Name: Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez la génération de plantes transgéniques avec insertions uniques intactes de T-DNA en utilisant le vecteur binaire BIBAC-GW. Cette méthode optimise la transformation d'Arabidopsis et assure une expression génique stable.

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Cette recherche est soutenue par le hollandais STW Foundation Technology (12385), qui fait partie de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), et qui est financé en partie par le ministère des affaires économiques (OTP Grant 12385 à MS).  Nous remercions Carol M. Hamilton (Cornell University, Etats-Unis) pour la fourniture de pCH20, l’épine dorsale des vecteurs BIBAC-GW.

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<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
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<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Critique pour générer des organismes transgéniques avec des intégrations unique et intactes d’un transgène est le choix du vecteur binaire utilisé. Vecteurs de famille BIBAC ont été utilisés pour livrer les séquences des intérêts de nombreuses plantes espèces23,24,25,26,27,28. Vecteurs BIBAC, y compris BIBAC-GW, rendement exe...

Lors de la génération de plantes transgéniques, généralement l’objectif est d’avoir les transgènes intégrés exprimée de façon stable. Ceci peut être réalisé par intégrations exemplaire intact d’un transgène. Plusieurs intégrations peuvent conduire à une augmentation de l’expression d’un transgène, mais aussi de silençage génique. Silencieux d’échappement de transgènes est plus probable si les séquences insérées sont disposées en tandem ou des séquences inversées répétées1,2,3,4. Vecteurs binaires servent de navettes à Agrobacterium-médiée par des expériences de transformation pour livrer les séquences d’intérêt dans les génomes de plantes. Le nombre d’intégrations dans un génome végétal dépend du nombre de copies du vecteur binaire à Agrobacterium tumefaciens5,6. Beaucoup de vecteurs binaires couramment utilisés sont des vecteurs d’élevé de copies et donnent donc un nombre de copies de transgènes moyenne haute : copies de 3,3 à 4,9 dans Arabidopsis5.
Le nombre d’intégrations de l’ADN-T peut être abaissé à l’aide de vecteurs binaires qui ont un certain nombre de faibles copies dans a. tumefaciens, tels que BIBAC7, ou en lançant un ADN-T de l’a. tumefaciens du chromosome5. Le nombre moyen d’intégrations de transgene dans de tels cas est inférieur à 25,8,9,10. Car elle a été exemplaire unique dans a. tumefaciens et aussi chez Escherichia coli, BIBAC-dérivés peuvent maintenir et livrer des constructions plus grandes que 150 Ko,11.
GW-compatible BIBAC vecteurs10,12 permettre une introduction facile des gènes d’intérêt dans le vecteur à l’aide de clonage Gateway. L’utilisation de la technologie de passerelle qui simplifie grandement la procédure de clonage, mais aussi permet de surmonter les problèmes communs associés à13,grands vecteurs de basse-copie-numéro14, comme un faible rendement de l’ADN et une sélection limitée de restriction uniques sites disponibles pour le clonage de7,11. Les dérivés pBIBAC-GW sont disponibles avec une résistance au Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescence dans les téguments (pBIBAC-DP-GW) de sélection dans les végétaux (Figure 1)10,12. Pour les deux vecteurs, un gène de résistance kanamycine est utilisé comme marqueur de sélection chez les bactéries.
Combinent les vecteurs pBIBAC-GW : (1) simplifie la conception et la manipulation génétique chez e. coliet (2) intact simple copie intégrations en planta à haute efficacité. Le rendement des vecteurs pBIBAC-GW intégrations moyenne 1,7 chez Arabidopsis avec environ la moitié des plantes transgéniques portant un seul intégré l’ADN-T10.
L’expression stable de transgènes est une exigence pour la plupart transgéniques générées. Expression du transgène stable est possible par des intégrations intactes, exemplaire unique. Toutefois, travailler avec des plantes transgéniques porteuses intégrations intactes, exemplaire unique est encore plus important si, par exemple, le but est d’étudier l’efficacité des processus axés sur la chromatine, tels que la mutagénèse, recombinaison, ou la réparation et la dépendance à l’égard de ces processus sur l’emplacement de la génomique et la structure de la chromatine au site d’insertion. Pour notre intérêt, pour étudier la dépendance de la mutagénèse oligonucléotide réalisé (ODM) sur le contexte local de génomique, un ensemble de lignes de journaliste avec des intégrations intacts, de la simple copie d’un gène rapporteur de mutagenèse a été généré (Figure 2)10. À l’aide de cet ensemble de lignes, il a été démontré que l’efficacité de l’ODM varie entre locus transgéniques intégrés à différents endroits de génomiques, malgré les niveaux d’expression de transgènes plutôt semblables.

<table><tbody><tr><td>Sulfate de kanamycine monohydraté</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamycine</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 cellules compétentes</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) par Invitrogen ou toute autre souche résistante au ccdB E. coli peut être utilisée à la place. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Cellules compétentes DH10B</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR clonase enzyme mix&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique dihydraté</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodique dihydraté</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose monohydraté</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation, espace de 0,1 cm</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltose monohydraté 90 %</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog medium</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinate-ammonium (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes de restriction</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de</td> <td>sodiumMerck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Membrane buvard en nylon Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>ou GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr Papier buvard</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acétylé BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>ou Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium&nbsp ;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Saumon Sperme ADN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage Écran et casette au phosphore</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Imageur au phosphore</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>film alimentaire (Saran wrap)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>marqueur d’ADN ' Blauw' ; Échelle d’ADN.</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>marqueur d’ADN ' Rood' ; Échelle d’ADN</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Hexanucléotide Mix</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Large-Construct Kit</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène thermoscellable, transparent</td><td>divers fournisseurs</td><td></td><td>la largeur du tube doit être plus large que celle de la membrane de transfert</td></tr><tr><td>Thermoscelleuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre à membrane disque</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Maille d’hybridation</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de plantes transgéniques avec insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire bibac-gw

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Lors de la génération de plantes transgéniques, en général, l’objectif est d’avoir une expression stable d’un transgène. Cela nécessite une intégration unique et intacte du transgène, copies plusieurs intégrations sont souvent victimes de silençage génique. Le vecteur binaire compatible Gateway basé sur les chromosomes artificiels bactériens (pBIBAC-GW), comme les autres dérivés de pBIBAC, permet l’insertion de transgènes exemplaire unique avec une grande efficacité. Comme une amélioration à le pBIBAC originale, une cassette de passerelle a été clonée en pBIBAC-GW, afin que les séquences d’intérêt peuvent maintenant être facilement incorporés dans l’ADN (ADN-T) de transfert de vecteur par clonage Gateway. Communément, la transformation avec pBIBAC-GW se traduit par une efficacité de 0,2 – 0,5 %, selon laquelle la moitié de la transgénèse portent une intégration simple copie intacte de l’ADN-T. Les vecteurs pBIBAC-GW sont disponibles avec résistance au Glufosinate-ammonium ou DsRed fluorescence dans les téguments de sélection dans les plantes et résistance à la kanamycine comme une sélection chez les bactéries. Ici, une série de protocoles est présentée qui guident le lecteur à travers le processus de génération de plantes transgéniques à l’aide de pBIBAC-GW : à partir de recombiner les séquences d’intérêt dans le vecteur pBIBAC-GW de choix, de planter la transformation avec Agrobacterium, sélection de la transgénèse et tester les plantes pour intact et copie le numéro des inserts utilisant l’ADN buvard. Attention est accordée à la conception d’une stratégie de transfert de l’ADN de reconnaître single - et multi - multicopies intégrations à locus unique et multiple.

Grâce au système BIBAC-GW, journaliste des constructions pour l’étude des ODM dans les usines ont été généré10. Des constructions ont été conçues dans l’entrée passerelle vecteur pENTR-gm12 et insérées dans pBIBAC-BAR-GW (Figure 1) à l’aide de la réaction de recombinaison Gateway LR.
Arabidopsis ont été transformées avec pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW...

Un vecteur binaire pBIBAC-GW permet de générer des plantes transgéniques avec insertions de simple copie intactes, un processus facile. Une série de protocoles est présentée ici, qui guide le lecteur à travers le processus de génération des plantes transgéniques d’Arabidopsis et tester les plantes pour l’intégrité et de copier le nombre des plaquettes.

Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

L’objectif global de cette méthodologie est de générer des plantes transgéniques portant des insertions intactes en une seule copie d’un ADN de transfert, ou ADN-T, de manière efficace. Le vecteur BIBAC-Gateway est un outil précieux pour générer des plantes transgéniques qui portent des insertions intactes en une seule copie de séquences d’intérêt qui montrent une expression génique stable. Avec le vecteur BIBAC-Gateway, on peut utiliser la technologie de recombinaison Gateway pour insérer des séquences d’intérêt avec un minimum d’effort.Tous les dérivés de BIBAC, y compris les vecteurs BIBAC-Gateway, conviennent au transfert de gros fragments d’ADN transgéniques dans les génomes des plantes. Les vecteurs BIBAC-GW peuvent être utilisés pour insérer des séquences d’intérêt dans de nombreux systèmes végétaux, tels que le maïs, le riz et la tomate. Deux plasmides BIBAC-GW sont disponibles.Le plasmide BIBAC-RFP-GW contient un gène DsRed qui est exprimé dans les téguments des graines. Le plasmide BIBAC-BAR-GW contient un gène de résistance au glufosinate. Les deux vecteurs contiennent un gène résistant à la kanamycine comme marqueur de sélection chez les bactéries.Pour insérer les séque

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Dans cette vidéo, nous démontrons la génération de plantes transgéniques Arabidopsis exprimant un transgène stable par transformation génique artificielle bactérienne binaire basée sur des chromosomes par Agrobacterium.

Transformation génique basée sur un vecteur chromosomique artificiel bactérien binaire chez les plantes Arabidopsis : une technique pour générer des plantes transgéniques avec insertion en une seule copie

L’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont des tests fonctionnels de routine pour l’expression ectopique transitoire des gènes dans les plantes. Ces méthodes sont des tests efficaces dans les stratégies effectoromiques (résistance rapide et découverte de gènes avirulence) et cruciales pour la recherche moderne en pathologie moléculaire des plantes. Ils répondent à la demande d’analyses fonctionnelles robustes à haut débit dans les usines.

Agroinfiltration et PVX Agroinfection dans la pomme de terre et Nicotiana benthamiana

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Les méthodologies de ciblage génique peuvent être utilisées pour générer des souris transgéniques avec des allèles knockout, knock-in et marqués.  Ici, nous décrivons une méthode améliorée de recombinaison chez E. coli, que nous appelons « sous-clonage plus insertion », qui peut être utilisée pour générer rapidement des vecteurs de ciblage génique personnalisés.

Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

Ici, nous présentons un protocole de transformer le lin en utilisant Agrobacterium transformation de plante médiée par l'intermédiaire floral creux. Ce protocole est simple à réaliser et peu coûteux, mais donne un taux de transformation plus élevé que les procédés actuellement disponibles pour la transformation de lin.

Floral-Dip Transformation de lin ( Linum usitatissimum) Pour générer transgéniques descendances avec un taux de transformation élevé

Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Nous présentons ici une méthode pour générer des systèmes de transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile en remplaçant le premier exon codante des gènes avec les pilotes de la transcription. La méthode CRISPR/Cas9 met une séquence transactivateur en vertu du règlement endogène d’un gène remplacé et par conséquent facilite transctivator expression exclusivement dans des modèles spatio-temporels de gène-spécifique.

Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

Nous présentons ici les protocoles utilisant les insectes cellulaire et baculovirus protein expression pour produire de grandes quantités de protéines végétales sécrétée de cristallisation de protéines. Un vecteur d’expression baculovirus a été modifié par GP67 ou peptide signal hemolin insectes pour expression plante de sécrétion des protéines dans des cellules d’insecte.

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

Ici, nous décrivons la génération et l’application d’un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana lignes habilitante expression inductible, tissu-spécifique dans les trois méristèmes principaux, le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium.

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.

Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Découvrez la génération de plantes transgéniques avec insertions uniques intactes de T-DNA en utilisant le vecteur binaire BIBAC-GW. Cette méthode optimise la transformation d'Arabidopsis et assure une expression génique stable.

Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

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