Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

L’objectif global de cette méthodologie est de générer des plantes transgéniques portant des insertions intactes en une seule copie d’un ADN de transfert, ou ADN-T, de manière efficace. Le vecteur BIBAC-Gateway est un outil précieux pour générer des plantes transgéniques qui portent des insertions intactes en une seule copie de séquences d’intérêt qui montrent une expression génique stable. Avec le vecteur BIBAC-Gateway, on peut utiliser la technologie de recombinaison Gateway pour insérer des séquences d’intérêt avec un minimum d’effort.

Tous les dérivés de BIBAC, y compris les vecteurs BIBAC-Gateway, conviennent au transfert de gros fragments d’ADN transgéniques dans les génomes des plantes. Les vecteurs BIBAC-GW peuvent être utilisés pour insérer des séquences d’intérêt dans de nombreux systèmes végétaux, tels que le maïs, le riz et la tomate. Deux plasmides BIBAC-GW sont disponibles.

Le plasmide BIBAC-RFP-GW contient un gène DsRed qui est exprimé dans les téguments des graines. Le plasmide BIBAC-BAR-GW contient un gène de résistance au glufosinate. Les deux vecteurs contiennent un gène résistant à la kanamycine comme marqueur de sélection chez les bactéries.

Pour insérer les séquences d’intérêt dans le vecteur binaire, préparez d’abord l’entrée de passerelle et les vecteurs binaires, comme décrit dans le protocole texte. Pour réaliser une réaction Gateway, préparez la réaction de recombinaison LR selon les suggestions du fournisseur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à température ambiante. Mélangez 100 à 300 nanogrammes du clone Entry superenroulé et 300 nanogrammes du vecteur BIBAC-Gateway.

Ajustez le volume du mélange à 16 microlitres avec TE. Enfin, ajoutez quatre microlitres de mélange d’enzymes LR Clonase, et mélangez par vortex. Incuber le mélange à 25 degrés Celsius pendant une heure. Terminez la réaction LR en ajoutant deux microlitres de solution de protéinase K au mélange.

Mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avant de procéder à la transformation en E. coli, comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les plantes d’Arabidopsis à la transformation, cultivez les plantes d’Arabidopsis dans une serre ou une chambre de croissance à climat contrôlé jusqu’à ce qu’elles fleurissent. Clipsez les premiers boulons pour permettre à d’autres boulons secondaires de sortir.

Les plantes sont prêtes à tremper quatre à six jours après la coupe, lorsque les plantes ont de nombreux capitules immatures et peu de siliques fertilisés. Pour effectuer un trempage floral, trempez les inflorescences pendant cinq à 10 secondes dans la suspension d’Agrobacterium. Utilisez une agitation douce.

Enveloppez les parties aériennes des plantes dans du film alimentaire pour maintenir l’humidité élevée et couvrez les pots de fleurs avec une boîte pour garder les plantes dans l’obscurité. Incuber les plantes pendant deux jours dans une serre ou une chambre de croissance. Au bout de deux jours, retirez la boîte et le film alimentaire et faites pousser les plantes jusqu’à maturité dans une serre ou une chambre de croissance.

Pour augmenter l’efficacité de la transformation, les mêmes plantes peuvent être re-trempées sept jours après le premier trempage. Ensuite, lorsque les plantes transformées sont matures et sèches, récoltez les graines. Mettez en commun et analysez les graines de plantes transformées avec la même construction en un seul ensemble.

Dans le cas où les plantes sont transformées avec un dérivé plasmidique de BIBAC-RFP-Gateway, identifiez les plantes transgéniques en analysant les graines à l’aide de la microscopie à fluorescence. Pour détecter l’expression de DsRed dans les téguments, imagez les graines à une excitation de 560 nanomètres et une émission de 600 à 650 nanomètres. Séparez les graines fluorescentes de leurs homologues non fluorescentes à l’aide d’une pince.

Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé plasmidique de BIBAC-BAR-Gateway, semez les graines dans des plateaux remplis de terre. Assurez-vous d’un étalement uniforme des graines sur les plateaux en suspendant les graines dans de la gélose à 0,1 % dans un milieu MS 0,5x, et étalez les graines à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Stimulez la germination des graines de manière synchrone en les incubant pendant au moins deux jours à quatre degrés Celsius.

Cela peut être fait avant ou après le semis des graines. Deux et trois semaines après le semis des graines, vaporisez les semis avec une solution de glufosinate-ammonium à 0,5 %. Utilisez 500 millilitres de solution de glufosinate-ammonium par mètre carré.

Transférez les semis survivants dans des pots. Analyser les plantes résistantes au glufosinate-ammonium par PCR pour la présence de la construction d’intérêt. Déterminer le nombre d’intégrations d’ADN-T et leur intégrité par transfert d’ADN à l’aide d’enzymes de restriction.

Cette méthode permet d’identifier des intégrations uniques ou répétées au même loci ou à des loci différents dans le génome. Utilisez une série de digestions de restriction pour identifier les différents modèles d’intégration possibles. Sélectionner une enzyme qui coupe une fois au milieu de l’ADN-T, pour pouvoir sonder indépendamment les séquences en amont et en aval du site de restriction.

Sélectionnez également une enzyme ou une combinaison d’enzymes en coupant toute la séquence d’intérêt à la fois. Veillez à n’utiliser que des enzymes de restriction qui ne sont pas sensibles à la méthylation de la cytosine. Après avoir effectué le transfert d’ADN, comme détaillé dans le protocole de texte, effectuez une analyse par transfert.

L’analyse dépend de la stratégie de restriction utilisée. Lors de l’analyse du transfert à l’aide de la stratégie avec un site de restriction au milieu de l’ADN-T, comptez le nombre de fragments détectés. Dans cette stratégie, le nombre de fragments hybridés suggère le nombre d’intégrations d’ADN-T.

Comparez le nombre de fragments détectés à l’aide d’une sonde pour le côté gauche et le côté droit de l’ADN-T. Si un nombre différent de fragments en cours d’hybridation est détecté avec les deux sondes, alors soit plusieurs intégrations d’ADN-T dans une répétition inversée, soit des ADN-T incomplètement intégrés sont présents. Pour identifier les arrangements en tandem et inversés des ADN-T, estimer la taille des fragments en hybridation sur le transfert en fonction de la taille des bandes de marqueurs, et comparer les tailles estimées avec les tailles de fragments attendues calculées sur la base de la stratégie de restriction.

Pour examiner si la séquence transgénique d’intérêt est intacte, analysez le blot préparé selon la stratégie avec des sites de restriction aux extrémités de la séquence d’intérêt. Estimez la taille des fragments en hybridation sur le transfert en fonction de la taille des bandes de marqueurs et comparez-la à la taille attendue. Une insertion intacte produit un seul fragment d’une longueur définie.

Tout écart par rapport à la longueur attendue indique une intégration incomplète. La stratégie de restriction et de transfert de l’ADN pour déterminer le nombre et l’intégrité des intégrations de l’ADN-T est présentée. Le site de restriction ScaI divise la séquence rapporteure en parties proximales de la bordure gauche qui sont détectées lors de l’utilisation d’une sonde pour la barre et les parties proximales de la bordure droite qui sont détectées lors de l’utilisation d’une sonde pour eYFP.

Les sites de restriction BglII et PciI sont positionnés dans l’ADN-T, en dehors de la construction du rapporteur. Une double digestion aboutit à un fragment de taille définie, et tout écart est une indication d’insertions incomplètes. Le nombre de fragments hybridants identifiés reflète le nombre d’insertions d’ADN-T.

Un transfert contenant l’ADN génomique de neuf transgéniques digérés avec ScaI a été hybridé avec des sondes pour bar et eYFP. Plusieurs voies indiquent les transgéniques avec des intégrations uniques d’ADN-T. La quatrième voie affiche deux fragments avec une barre et un avec eYFP, indiquant soit une troncature de la séquence eYFP, soit une répétition inversée autour de la bordure droite.

La voie six affiche deux fragments avec bar et eYFP. Un fragment a une faible intensité avec la sonde bar. L’autre fragment a une intensité élevée, indiquant deux insertions d’ADN-T, dont l’une est tronquée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’incorporer votre séquence d’ADN d’intérêt dans un vecteur binaire BIBAC-GW à l’aide de la recombinaison Gateway, suivie de la transformation d’Arabidopsis, du criblage et de l’évaluation du nombre d’intégrations d’ADN-T et de leur intégrité. La génération et la caractérisation de plantes transgéniques prennent beaucoup de temps. Lors de l’utilisation de BIBAC-Gateway en tant que vecteur binaire, le processus d’identification des transgéniques avec des intégrations intactes et à copie unique peut être raccourci.

Environ la moitié des transgéniques générés avec des dérivés BIBAC portent des intégrations intactes à copie unique. En général, les individus ne se rendent pas compte que de nombreuses plantes transgéniques générées à l’aide de vecteurs binaires communs portent des copies tronquées d’un transgène ou de transgènes qui présentent un silençage génique. Avec les dérivés BIBAC, la plupart des plantes transgéniques générées portent des intégrations intactes et uniques d’un transgène qui montrent rarement un silençage génique.

Lors de l’utilisation de BIBAC-GW pour générer des transgéniques, il est important de transformer un nombre suffisant de matières végétales, car l’efficacité globale de transformation des dérivés de BIBAC est inférieure à celle des vecteurs binaires couramment utilisés. L’efficacité de transformation de BIBAC-GW est généralement comprise entre 0,2 % et 0,5 %Après avoir identifié des plantes transgéniques porteuses d’intégrations d’ADN-T intactes et à copie unique, si nécessaire, une analyse plus approfondie peut être effectuée pour définir l’emplacement génomique précis de l’insertion de l’ADN-T. Les transgéniques avec des intégrations intactes et à copie unique montrent des niveaux d’expression comparables des transgènes.

Cela indique que la position d’intégration de l’ADN-T dans le génome a peu d’effet sur le niveau d’expression du transgène.