 U/mL), 1 mM de Pyruvate de Sodium, 10 mM HEPES et 1 x pénicilline/streptomycine (facultatif )].</li>
	<li>Énumérer les trypan bleu-à l’exclusion des cellules viables à un compteur de cellules et ajuster la concentration en cellules viables à 1 x 106/ml. Remarque : Dans l’idéal, vers le haut à 5 x 105 AMs peuvent être isolés dans LBA prélevé dans une souris mâle de 8 à 10 semaine vieux C57BL/6. Le rendement de l’AM depuis le digest de poumons de souris est variable et peut être légèrement inférieure à celle du fluide souris BAL. Rendement d’AM de LBA humaine dépend du volume de la LBA, le volume total de solution saline utilisée dans le lavage et l’état clinique du patient.</li>
	<li>Basé sur le rendement et la nécessité expérimentale, les semences les cellules en chambre diapositives, des récipients de culture ou des flacons de culture. Idéalement, graines de l’AMs à 1 x 105/ml avec 10 mL de milieu dans une fiole de vitroplants T25.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C humidifié avec une atmosphère 5 % CO2 . NOTE : AMs augmentera comme les cellules adhérentes et sont à croissance extrêmement lente (temps de doublement > 7 jours).</li>
	<li>24 heures après l’ensemencement, l’AMs devraient être adhérent et ne sera pas détaché par un doux changement de milieu de culture. Enlever le milieu par aspiration d’un bout et de reconstituer avec un milieu frais préchauffé à 37 ° C. Remarque : Les cellules peuvent maintenant servir à évaluer les effets des stimuli ou la physiologie AM. AMs cultivés dans les diapositives de la chambre peuvent être commodément colorées avec les anticorps appropriés et sont idéales pour la visualisation microscopique. Pour l’évaluation de cytométrie en flux, AMs sont récoltées par incubation avec cellule non enzymatique se dissociant de solution.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture et ajouter la dissociation solution suffisamment pour couvrir la surface de culture (environ 2 mL par flacon T25) et incuber à 37 ° C pendant 5-10 minutes. Aucun grattage ne sera nécessaire, et il n’est pas recommandé pour gratter les cellules mécaniquement. Tapoter légèrement les côtés, ajouter 1 à 2 mL de tampon de flux/tri et Pipetez doucement de haut en bas pour détacher la majorité des cellules adhérentes.</li>
	<li>Pour les études de RNA, lyser les cellules directement sur la boîte de Pétri par adjonction de tampon de lyse.</li>
</ol>

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<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

AMs sont des macrophages pulmonaires-résident de longue durée de vie qui peuplent les poumons commence à la naissance et qui persiste au cours de la durée de vie entière26. Leur rôle dans la physiologie pulmonaire7 et pathologie12 et leur capacité à prédire d’auto-immunité pulmonaire24 ont été reconnus. Parce qu’AMs ont une présence à long terme dans les poumons11,27 e...

Le microenvironnement pulmonaire est un écosystème complexe unique avec un conduit d’air élaborée et le système vasculaire. L’air inhalé se déplace à travers la trachée et à travers de nombreuses branches des bronches et des bronchioles avant d’atteindre les alvéoles, où l’échange de gaz du sang-air se produit. En raison d’une interaction directe avec l’atmosphère, la surface respiratoire requiert une protection contre les effets potentiellement nocifs de polluants et de particules en suspension dans. Un certain nombre de barrières physiques, chimiques et immunologiques protéger les poumons. Notamment, le déploiement des phagocytes à la surface respiratoire sert un système de défense de première ligne importante. Les macrophages alvéolaires (AMs) sont un type de phagocytes poumon-résident, et ils représentent la grande majorité de la piscine de macrophages pulmonaires. Comme leur nom l’indique, AMs sont principalement localisés dans la lumière alvéolaire et se produisent comme des cellules sessiles qui constamment goûter l’atmosphère ambiante et de communiquent avec l' épithélium alvéolaire1. Dans les poumons de l’état d’équilibre, plus de 95 % des phagocytes dans l’espace alvéolaire sont AMs2, dont la composition peut changer en raison d’une inflammation, une infection ou une exposition chronique aux polluants.
AMs participent à un large éventail de fonctions qui peuvent être locales vers les poumons et/ou d’importance systémique. Par exemple, AMs sont essentiels dans le développement et le fonctionnement optimal des poumons ; surveillance du système immunitaire ; et l’enlèvement des débris cellulaires, invasion de pathogènes et les particules inhalées3,4,5,6,7. Déplétion ciblée d’AMs est connue pour nuire apurement des virus respiratoires et bactéries4,8. Outre leur rôle de phagocytes et une première ligne de défenseurs de l’homéostasie pulmonaire, AMs sont connus pour fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigène en incitant T cell immunité9, potentialiser l’efficacité du vaccin intranasal10 et qui influent sur l’auto-immunité restriction pulmonaire après transplantation de poumon11,12. Carence en fonction de l’AM a été liée à la protéinose alvéolaire pulmonaire (PAP), une condition résultant d’une mutation génétique, une tumeur maligne ou une infection qui altère le dégagement de surfactants pulmonaires13,14. Transplantation d’AMs est maintenant à l’étude comme une approche thérapeutique pour le traitement du PAP 15,16.
AMs sont connus sont créés au cours de l’embryogenèse et persister dans les poumons tout au long de la vie sans être remplacé par circulant leucocytes2,17. Bien que le chiffre d’affaires AM est indétectable dans les poumons homéostatiques, différents niveaux de chiffre d’affaires de AM ont été signalés dans certaines conditions cliniques, y compris l’infection influenza virus4, myéloablatif irradiation18, exposition d’endotoxine 19et20de la vieillesse. AMs sont censés se renouveler par une prolifération de bas grade17,21, mais des études récentes affirment que les monocytes peuvent donner lieu à une population d’intravasculaire pulmonaire macrophages22,23 sous les conditions expérimentales, mais les fonctionnalités de ces macrophages pulmonaires nouvellement convertis doivent encore être définis dans les maladies pulmonaires. En outre, comprendre le seuil de stimulation dans le contexte d’activation AM est un potentiellement intéressant, car le poumon tente de préserver un équilibre entre les signaux inflammatoires et la machinerie immunorégulatrices.
Les altérations physiologiques ou pathologiques qui mènent à la perte de la régulation immunitaire sont importantes pour évaluer dans divers contextes cliniques (p. ex., les infections respiratoires, la pneumopathie inflammatoire et fibreuse de la pneumopathie). Néanmoins, AMs sont plus en plus reconnues comme indicateurs ou même déterminants de la santé pulmonaire11,24. Actuellement, il n’existe aucun protocole unifié pour la récolte, qui caractérisent, et/ou maintien AMs chez l’homme et des modèles murins précliniques. Absence de consensus sur les phénotypes et les précurseurs de l’AM et l’absence d’une méthodologie détaillée avaient été l’obstacle majeur à déchiffrer les rôles d’AM dans la maladie et la santé pulmonaire. Le protocole suivant propose une identification définitive, isolement et in vitro culture stratégie qui sera grandement avancer la compréhension du comportement de l’AM et faciliter les études diagnostiques et thérapeutiques ciblées AM.

<table><tbody><tr><td>Solution non enzymatique de dissociation cellulaire</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catheter&nbsp ;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Suture tressée en soie non résorbable&nbsp ;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Souris Fc bloc&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse (kit d’ARN PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250²�</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules FACSAria II&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>la kétamine&nbsp ; (Cétathésie)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp ; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp ;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu ; crépine à cellules M&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bloc Fc humain</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 lignée cellulaire</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&nbsp ; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Fiole de culture tissulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>plat de culture de 60 mm&nbsp ;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 ml.</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (souris)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (souris)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (souris)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (souris)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugué</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (souris)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, Anti-Ly-6C conjugué APC/Cy7</td></tr><tr><td>(Souris)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605</td></tr><tr><td>Anti-CD64 conjugué (Souris)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711</td></tr><tr><td>Anti-CD24 conjugué (Souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 Conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (souris)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (souris)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (humain)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugué</td></tr><tr><td>anti-CD11b (humain)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Humain)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Humain)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239,</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Humain)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugué</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Humain)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugué</td></tr></tbody></table>

isolement et la culture in vitro de macrophages alvéolaires murines et humaines

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Les macrophages alvéolaires sont des macrophages différenciés en phase terminale, poumon-résident d’origine prénatale. Les macrophages alvéolaires sont uniques dans leur longévité et leur rôle important dans le développement pulmonaire et la fonction, ainsi que leurs réponses pulmonaire localisée à l’infection et l’inflammation. A ce jour, n’existe aucune méthode unifiée pour identification, isolement et manipulation des macrophages alvéolaires chez l’homme et de la souris. Une telle méthode est nécessaire pour les études sur ces cellules immunitaires innées importants dans divers contextes expérimentaux. La méthode décrite ici, qui peut être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire, est une approche simplifiée pour la récolte des macrophages alvéolaires de lavage bronchoalvéolaire ou de tissu pulmonaire et leur maintien in vitro. Parce que les macrophages alvéolaires se produisent principalement comme des cellules adhérentes dans les alvéoles, cette méthode porte sur les déloger avant la récolte et l’identification. Le poumon est un organe très vascularisé, et divers types de cellules d’origine myéloïde et lymphoïde habitent, d’interagissent et sont influencés par le microenvironnement de poumon. En utilisant l’ensemble des marqueurs de surface décrit ici, chercheurs peuvent facilement et de manière univoque distinguer les macrophages alvéolaires d’autres leucocytes et les purifier pour applications en aval. La méthode de culture élaborée dans cet article prend en charge les deux homme et macrophages alvéolaires pour la croissance in vitro de la souris est compatible avec les études cellulaires et moléculaires.

L’approche de cytométrie en flux pour identifier les souris AMs est illustré à la Figure 1. Cela comprend l’analyse d’un ensemble minimal de marqueurs de surface nécessaires en distinguant AMs des autres phagocytes poumon-résident ou poumon-infiltrant. Analyse différentielle est nécessaire pour identifier avec certitude l’AMs d’interstitielles macrophages, cellules dendritiques, les neutrophiles, monocytes et macrophages dérivés de monocytes macrophages pulmo...

Cette communication décrit les méthodes d’isolement et culture des macrophages alvéolaires, des humains et des modèles murins à des fins expérimentales.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les macrophages alvéolaires humains et murins des poumons et du liquide de lavage broncho-alvéolaire et de développer la méthode pour leur culture in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine de l’immunologie des pulmonos, telles que le rôle des macrophages alvéolaires dans l’infection respiratoire, l’inflammation et l’auto-immunité. Le principal avantage de cette technique est de pouvoir distinguer les macrophages alvéolaires des autres leucocytes pulmonaires et d’obtenir une population de macrophages alvéolaires hautement purifiés à des fins expérimentales.Placez une souris anesthésiée sur une surface de dissection avec la face ventrale vers le haut. Appliquez une pommade vétérinaire ophtalmique sur les yeux pour prévenir la déshydratation. Essuyez toute la surface ventrale de la souris avec des tampons de préparation à l’alcool stériles, saturés à 70 % d’isopropanol, pour désinfecter.Montez la souris avec les quatre pattes conservées. Ouvrez doucement la cavité abdominale à l’aide d’outils de micro-dissection. Il faut veiller à ouvrir autant de surface que possible sans endommager les organes viscéraux ni créer de tissu en surplomb.Ouvrez doucement la cavité thoracique en incisant lentement la cage thoracique à travers le médiastin. Idéalement, la cage thoracique peut être excisée d’un côté à l’autre. Des précautions extrêmes doivent être prises pour ne pas blesser la plèvre des poumons lors de l’ouverture de la cavité thoracique.Localisez la veine cave inférieure et faites une incision pour saigner la souris. Utilisez des cotons absorbants pour absorber le sang. Injectez 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacé dans le ventricule droit pour rincer les cellules sanguines en circulation.Absorbez le flux sanguin avec des cotons absorbants. Une fois complètement perfusés, les poumons apparaîtront blanchis et seront alors prêts à être lavés. Ouvrez doucement la peau et les muscles du cou pour exposer les voies respiratoires.Excise soigneusement les muscles, les cartilages et les tissus adipeux adjacents, sans endommager la trachée. Ensuite, faites une petite incision sur la trachée, en arrière du larynx. Cette incision doit être juste suffisante pour insérer un cathéter pendant que la trachée est encore attachée au larynx.L’étape la plus critique dans la collecte du liquide BAL consiste à fixer solidement un cathéter à la trachée qui minimisera les fuites pendant le lavage. Insérez un cathéter de calibre 22 d’un pouce sans aiguille dans la trachée en direction des poumons. Fixez le cathéter avec une suture tressée en soie et un nœud carré.Avoir les mains solides et pour suivre cette étape, empêche lentement et doucement la rupture de la trachée et des poumons. Fixez une seringue d’un millilitre, remplie de tampon BAL glacé sur le cathéter et instillez lentement le tampon dans les poumons. Cela gonflera les poumons.Gardez la seringue attachée au cathéter pendant cinq secondes, puis aspirez le liquide de lavage en tirant doucement sur le piston. Cela dégonflera les poumons. Recueillir le liquide dans un tube conique de 15 millilitres, placé sur de la glace.Répétez le gonflage et le dégonflage neuf fois de plus, et accumulez le liquide de lavage. Ne dépassez pas un millilitre de tampon par rinçage, car cela pourrait dépasser la capacité pulmonaire et entraîner sa rupture. Centrifugez les 10 millilitres de liquide BAL à 250 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.La pastille cellulaire contient des cellules BAL. Remettre en suspension les cellules BAL dans 100 microlitres de tampon de tri en flux. Procédez à la coloration et au tri des cellules comme décrit dans le protocole texte.Préparez une souris anesthésiée pour la dissection, effectuez des incisions et saignez la souris comme précédemment. Injectez 10 millilitres de PBS glacé dans le ventricule droit pour rincer les cellules sanguines circulantes. Une fois complètement perfusés, les poumons apparaîtront blanchis et seront prêts pour la récolte.Disséquez les poumons en sectionnant la trachée, les vaisseaux sanguins et les ligaments dans un tube conique de 15 millilitres, avec cinq millilitres de DMEM froid. Maintenez-le sur de la glace jusqu’à l’étape suivante. Transférez les poumons perfusés dans une boîte de culture stérile et apyrogène de 60 millimètres avec trois millilitres de DMEM.À l’aide d’une pince à dissection, extraire les voies respiratoires et tout autre matériau de tissu dur non pulmonaire, le cas échéant. Émincez le tissu pulmonaire avec un scalpel à une taille inférieure à un millimètre. Ajoutez 300 microgrammes par millilitre de Liberase TL et cinq unités par millilitre de DNAse un.Mélanger par pipetage et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant 25 minutes. Après 10 minutes, mélangez doucement une fois par pipetage. Passez les poumons dissociés à travers une crépine cellulaire de 100 microns installée sur un tube conique de 50 millilitres.Utilisez l’arrière d’un piston d’une seringue d’un millilitre pour écraser les amas de cellules sur le filtre. Lavez le filtre avec 20 millilitres de tampon de lavage. Centrifuger à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 20 millilitres de tampon de lavage. Répétez deux fois les étapes de tamisage et de centrifugation, en changeant le filtre et le tube à chaque fois. Enfin, préparez la suspension à cellule unique en ajoutant 100 microlitres de tampon de tri en flux à la pastille de cellule.Effectuez la coloration des anticorps et le tri cellulaire, comme décrit dans le protocole texte. Après le tri des cellules, récoltez les cellules en les centrifugeant à 250 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez en suspension les MA de souris dans un millilitre de milieu de culture de MA de souris.En fonction du rendement et de la nécessité expérimentale, ensemencez les cellules dans des lames de chambre, des boîtes de culture ou des flacons de culture. Idéalement, ensemencez les MA à raison de 100 000 par millilitre avec 10 millilitres de milieu dans une fiole de culture tissulaire T 25. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %.24 heures après l’ensemencement, les MA doivent être adhérents et ne seront pas détachés par un changement doux de milieu de culture. Retirez le milieu par aspiration d’une extrémité et remplissez-le de milieu frais préchauffé à 37 degrés Celsius. Enfin, observez la fiole au microscope inversé.L’évaluation cytométrique en flux des macrophages alvéolaires dans le liquide de lavage alvéolaire broncho de souris est présentée. Les macrophages alvéolaires sont positifs, identifiés comme étant des cellules CD45 positives, CD11c positives et Siglec-F positives. Le graphique ci-dessous est un résultat représentatif de macrophages alvéolaires de souris cultivés in vitro pendant 24 heures.Les cellules sont devenues adhérentes et un changement doux de milieu de culture ne les détachera pas. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures environ, si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les macrophages alvéolaires de la souris et de l’homme des autres cellules pulmonaires.Aussi, comme les procédures pour obtenir une belle population de macrophages alvéolaires pour les expériences en aval. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que tous les macrophages ou phagocytes résidents des poumons ne sont pas des macrophages alvéolaires. Les macrophages alvéolaires sont un type de cellules spécialisées présentes dans les poumons depuis la naissance.Pour l’isolement des macrophages alvéolaires, l’accent doit être mis sur des méthodes d’extraction viables du microenvironnement alvéolaire. La méthode de culture in vitro développée ici soutient la croissance de macrophages alvéolaires dans des conditions de laboratoire qui peuvent être utilisées dans des essais moléculaires et cellulaires. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le transfert de cellules adoptives, la présentation d’antigènes et l’évaluation de la réponse à des stimuli inflammatoires peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la biologie des macrophages alvéolaires.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Nous décrivons ici un protocole simple pour isoler les macrophages péritonéaux murins. Cette procédure est suivie d’une extraction de l’ARN pour effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation des récepteurs de type Toll.

Isolement d&#39;anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

Nous rapportons ici les méthodes courantes pour analyser la fonction phagocytaire des macrophages alvéolaires murines et clairance bactérienne du poumon. Ces méthodes d’étudient de la phagocytose des perles de l’isothiocyanate de fluorescéine in vitro et in vivo phagocytose de Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. On décrit également une méthode de dégagement de P. aeruginosa chez la souris.

Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l'acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l'immunophénotypage et les quantifications d'ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Présenté ici est un protocole pour l’isolement primaire de monocyte de sang humain aussi bien que leur différenciation dans les macrophages et les cellules dendritiques et l’assemblage avec des cellules épithéliales dans un modèle humain multicellulaire de poumon. Les réponses biologiques des cocultures composées de cellules immunitaires différenciées des monocytes fraîchement isolés ou décongelés, lors de l’exposition à des stimuli proinflammatoires, sont comparées.

Modèle alvéolaire humain multicellulaire composé de cellules épithéliales et de cellules immunitaires primaires pour l’évaluation des risques

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Apprenez à isoler et cultiver des macrophages alvéolaires murins et humains pour la recherche en pulmono-immunologie. Cette méthode fournit des populations hautement purifiées pour étudier les infections respiratoires et l'inflammation.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

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