Name: Une méthode pour étudier le polymorphisme C924T du gène récepteur Thromboxane A2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez une méthode d'analyse du polymorphisme C924T du gène TBXA2R par PCR-RFLP et électrophorèse sur gel. Cette technique rapide et économique permet d'identifier les patients à risque thrombotique.

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Ce projet a été financé en partie par 60 % Ateneo accorde de Ministero dell'Università, Italie, S.M., et E.T. Nous avons également reçu des contributions partielles à la recherche des charges par le Department of Medical, Oral et biotechnologiques, Université de Chieti « G. d’Annunzio ».

Le protocole suit les directives de la Medical Research Ethics Committee de l’Université de Chieti.
1. réactif Setup
<ol><li>Préparer le tampon Tris-EDTA (TE) (pH 8,0). Ajouter 200 µL d’EDTA 0,5 M et 1 mL de Tris-Cl 1 M dans un bécher et amener à 100 mL avec de l’eau stérile. Concentration finale de tampon TE : 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Conserver à température ambiante (RT).</li>
	<li>Préparer 1 L de la solution mère électrophorèse mémoire tampon 10 x (TBE). Dissoudre les 108 g de Tris Base, 55 g d’acide borique et 40 mL d’EDTA 0,5 M (pH 8) dans un bécher et porter au volume de 1 L avec de l’eau stérile. Magasin à température ambiante.</li>
	<li>Préparer le gel colorant de chargement. Dissoudre 0,25 g de bromophénol bleu, 0,25 g de 50 g de glycérol, 1 mM d’EDTA (pH 8) de 60 mL de xylène cyanol FF, déionisée ou distillée et porter à un volume de 100 mL avec de l’eau stérile. Stocker à 4 ° C (pendant quelques mois) ou à-20 ° C (pour les années)</li>
	<li>
Préparez 200 mL de gel d’agarose à 2 %. Utilisation il frais ou, à défaut, stocker solidifié à RT pour jusqu'à plusieurs semaines.
	<ol>
<li>Dissoudre 4 g d’agarose dans 200 mL de 1 tampon de x TBE dans un bécher de 600 mL. Remuer à l’aide d’un agitateur magnétique pendant environ 5 min jusqu'à ce que l’agarose est totalement suspendu.</li>
		<li>Chauffer la solution d’agarose à 2 % dans l’eau bouillante ou sur une plaque chauffante (pendant environ 10 min, jusqu'à dissolution complète de l’agarose). Notez que le bécher avec le gel d’agarose doit être recouverte de papier d’aluminium. Vous pouvez également chauffer le bécher découvert dans un four à micro-ondes à température élevée pendant environ 3 à 5 min.</li>
		<li>Agiter la solution d’agarose à 2 % à l’aide d’un agitateur magnétique, vérifiant que l’agarose est complètement dissous. NOTE : Les particules d’agarose figurent sous forme de grains translucides avant une dissolution complète. Il peut être nécessaire aux particules de réchauffage pendant plusieurs minutes (environ 5-10 min).</li>
		<li>Si une partie stockée du gel d’agarose est utilisé, faire chauffer le bol, recouvert de papier d’aluminium, dans un bain d’eau chaude (à environ 60 ° C) jusqu'à ce que l’agarose est dissoute. Retirer avec une pipette Pasteur toute « trace » d’agarose solidifiée à la surface avant de couler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purification d’ADN
<ol><li>
Effectuez ce qui suit avant de commencer la purification :
	<ol>
<li>Utiliser des échantillons de sang humain total frais, ou décongeler sang congelé les échantillons rapidement (pour environ 2-3 min) dans un bain d’eau (à 37 ° C) en appliquant une légère agitation et ensuite équilibrer à RT avant utilisation.</li>
		<li>Mélanger les échantillons de sang frais ou dégelés inversant les tubes plusieurs fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Commencer la procédure de purification en suivant les protocoles du fournisseur pour 100 µL de volume d’élution.</li>
	<li>
Mesurer et calculer la pureté de l’ADN, mesurer l’absorbance à 260, 280 et 320 nm.
	<ol>
<li>Utiliser de l’eau stérile afin de diluer les échantillons et pour calibrer le spectrophotomètre.</li>
		<li>Appliquer la formule suivante, afin de calculer la concentration de l’échantillon d’ADN = 50 µg/mL x (un260 − A320) x facteur de dilution et la pureté de l’ADN = (un260 − A320) / (un280 − A320), avec un rapport acceptable entre 1,7 et 1,9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR Amplification d’échantillons d’ADN
<ol><li>Préparer 25 µL du mélange réactionnel dans un tube de micro-amplification de 0,2 mL, comme indiqué dans le tableau 1.</li>
	<li>Procéder à une amplification par PCR des échantillons ADN purifiés à l’aide d’un thermocycleur automatisé, suivant le programme d’amplification figurant au tableau 2.</li>
	<li>À la fin de l’amplification par PCR, arrêter les réactions de PCR en laissant les échantillons d’ADN à 4 ° C.</li>
</ol>4. RFLP des produits PCR
<ol><li>Préparer les 22,5 µL de solution de mélange réactionnel pour chaque échantillon, afin que l’enzyme de restriction sélectionné digère les produits PCR, comme indiqué dans le tableau 3.</li>
	<li>Transférer 2,5 µL du produit PCR dans un nouveau tube PCR pour chaque échantillon, à l’aide d’une pipette et bouts filtrants.</li>
	<li>Ajouter 22,5 µL de solution de digestion master-mix pour les tubes contenant le produit PCR de chaque échantillon, à l’aide d’une pipette et bouts filtrants.</li>
	<li>Incuber le mélange réactionnel (solution de mélange réactionnel et produit de PCR) à 37 ° C pendant 4 h.</li>
</ol>5. gel électrophorèse analyse d’échantillons de PCR-RFLP
<ol><li>Coloration du gel d’agarose en ajoutant le bromure d’éthidium (EtBr) à 0,5 µg/mL pour le gel pendant 10 min. de bromure d’éthidium se lie à l’ADN, qui peut être visualisée sous lumière ultraviolette (UV). Attention : Il est important d’utiliser des gants et autres dispositifs de protection au cours de la manutention, le stockage et l’élimination du bromure d’éthidium, parce que c’est un agent mutagène avec potentiel cancérigène.</li>
	<li>Verser le gel d’agarose préparés dans un bac de gel avec le peigne bien en place et attendre jusqu'à ce qu’il est solidifié.</li>
	<li>Placer le gel d’agarose solidifiée dans la boîte de gel (appareil d’électrophorèse).</li>
	<li>Remplir la boîte gel avec 1 x TBE jusqu'à ce que le gel est couvert.</li>
	<li>Avec une pipette et bouts filtrants, charger 6 µL du digest amplifié ADN (plus précisément, charge 5 µL de chaque échantillon et 1 µL de gel colorant de chargement) dans les puits du gel d’agarose. Ajouter un marqueur de taille d’ADN dans un autre bien et en parallèle avec les échantillons.</li>
	<li>Exécutez le gel pendant 20 à 30 min à 100 V.</li>
	<li>Avec un transilluminateur UV-, visualiser les fragments d’ADN clivés ou les produits PCR non digérés, comparant les fragments avec le marqueur de taille d’ADN et inscrire les résultats en suivant les instructions du fabricant de la photographie. Attention : Utiliser des dispositifs de protection (lunettes de sécurité ou un masque facial) autour des sources lumineuses UV.</li>
</ol>

<ol><li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/25327">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li>
<li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li>
<li>Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+thromboxane+synthase%2C+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions%3A+correlation+with+plaque+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li>
<li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li>
<li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li>
<li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1098882317300060">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li>
<li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li>
<li>Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li>
<li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li>
<li>Iwasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+genotyping+for+single+nucleotide+polymorphisms+by+a+microarray-based+single+nucleotide+polymorphism+typing+method+involving+hybridization+of+short+allele-specific+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.</a> DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).</li>
<li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li>
<li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75(2002).</li>
<li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous%2C+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60(2002).</li>
<li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5%27+nuclease+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Anal%22%5BJournal%5D)">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans la présente étude, nous avons décrit une méthodologie qui permet de génotypage patient afin d’enquêter sur le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène TBXA2R. Tout d’abord, cette méthode repose sur l’extraction de l’ADN du sang total. En particulier, ce premier processus consistant en une purification de l’ADN humain total, génomique et mitochondriale, provenant d’échantillons de sang entier frais ou congelés, traités avec de l’EDTA (citrate ou héparine). Pour le stockage à court terme d’échantillons de sang total, conserver entre 2 et 8 ° C pendant 10 jours. Pour le stockage de plus de 10 jours, conserver les échantillons à-70 ° C. Le processus de purification automatique comprend 4 étapes : lyse, lier, laver et éluer. Deuxièmement, la méthode repose sur l’amplification par PCR de la portion de gène de TBXA2R contenant la mutation C924T. Enfin, l’identification de la souche sauvage et/ou génotype mutant en utilisant une analyse de l’enzyme de restriction (RFLP) sur gel d’agarose est effectuée.
Des étapes cruciales dans le protocole sont les suivants : (i) dans le cas où une partie du gel d’agarose stockée à RT est utilisé, l’agarose solidifié peut être re-dissous dans un bain d’eau bouillante (à 60 ° C pendant environ 15-20 min) ou dans un four à micro-ondes (3-5 min) avant de couler. Remarque : desserrer le bouchon quand la refusion d’agarose dans une bouteille. (ii), par ailleurs, lorsque le réchauffage d’agarose, évaporation provoque une augmentation de sa concentration. Pour cette raison, il pourrait être utile compenser en ajoutant un petit volume d’eau. (iii) fragments d’ADN de moins de 1 000 bp ont été différenciées en gel d’agarose et tampon TBE est recommandé afin d’obtenir la meilleure séparation possible. (iv) nous préférons utiliser un gel d’agarose, plutôt qu’un gel de polyacrylamide, parce que la préparation de ce dernier est plus difficile, et il faut beaucoup plus de temps à mettre en place. (v) le choix de la durée de l’électrophorèse de gel dépend de la taille attendue des produits d’amplification. Basé sur ce protocole, il suffit d’effectuer une électrophorèse pendant 20-30 min à 100 V en gel d’agarose à 2 %, étant donné que la taille de la PCR des fragments varie de 100 à 500 BP. (vi) il est obligatoire pour l’obtention de 10 à 50 ng d’un modèle de bonne qualité ADN extrait d’échantillons humains . Pour cette raison, nous préférons utiliser une purification d’ADN automatisée et non semi-automatique ou manuelle. (vii) Prepare la réaction du mélange réactionnel pour l’amplification PCR et la solution de mélange réactionnel pour la digestion de produits PCR, ajouter 10 % de plus (pour tenir compte des pertes de liquide pendant le pipetage) au volume calculé multiplié par le nombre d’échantillons pour le volume nécessaire pour un échantillon d’ADN.
L’écueil le plus fréquent de la méthode est la présence de produits d’amplification supplémentaire en raison d’un programme incorrect thermocycleur, une préparation du mélange réactionnel amplification incorrect ou une contamination de modèle de l’ADN. En outre, l’absence de produits PCR peut-être dû à inactivé Taq polymérase ou un thermocycleur incorrect exécuté. En outre, la présence de fragments inattendus peut être en raison de la contamination des produits PCR ou à une digestion incomplète d’une enzyme inactivée, trop peu de volume de l’enzyme de restriction ou un temps d’incubation trop court.
Dans les dernières années, les méthodes suivantes ont été utilisées pour l’analyse SNP en utilisant la technique PCR : l’hybridation des oligonucléotides spécifiques allèle courts11, allèle spécifique PCR12, extension d’amorce sur puces à ADN13 , ligature de l’oligonucléotide assay14, diriger le séquençage de l’ADN pour l’identification des polymorphismes mononucléotidiques position spécifique-15Taqman méthode16, extraction Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation De spectrométrie de masse à temps de vol (MALDI-TOF)17et18de la GeneChips. Ces méthodes ne sont pas idéales, car elles ne sont pas simples à utiliser ou à exiger des équipements coûteux. À l’inverse, la méthode de PCR-RFLP décrite dans la présente étude est peu coûteux, facile à utiliser, pratique, a un rendement élevé et permet une identification rapide du polymorphisme C924T. Une limitation à la méthode actuelle est qu’il peut uniquement être utilisé pour un petit nombre de SNP et quelques échantillons dans une session de travail.
Pour de futures applications, cette méthode peut être utilisée pour des études prédictives concernant la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. En outre, cette méthode pourrait identifier des sujets plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, en particulier, les patients à haut risque traitement avec l’aspirine. Enfin, cette méthode pourrait être appliquée à l’étude des autres polymorphismes impliqués en médecine personnalisée pour des médicaments spécifiques (par exemple, des anticoagulants et des anticonvulsivants) afin de comprendre le dosage approprié des médicaments et l’individu pharmacologique et réponse clinique de chaque patient avant de commencer un traitement et d’éviter les effets indésirables.

TBXA2R est un membre de la superfamille des protéines G couplées avec des régions sept domaines transmembranaires, qui sont largement exprimés et localisé sur les membranes cellulaires ou sur des structures intracellulaires1,2. La voie de signalisation de TBXA2R est impliquée dans le processus athérosclérotique avancée3. Augmentation de l’expression du récepteur TBXA2 a été démontrée au cours de la progression de l’athérogenèse et cliniques et des études expérimentales ont montré son rôle pertinent à l’ischémie et infarctus du myocarde4. C924T, un polymorphisme de nucléotides simples (SNP) du gène TBXA2R, a été reconnu comme un polymorphisme fonctionnel chez des volontaires sains et a été liée à des troubles cliniques5. De plus, notre étude précédente6 ont démontré que le polymorphisme C924T du gène TBXA2R est impliqué dans la stabilité de la transcription ; plus précisément, il y a une instabilité accrue de la transcription de type mutante (TT) en ce qui concerne le type sauvage (CC). En outre, plusieurs stimuli comme l’adénosine diphosphate (ADP), l’épinéphrine et collagène à différentes concentrations induit une agrégation plaquettaire moins efficace pour le type de mutant (TT). Cela est compatible avec une formation de thrombus réduite et l’hémostase. Ainsi, l’instabilité de la transcription de TBXA2R et la réduction connexe de l’agrégation plaquettaire peuvent être associés à un rôle protecteur pour le génotype TT TBXA2R contre athérothrombose et ses complications chez les patients traités par aspirine à haut risque6 .
Nous décrivons ici une méthodologie pour le génotypage de patient étudier le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène du récepteur TBXA2. Cette méthode repose sur les étapes suivantes : extraction de l’ADN (1) du sang total, amplification PCR (2) de la portion de gène de TBXA2R contenant les C924T mutation et (3) l’identification du type sauvage ou génotypes mutants à l’aide de longueur de fragment de restriction polymorphisme sur gel d’agarose. RFLP est une technique qui exploite les variations de séquences ADN homologues7. Cette application a été utilisée pour détecter des polymorphismes de l’ADN, en particulier les SNP, trouver et associer la pertinence biologique en variations génétiques8. Le polymorphisme analysé pour la première fois à l’aide de la PCR-RFLP chez l’être humain a été l’ABO sang9. La méthode de PCR-RFLP permet l’analyse des mutations génétiques dans des séquences d’ADN homologues en évaluant la présence de fragments de différentes longueurs après la digestion de l’ADN en utilisant des endonucléases de restriction hautement spécifique10.
Dans ces dernières années, les méthodes suivantes ont été utilisées pour l’analyse SNP en utilisant la technique PCR : l’hybridation des oligonucléotides spécifiques allèle courts11, allèle spécifique PCR12, extension d’amorce le DNA microarrays13, ligature de l’oligonucléotide assay14, Direct ADN ordonnançant pour identification polymorphismes mononucléotidiques position spécifique15, Taqman méthode16, extraction () Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation Time-Of-Flight MALDI-TOF) spectrométrie de masse à17et18de la GeneChips. Ces techniques ne sont pas simples à utiliser et peuvent nécessiter des équipements coûteux. À l’inverse, la méthode de PCR-RFLP est peu coûteux, facile à utiliser, pratique, a un rendement élevé et permet une identification rapide du polymorphisme C924T. En outre, nous avons confirmé les résultats en séquençant le gène de la TBXA2R à l’aide de la méthode de Sanger15.
Cette approche permet une étude prévisionnelle de la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. Cette méthode pourrait identifier des sujets plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, en particulier ceux chez les patients à haut risque, traités à l’aspirine.

<table><tbody><tr><td>QIAsymphony SP</td><td>QIAGEN</td><td>937055</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>EPPENDORF</td><td>6131-02222</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur UV UVP</td><td></td><td>732-110</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>H0030121589</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>5331-03721</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors et pointes filtrantes</td><td>EPPENDORF</td><td>H4910000018/42/69 ET 0030067037/10/02</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse minigel horizontal</td><td>DIATECH PHORESIS 10</td><td>RI002-10</td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-bloc sec</td><td>INCUBATEUR DOUBLE</td><td>DG210</td><td></td></tr><tr><td>QIAsymphony DNA Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>931255</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon PCR (généralement fourni par le fabricant avec la Taq polymérase)</td><td>DIATECH ET TAKARA</td><td>T0100 ET R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>TAKARA</td><td>R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>DIATECH&nbsp ; pharmacogénétique</td><td>NM001</td><td>dNTP MIX 10x 100 microlitres, 10</td></tr><tr><td>mM amorces PCR</td><td>DIATECH&nbsp ; pharmacogénétique</td><td>\\Enzyme</td><td></td></tr> <tr><td>de restriction RsaI</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction 10x buffer</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Les fragments d’ADN sont mieux séparés dans un tampon TBE</td></tr> Base <tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>10 % (poids/vol) persulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>E3678</td><td>préparé frais chaque fois que</td></tr><tr><td>l’EtBr ( 0,5 &mu ; g/&mu ; L)</td><td>Sigma</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylène cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de taille d’ADN</td><td>DIATECH&nbsp ; pharmacogénétique</td><td>R1002-10</td><td>Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI</td></tr><tr><td>Eau stérile (autoclave)</td><td>DIATECH&nbsp ; Pharmacogénétique</td><td>\\</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour étudier le polymorphisme c924t du gène récepteur thromboxane a2

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Le gène du récepteur (TBXA2R) de thromboxane A2 est un membre de la superfamille des protéines G couplées avec les régions sept domaines transmembranaires. Il est impliqué dans la progression de l’athérogenèse, ischémie et infarctus du myocarde. Nous présentons ici une méthodologie de génotypage patient pour étudier le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène du récepteur TBXA2. Cette méthode repose sur l’extraction de l’ADN du sang total, l’amplification de la polymérase chain reaction (PCR) de la portion de gène de TBXA2 contenant la mutation C924T et l’identification du type sauvage ou génotypes mutants à l’aide d’une analyse de restriction digest, plus précisément un RFLP (RFLP) sur agarose gel. En outre, les résultats ont été confirmés en séquençant le gène TBXA2R. Cette méthode présente plusieurs avantages potentiels, tels que le rendement élevé et l’identification rapide du polymorphisme C924T par analyse PCR et les enzymes de restriction. Cette approche permet une étude prévisionnelle pour la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. Application de cette méthode a le potentiel d’identifier les sujets qui sont plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, dans différentes disciplines dans un groupe à haut risque, traités à l’aspirine.

L’objectif de cette méthode consiste à évaluer le génotype de récepteur du Thromboxane A2 en ce qui concerne le polymorphisme du C924T. Le gène humain de TBXA2R se trouve sur 19p13.3, s’étend sur 15 KPB et se compose de trois exons séparés par deux introns. Les C924T de polymorphismes du gène TBXA2R (de 539 bp) a été amplifié en utilisant les amorces PCR illustrés à la Figure 1, qui ont été bien conçus pour amplifier une région spécifique de l’ADN, mais pas un orthologue ou paralogue région non spécifique. En outre, une analyse RFLP, utilisant une enzyme de restriction RsaI (Figure 1) sur les produits PCR a été réalisée et les résultats sont visualisés sur gel d’agarose, afin de caractériser le SNP spécifique étudié.
Basée sur la présence de longueurs différentes fragment après digestion de l’ADN, il est possible de discriminer le génotype du patient pour le polymorphisme du C924T. En effet, comme indiqué sur la Figure 2, l’homozygotie de l’allèle majeur (CC) affiche deux bandes (bp 395 et 144), parce que l’enzyme de restriction coupe précisément la partie du gène TBXA2R sur le site de polymorphisme C924T. L’homozygotie de l’allèle mineur (TT) est démontrée par une seule bande (539 bp), parce que la coupe de l’enzyme de restriction ne se produit pas. L’allèle (CT) hétérozygote montre trois bandes (539, 395 et 144 bp). Comme illustré à la Figure 2, le polymorphisme C924T, défini par la digestion de la RsaI sur produit de PCR, a été confirmé par analyse de la séquence.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Volume (µL)</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x tampon PCR Tween-20 (MgCl de 15 M2)</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>mélange dNTP (10 mM)</td>
			<td>1</td>
			<td>200 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apprêt (avant) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apprêt (inverse) (10 pmol/µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
TAQ polymérase (5 U/µL)</td>
			<td>0,2</td>
			<td>1 U/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Échantillon d’ADN (42 ng/µL)</td>
			<td>1</td>
			<td>42 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase-eau libre</td>
			<td>20.55</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Installation d’amplification PCR. Un mélange de maître-mélange réactionnel de 25 µL mis en place dans un tube PCR de 0,2 mL à amplifier un seul échantillon d’ADN.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">PCR standard</td>
		</tr>
<tr>
<td>Première étape d’activation</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
			<td>95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-étape cyclisme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recuit</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de cycles</td>
			<td></td>
			<td>30 cycles</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension finale</td>
			<td>8 min</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Programme d’amplification PCR. Mettre en place un thermocycleur automatisé afin de réaliser la PCR et amplifier le modèle ADN. Les réactions de PCR sont arrêtées par le froid à 4 ° C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Volume (µL) (n = 1)</td>
			<td>Volume (µL) (n = 10) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x tampon enzymatique</td>
			<td>2.5</td>
			<td>27,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzyme de restriction (5 U/µL)</td>
			<td>0,5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase-eau libre</td>
			<td>19,5</td>
			<td>214,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>22,5</td>
			<td>247,5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Enzyme de Restriction digestion des produits PCR. Préparer une solution de mélange réactionnel afin que l’enzyme de restriction sélectionné digère les produits PCR. * : Pour mettre en place une solution de mélange réactionnel pour 10 échantillons, ajouter 10 % de plus, enfin rattraper le 11 échantillons.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg"> Figure 1 : PCR amorces et enzyme de restriction RsaI. Les amorces et inverses conçus pour amplifier la portion de gène de TBXA2R de 539 bp contenant le polymorphisme du C924T. RsaI est l’enzyme de restriction choisie pour reconnaître les sites GTAC. ˅ : site de découpe de l’enzyme RsaI. C(/T) : C924T polymorphisme. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg"> Figure 2 : analyse de séquences de l’ADN et le profil électrophorétique. (A) la C924T génotype est reconnu par le PLFR modèle après digestion par l’enzyme RsaI spécifique. Analyse des séquences ADN (B) : les résultats obtenus par RFLP après digestion avec l’enzyme RsaI ont été confirmés à l’aide d’analyse de la séquence montrant le polymorphisme du C924T. Ce chiffre a été modifié De Iuliis et coll., prostaglandines &amp; autres médiateurs lipidiques6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Dans la présente étude, les auteurs décrivent une méthode pour analyser le génotype C924T. Le protocole comprend trois phases : l’extraction d’ADN, amplification en chaîne par polymérase (PCR) et analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) sur gel d’agarose.

Une méthode pour étudier le polymorphisme C924T du gène récepteur Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase identifiant des sujets plus sensibles aux processus athérothrombotiques en particulier les patients à haut risque traités avec de l’aspirine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu coûteuse, simple à utiliser, pratique, a une efficacité élevée et permet l’identification rapide des polymorphismes C924T. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu dans le domaine de l’athérothrombose, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les polymorphismes impliquant la médecine personnalisée ou des médicaments spécifiques afin de comprendre la réponse individuelle pharmacologique.Le Docteur Sebastiano Ursi, technicien de notre laboratoire, démontrera l’intervention. Pour préparer le tampon Tris EDTA au pH 8.0, ajouter 200 microlitres de 0,5 molaire EDTA et un millilitre d’un chlorure tris molaire dans un bécher, puis ajuster le volume à 100 millilitres avec de l’eau stérile et les conserver à température ambiante. Ensuite, préparez un litre de solution de stock 10X de tampon d’électrophoresis en ajoutant tous les reagents, puis stockez le tampon à température ambiante.Ensuite, préparez le colorant de chargement de gel en ajoutant tous les reagents puis apportez le volume à 100 millilitres avec de l’eau stérile. Une fois préparé, conserver le colorant à quatre degrés Celsius pendant quelques mois. Ajouter 450 millilitres d’eau à 50 millilitres de tampon TBE 10X pour préparer une solution de tampon TBE 1X.Ajouter quatre grammes d’agarose dans 200 millilitres de tampon 1X TBE ensemble dans un bécher de 600 millilitres pour préparer 200 millilitres de gel 2% agarose. Le gel d’agarose solidifié stocké à température ambiante peut être redissolé sur un bain d’eau bouillante à 60 degrés pendant 15 à 20 minutes ou dans un four à micro-ondes pendant 35 minutes en ajoutant un petit volume d’eau pour compenser l’augmentation de la concentration d’agarose. Continuer à remuer le bécher sur un mélangeur magnétique pendant environ cinq minutes jusqu’à ce que l’agarose soit suspendue, puis chauffer l’agarose sur une plaque chaude pendant environ 10 minutes ou dans un four à micro-ondes pendant trois minutes pour qu’il se dissolve complètement.Après purification de l’ADN, mélanger délicatement les échantillons d’ADN frais à l’aide de tubes de pipetage à plusieurs reprises. Il est obligatoire d’obtenir 10 à 50 nanogrammes d’un modèle d’ADN de bonne qualité extrait d’échantillons humains. Pour cette raison, nous préférons utiliser une purification automatisée de l’ADN plutôt qu’une purification semi-automatisée ou manuelle.Pour commencer la purification, d’abord quantifier et calculer la pureté de l’ADN en mesurant les absorbants à 260, 280 et 320 nanomètres, puis diluer les échantillons à l’aide d’eau stérile. Ensuite, calibrez le spectrophotomètre. Pour constituer la réaction PCR, ajouter tous les reagents pour préparer 25 microlitres de mix master PCR dans un tube de microamplification de 0,2 millilitre.Placez ensuite les tubes PCR dans un thermocycleur automatisé et amplifiez les échantillons d’ADN purifiés. Une fois le programme terminé, arrêter la réaction en laissant les tubes à quatre degrés Celsius. Ajouter 10X enzyme tampon cinq unités par enzyme de restriction microlitre dans l’eau libre de l’ADN à un volume de 22,5 microlitres.Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres de produit PCR à un nouveau tube PCR puis ajoutez les 22,5 microlitres du mélange de digestion de restriction au produit PCR. Incuber le mélange maître de digestion de restriction de produit de PCR à 37 degrés Celsius pendant quatre heures, puis ajouter 0.5 microgramme par millilitre de bromure d’Ethidium pour tacher le gel pendant 10 minutes. Verser le gel sur le plateau de gel avec le peigne bien en place pour que le gel se solidifie.Maintenant, versez la boîte de gel avec tampon 1X TBE jusqu’à ce que le gel est couvert. Utilisez des pointes fines pour charger six microlitres de l’ADN digéré amplifié dans les puits formés dans le gel, puis ajoutez un marqueur d’ADN aussi dans un parallèle distinct avec l’échantillon. Ensuite, allumez l’unité d’électrophorèse.Afin d’identifier le polymorphisme génétique C924T dans le gène TBXA2R, l’analyse RFLP est effectuée. Dans le gel, il affiche deux bandes à 395 et 144 paires de base pour la version sauvage de l’allèle majeur, tandis qu’une seule bande à 539 paires de base pour la version mutante de l’allèle mineur est vu indiquant aucune coupe par l’enzyme de restriction. Fait intéressant, trois groupes de 395, 144 et 539 paires de base sont présents pour l’allèle hétérozygote.Ensuite, le polymorphisme C924T est confirmé à l’aide de l’analyse des séquences. La séquence mise en surbrillance représente le polymorphisme. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en environ huit heures si elle est effectuée correctement.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que cette méthode ne peut être utilisée que pour un petit nombre de snips et le pour quelques échantillons dans une session de travail. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse snip peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme l’importance d’autres voies impliquant des processus athérothrombotiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie moléculaire pour explorer les variations génétiques exceptionnelles dans ce début de développement et de progression.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer le génotype des récepteurs Thromboxane A2 en ce qui concerne le polymorphisme C924T à l’aide de l’analyse gel électrophoresis des échantillons PCR-RFLP. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’ethidium et des sources de lumière UV peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que des gants, des lunettes de sécurité, ou un masque facial et d’autres dispositifs de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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