Name: Signal Nanoprobe rapide amélioration de la synthèse de nanoparticules or In Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Apprenez à amplifier les signaux de nanosondes pour la biosensation par réduction in situ de l'acide chloroaurique sur diverses nanoparticules. Cette méthode polyvalente améliore la détection colorimétrique avec seulement dix nanoparticules.

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Financement de l’European Research Council au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / ERC Grant entente no 615458, le Conseil de recherche suédois et l’excellence Pronova Centre de technologie de protéine (VINNOVA - suédois Agence gouvernementale pour les systèmes d’Innovation) tient à reconnaître.

Sérum humain ont été obtenus conformément aux exigences légales et éthiques du pays de collection, c’est à dire. avec l’approbation d’un Comité d’éthique (ou similaire) et avec le consentement écrit du donneur.
1. préparation amélioration de la solution :
<ol><li>Préparer un tampon de pH 6 de MES 10 mM en suspendant MES sel de sodium dans l’eau désionisée. Ajuster le pH à 6 à l’aide d’une solution de NaOH 4 M.</li>
	<li>Préparer une solution de4 HAuCl dans un tampon de pH 6 MES 10 mM (solution 1) de 5 mM.</li>
	<li>Préparer une 1,027 M H2O2 solution tampon de pH 6 MES 10 mM (solution 2). Remarque : Les volumes de la solution 1 et solution 2 dépend le nombre et la taille des puces à ADN sera améliorée. Par exemple, un « microarray » de 10 x 10 mm nécessite 100 volume total μL (solution 1 + solution 2) pour s’assurer que la zone de « microarray » est en contact avec la solution de mise en valeur. Après dilution, le H2O2 doit être utilisé dans environ 30 à 45 jours.</li>
</ol>2. nanoparticules préparation :
<ol><li>Préparer les 40 nm AuNPs telle que décrite par Bastús et al. 16 a brièvement, injecter 1 mL de précurseur de4 HAuCl aqueuse 25 mM dans une solution bouillante de 2,2 mM du citrate de sodium (149 mL). Attendez qu’une couleur de vin rouge est observée. Utilisez cette solution de nanoparticules sous forme de graines pour obtenir la procédure seed-croissance.</li>
	<li>À 90 ° C, injecter 1 mL de citrate de sodium 60 mM puis 1 mL de 25 mM HAuCl4 dans la graine contenant la solution. Après 30 min, la réaction est terminée. Répéter l’étape des semences-croissance cinq fois jusqu'à obtient 40 nm nanoparticules, tel que décrit par Bastús et al.. 16
</li>
	<li>Mesurer l’absorbance UV-vis de la solution finale des nanoparticules pour déterminer la taille des nanoparticules. 17 alternativement, microscopie électronique de transmission (TEM) peut être acquis et utilisée pour déterminer la taille des nanoparticules.</li>
	<li>Préparer 90 nm AgNPs tel que décrit par Rivero et al. 18 brièvement, ajouter dimethylaminoborane (DMAB) à une solution vigoureusement agitée du poly (acide acrylique, sel de sodium) (AAP) et AgNO3. Le dernier volume de la solution est de 50 mL et la concentration finale de DMAB, AAP et AgNO3 sont respectivement de 1,6 mM, 10 mM et 3,33 mM. Remarque : 100 nm IONPs modifiées avec des groupes carboxyle et 50 nm SiNPs modifiés avec des groupes carboxyle ont été achetés.</li>
	<li>Fonctionnaliser la AuNPs avec des anticorps suivant le protocole décrit par Puertas et al. 19 brièvement, ajouter 1 mg de COOH-PEG-SH (5000 g·mol−1) à une solution de 1.2x10-9 M AuNPs (densité optique 10, do). Ajuster le pH à 12 avec une solution de NaOH 4 de M.<ol>
<li>Laissez la solution incuber pendant la nuit, à température ambiante (~ 22 ° C), dans des conditions douces en remuant.</li>
		<li>Enlever l’excès de PEG par centrifugation de la solution à 13800 x g pendant 15 min.</li>
		<li>Resuspendre le culot avec 500 μl d’eau désionisée.</li>
		<li>Incuber le AuNPs PEG modifiées avec 5 μmol de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide chlorhydrate (EDC) et 7,5 μmol de sel de sodium du N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) au pH de MES 10 mM 6 mettre en mémoire tampon pendant 30 min à 37 ° C.</li>
		<li>Enlever l’excès de EDC et sulfo-NHS en centrifugeant la solution à 13800 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de pH 6 MES 10 mM et ajouter 100 g·mL-1 d’anticorps. Laissez la solution incuber pendant 2 h à 37 ° C.</li>
		<li>Enlever l’excès d’anticorps par centrifugation de la solution à 13800 x g pendant 10 min deux fois et Resuspendre le culot dans 500 μL de 10 mM sodium phosphate pH 7,5, 0,3 M NaCl tampon. Laissez la solution incuber 30 min à 37 ° C.</li>
		<li>Retirez l’anticorps non spécifique lié par centrifugation de la solution à 13800 x g pendant 10 min deux fois et Resuspendre le culot dans 500 μL de 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tampon pH 6 MES 10 mM. Incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
		<li>Laver l’excès de BSA par centrifugation de la solution à 13800 x g pendant 10 min deux fois et resuspendant le culot dans 500 μL de tampon de pH 6 MES 10 mM.</li>
		<li>Suivez les étapes 2.5.1 par 2.5.9 pour la modification de 5 M AgNPs, 0,5 mg de IONPS et 0,5 mg de SiNPs par l’anticorps, en ajustant les quantités d’EDC et sulfo-NHS en conséquence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vertical flow épreuves sur papier :
<ol><li>Préparer les puces en déposant une concentration gradient de protéine G sur une membrane de nitrocellulose papier avec une imprimante robotique. Après l’impression, que la puces à sécher pendant la nuit à température ambiante (~ 22 ° C).</li>
	<li>Effectuer l’essai d’écoulement vertical avec la membrane enfermée dans un porte-filtre. Couler une solution de 8 M de AuNPs IgG modifiés à l’aide d’une pompe ultra-seringue à raison de 1 mL·min−1. Répétez cette étape avec une solution de 17 M IgG-modification AgNPs, 0.1 µg·ml−1 SiNPs IgG modifiés et 0,1 µg·ml−1 IONPs IgG modifiés.</li>
	<li>Laissez les microarrays sécher à température ambiante (~ 22 ° C) pendant 30 min et de les numériser en un scanner à plat avec une résolution de 4800 ppp. Enregistrer les images sous forme de fichiers TIFF 24 bits.</li>
</ol>4. référence commerciale axée sur le verre des essais :
<ol><li>Incuber les deux lames de verre pendant 120 min pour la détection de composants allergènes avec 4 différents échantillons sériques à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les puces avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Incuber une diapositive avec un anticorps IgE anti-humain conjugué fluorescent à température ambiante (~ 22 ° C) pendant 30 min. Incuber la deuxième diapositive avec anti-homme IgE anticorps modifiés AuNPs pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les puces avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Mesurer l’intensité de la fluorescence de la biopuce qui est incubée avec l’anticorps d’IgE anti-humain fluorescent avec un appareil de balayage au laser. Numériser la biopuce qui est incubée avec anti-l’humain IgE anticorps modifiés AuNPs avec un scanner de table-top pour l’acquisition de signaux colorimétrique.</li>
	<li>Après numérisation, incuber la biopuce avec la solution de mise en valeur à la température ambiante (~ 22° C) pendant 5 min.</li>
	<li>Rincer la sonde avec de l’eau désionisée et laisser sécher pendant 10 min à température ambiante (~ 22 ° C).</li>
	<li>Numériser la biopuce avec un scanner de table-top avec une résolution de 4800 ppp pour l’acquisition de signaux colorimétrique. Enregistrer les images en niveaux de gris 16 bits des fichiers TIFF.</li>
</ol>5. Microarray incubation avec la solution de mise en valeur :
<ol><li>Avant de mélanger la même quantité de solution 1 et 2 ou les mélanger directement sur la surface du capteur et s’assurer que la zone d’intérêt la biopuce est couvert avec le mélange de la solution.</li>
	<li>Laissez le capteur incuber à température ambiante avec la solution de valorisation pour vers le haut à 5 min. incubation plus longue temps peut donner sensibilité améliorée ainsi que rapport bruit/signal plus élevé, surtout pour les puces à ADN sur support papier.</li>
	<li>Laver la biopuce en l’immergeant dans l’eau désionisée une fois pendant 5 s. laisser sécher à température ambiante. NOTE : Le temps de l’étape de séchage dépend du matériau de la biopuce. Pour un « microarray » sur papier, l’étape de séchage nécessite environ 30 min. Pour un « microarray » axée sur le verre, l’étape de séchage nécessite environ 5-10 min.</li>
</ol>6. l’imagerie analyse :
<ol><li>Analyser les intensités de fluorescence avec outil logiciel. Examiner tous les résultats qui sont égales ou supérieures à 0,3 Isac Standardize unités (UIP), suivant les indications d’utilisation (DfU) du fabricant capteur.</li>
	<li>Analyser les intensités colorimétriques à l’aide d’un outil logiciel. Inverser les fichiers image, mesurer l’intensité de chaque tache et calculer l’intensité moyenne des pixels. Les valeurs des points en triple permet de calculer la valeur du signal final comme une moyenne des trois intensités moyennes pixel spot.</li>
</ol>

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<li>Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetically+controlled+seeded+growth+synthesis+of+citrate-stabilized+gold+nanoparticles+of+up+to+200+nm%3A+size+focusing+versus+Ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening.</a> Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Actuellement, techniques d’amélioration de signal pour des dosages avec détection de nanoprobe sont soit à base d’enzymes12, nécessitent une deuxième série de nanoparticules pour cibler la détection NANOSONDES21 ou, dans le cas des techniques de coloration, sont limitées à l’utilisation de AuNPs ou diffuses comme sondes de détection. 22 ici, une méthode simple, rapide et sans enzymes est décrite pour l’amélioration du signal d’essais axés sur la détection de nanoprobe. Avec cette méthode, il était possible d’améliorer le signal colorimétrique fourni par 4 types de NANOSONDES : AuNPs, diffuses, IONPs et SiNPs.
Le coefficient d’amplification observées pour chaque ensemble de NANOSONDES était de 100 fois, à l’exception de la SiNPs où la quantification du facteur de mise en valeur n’était pas possible due à l’absence de mise en valeur des signaux. Ce facteur d’amélioration suggère que l’efficacité du protocole est semblable dans tous les types de NANOSONDES. En outre, lorsque le protocole de mise en valeur a été réalisée sur un support papier, où une série de dilutions d’une suspension de AuNPs stock a été imprimée, on a observé un facteur de 10000-fold amplification. Antérieure à la mise en valeur, les taches visibles avec le nombre le plus bas de AuNPs étaient où environ 10000 nanoparticules ont été imprimés, après la mise en valeur les endroits contenant des nanoparticules de moins de 10 sont devenus visibles. 20
Les conditions fixées pour le protocole de mise en valeur ici présenté ont permis en profitant de la réduction d’UA3 + Au0 pour l’amélioration de signal, tout en conservant le bruit de fond à un minimum. L’amélioration peut être effectuée immédiatement après que l’analyse est réalisée ainsi que sur les puces à ADN qui ont été entreposés pendant jusqu'à plusieurs mois après le test a été réalisé. La solution d’amélioration est constitué d’un mélange de 1:1 de la solution 1 et 2. Les deux solutions peuvent être préalablement mélangées ou directement mélangées quand reversé sur la biopuce. La différence entre le mélange préalable ou mélange direct affecte seulement la durée de vie de la solution d’amélioration. Lorsque prémélangé, la durée de vie est de 5 à 7 jours, passant à 30-45 jours si non prémélangée.
Une analyse plus approfondie des résultats a montré que la méthode de mise en valeur n’interfère pas avec l’analyse quantitative de la biocapteur. Une corrélation linéaire entre l’intensité observée et la concentration de l’analyte est maintenue (tableau 1). Les données obtenues pour 4 échantillons cliniques pré caractérisées à l’aide de l’immunodosage de microarray de composant allergène à base de verre, avec détection par fluorescence standard et détection colorimétrique, a montré une bonne concordance entre les deux méthodes de détection. En comparant l’intensité de fluorescence moyenne (IFM) et l’intensité moyenne de colorimétrie (MCI), une moyenne de R2 = 0,79 +/-0,08 a été obtenue lorsque les données sont 10-connecté sur les deux axes. Cette expérience a montré que la méthode de mise en valeur peut être appliquée à une trousse commerciale si elle utilise les NANOSONDES pour la détection ou peut être adapté pour la détection de nanoprobe.
L’efficacité de méthode de mise en valeur s’appuie sur deux aspects critiques. Il est important de veiller à ce que le mélange de la solution 1 et 2 de la solution est homogène. Sans un mélange homogène, le capteur sera en contact avec des fractions de la solution d’amélioration où la solution 1 ou 2 est prédominante par rapport à l’autre. Qui permettra de réduire l’efficacité de la réduction d’UA3 + Au0, endommageant ainsi l’efficacité de la mise en valeur. Il est également important d’avoir toute la zone d’intérêt de la biopuce en contact avec la solution de mise en valeur au cours de la période d’incubation.
Pour atteindre ultrasensible mise en valeur d’un signal, un temps d’incubation plus long (environ 5 min) avec la solution d’amélioration sera nécessaire. Pour éviter le développement de bruit de fond qui peut interférer avec l’acquisition du signal, la surface de microréseau devrait être précédemment bloquée (par ex. BSA, PEG) à empêcher rapid dépôt non spécifique de formation de0 et par conséquent d’une médaille d’or couche.
Une limitation à la méthode de mise en valeur est l’efficacité intrinsèque du dosage. Le test requiert avoir des témoins négatifs et positifs quant à veiller à ce que l’amélioration du signal observé peut être attribuée à des résultats positifs true. S’il y a une interaction non spécifiques de la NANOSONDES avec la cible, signaux acquis après que la mise en valeur ne sera pas valide.
Autres techniques d’amélioration sont basés sur une agrégation de nanoparticules ou coloration des nanoparticules avec un matériau qui permet l’acquisition de signal amélioré. En favorisant le rassemblement du nombre de nanoparticules sur le site de la détection, l’acquisition de signal sera possible soit visuellement ou mesures UV-Vis. 5 techniques d’amélioration de ces signaux s’appuient sur un système de détection en deux étapes, la détection initiale de l’analyte d’intérêt et une seconde étape où le déclarant est tenu à lier à la construction de détection initiale. Ces stratégies n’ont pas universalité en raison de l’exigence de l’optimisation des protocoles de mise en valeur spécifique pour chaque type d’essai.
Les techniques de coloration mise en valeur, tels que l’argent souillant, beaucoup comme le protocole présenté ici, permettent l’amélioration directe des constructions de détection de signal. Toutefois, contrairement au protocole qui est montré ici, coloration à l’argent a seulement été démontrée à appliquer à AuNPs ou diffuses. 6 , 7 , 8 , 9
L’applicabilité de cette méthode pourrait probablement couvrent toute analyse qui utilise AuNPs, diffuses, IONPs ou SiNPs comme agents de détection. Poursuite des travaux sont réalisé afin d’étudier l’application de la méthode dans les capteurs constitués d’autres matériaux.

L’utilisation des nanomatériaux comme les nanoparticules d’or (AuNPs) ou de nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs) a permis des applications en biodétection avec une polyvalence et une sensibilité améliorée. 1 la pléthore de méthodes mises au point pour la décoration de la surface des nanoparticules avec différents ligands, quant à tirer parti de leur surface élevée au rapport de volume, ont permis la conception de capteurs avec une sensibilité améliorée. 2 néanmoins, un outil de biodétection dépend du nombre de NANOSONDES nécessaire pour obtenir un signal détectable. Par exemple, dans le cas de 40 nm AuNPs, d’acquérir un signal par spectroscopie UV-vis, environ 90 × 106 NANOSONDES est nécessaire afin de détecter efficacement la cible d’intérêt. 3 cette limitation de la densité de nanoprobe peut être contournée par l’utilisation de l’amplification du signal. Ces stratégies4 peut reposer sur l’agrégation interparticulaires ou agglomération, où la densité des NANOSONDES initial est augmentée en accumulant une deuxième série de NANOSONDES lors de la première. 5 la multiplication des nanoparticules à un endroit donné sur une surface de capteur permet de visuel ou acquisition de signaux UV-visible. Cependant, la sensibilité du dosage sera intrinsèquement liée à la capacité de ciblage de la deuxième série de nanoparticules vers l’ensemble initial des NANOSONDES. Autres stratégies reposent sur la coloration des NANOSONDES or et d’argent. 6 , 7 la coloration est obtenue par la réduction des ions d’argent sur la surface des nanoparticules, permettant un visuel ou la détection UV-vis. 8 ces méthodes d’améliorer le signal existant or ou argent NANOSONDES en potentialisant le plasmon de surface résonance du signal, ne dépendant pas des événements ciblant secondaires comme dans les méthodes interparticulaires agglomération. Cependant, les méthodes de coloration argent seulement ont avec utilisation de NANOSONDES or ou d’argent. 8 , 9
En 2005, Zayats et al. 10 a signalé la réduction des ions sur la surface d’or NANOSONDES pour augmenter le signal de résonance plasmonique de surface. Dans ce travail d’enzyme dépendante, peroxyde d’hydrogène a été généré par catalyse de glucose oxydase et avec chlorure de cétyltriméthylammonium a permis la réduction de l’acide chloraurique.
Plus récemment Wang et al. a signalé une méthode d’amélioration où une couche d’or est produite sur la surface de NANOSONDES existants. 11 ces NANOSONDES élargies affichent peroxydase-comme l’activité catalytique contre le substrat 3′, 5, 5′-tétraméthylbenzidine (TMB) qui permet la visualisation d’une couleur bleue par le œil nu.
Stevens et al. signalé l’élaboration d’un test ELISA plasmonique. 12 après la détection d’un antigène prostatique spécifique (PSA) à travers une stratégie traditionnelle d’ELISA, un anticorps secondaire marqué avec la catalase est incubé avec le capteur après quoi le capteur a été plongé dans une solution contenant du peroxyde d’hydrogène et acide chloraurique. La présence de l’anticorps secondaire de catalase modifiés (résultat positif) favoriserait la consommation d’eau oxygénée, ralentissant la réduction acide chloraurique et rendement quasi sphérique monodisperses AuNPs avec une couleur rouge. L’absence de l’anticorps modifiés catalase (résultat négatif) a permis la concentration de peroxyde d’hydrogène reste intact, ce qui favorise la réduction rapide chloraurique et rendement AuNPs avec ill-defined Phenomenon morphologies responsables par une couleur bleu/violet . La concentration du peroxyde d’hydrogène, déterminée par l’activité de la catalase, s’est avérée être corrélée à la concentration de l’analyte d’intérêt. La nécessité d’un anticorps secondaire catalase-modification et le contrôle des conditions de l’activité catalytique sont deux facteurs qui nuisent à l’universalité de cette méthode. En outre, la formation d’amas or, indépendamment de la AuNPs existant, peut introduire des problèmes de bruit de fond à la stratégie de l’amplification.
Les techniques mentionnées ci-dessus, comme bien d’autres13,14,15, ont rendu possible pour les biocapteurs axée sur les nanoprobe d’atteindre les limites de détection à égalité avec les techniques traditionnelles.
Ici, une méthode nouvelle amélioration or est démontrée, où le signal d’un nanoprobe existant est amplifié par potentialisant ou présentant un signal de résonance plasmonique de surface. Après la détection est réalisée avec l’utilisation de l’or, argent, silice ou nanoparticules d’oxyde de fer, le capteur est permis pour l’incubation avec une solution d’un mélange de peroxyde d’hydrogène et acide chloraurique dans 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acide tampon de pH 6 (MES). Les concentrations des composants de la solution d’amélioration ont été optimisées pour favoriser le dépôt Au0 sur la surface de NANOSONDES existants. Pour tous a étudié les types de nanoprobe, c’est à dire. AuNPs, nanoparticules d’argent (AgNPs), des nanoparticules de silice (SiNPs) et IONPs, la formation d’une couche mal définie donné ou augmentée la diffusion de la lumière qui a donné lieu à un signal visible détectable ou accru. Une augmentation de signal avec un coefficient d’amplification 100 fois a été réalisée pour NANOSONDES en papier et puces à base de verre et le processus prend moins de 5 min d’acquérir un signal. L’acquisition de signal pourrait être faite à l’oeil nu, spectroscopie UV-visible ou outils bas de gamme comme un appareil photo numérique ou un scanner plateau d’imagerie. En outre, il a été démontré que ce protocole d’amélioration peut s’appliquer facilement lors d’un test diagnostique allergie commercialement disponibles sans nécessiter d’optimisation spécifique.

<table><tbody><tr><td>Acide chloroaurique</td><td>Sigma-Aldrich 254169</td><td>ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylaminoborane&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acide acrylique, sel de sodium)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm nanoparticules magnétiques</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm nanoparticules de silice</td><td>Corposculaire</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp ;</td><td>RAPP Polymère</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&nbsp ; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>CHLORHYDRATE DE N-(3-Diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&nbsp ; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide sel sodique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&nbsp ; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA IgG</td><td></td></tr> anticorps <tr><td></td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp ; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en papier nitrocellulosique</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 imprimante robotisée</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porte-filtre</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Pompe à ultrasyring</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner à plat CannonScan Canon 9000F Mark II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human IgE anti-IgE modifié AuNPs&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balayage laser LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner de table Scanner d’images Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame en verre ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgE anti-humain conjugué par fluorescence&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d’images de microréseaux Phadia MIA 1.2.4&nbsp ;</td><td>Thermopêcheur</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

signal nanoprobe rapide amélioration de la synthèse de nanoparticules or in situ

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

L’utilisation de NANOSONDES tels qu’or, argent, silice ou nanoparticules d’oxyde de fer comme réactifs de détection dans les essais bioanalytiques pouvez activer haute sensibilité et commode lecture colorimétrique. Toutefois, les fortes densités de nanoparticules sont généralement nécessaires pour la détection. Les protocoles disponibles sur la mise en valeur d’axée sur la synthèse sont soit limitée à l’or et l’argent des nanoparticules ou s’appuient sur l’optimisation et contrôle enzymatique précis. Nous présentons ici un protocole visant à améliorer l’affichage de la colorimétrie d’or, argent, silice et d’oxyde de fer NANOSONDES. On a fait observer que le signal colorimétrique peut être amélioré par jusqu'à un 10000-fold facteur. La base de ces stratégies de mise en valeur de signal est la réduction chimique du Au3 + Au0. Il y a plusieurs réactions chimiques qui permettent la réduction d’UA3 + Au0. Dans le protocole, de Good tampons et H2O2 sont utilisées et il est possible de favoriser la déposition Au0 sur la surface de NANOSONDES existants, au détriment de la formation de nouvelles nanoparticules d’or. Le protocole se compose de l’incubation de la biopuce avec une solution composée d’acide chloraurique et H2O2 dans 2-(N-morpholino) tampon de pH acide 6 ethanesulfonic après le test de détection basée sur les nanoprobe. La solution d’amélioration peut être appliquée pour le papier et capteurs à base de verre. En outre, il peut être utilisé dans les immunoessais disponibles dans le commerce comme en témoigne l’application de la méthode à un allergène commercial microarray. Le développement de signal nécessite moins de 5 min d’incubation avec la solution de mise en valeur et la lecture peut être évaluée par l’oeil nu ou matériels d’acquisition d’image bas de gamme comme un scanner de table-top ou un appareil photo numérique.

Après qu’un test est effectué, à l’aide de NANOSONDES comme agents de détection, la zone de détection du capteur peut être remplie avec NANOSONDES (Figure 1a). Si le nombre de NANOSONDES est inférieure à la limite pour une détection visuelle, la détection de l’analyte est, au départ, considérée négative. En utilisant le protocole présenté ici (Figure 1b), le signal de la NANOSONDES est potentialisé en introduisant une couche mal définie d’UA (Figure 1c).
Un immuno-essai sur papier, conçu pour la détection des protéines G a été réalisée pour démontrer l’efficacité du protocole de mise en valeur (Figure 2). AuNPs, diffuses, SiNPs et IONPs ont été modifiés avec des anticorps IgG et utilisés et agents de détection. Papier microarrays ont été préparés pour avoir une pente d’un certain nombre de molécules de protéines G par endroit.
Après le dosage a été effectué, on a observé que IgG mis à jour le AuNPs (IgG-AuNPs) ont été en mesure de détecter aussi bas que 2 molécules de5 × 10 par endroit (Figure 2a), IgG, mis à jour le AgNPs (IgG-AgNPs) ont pu déceler aussi bas que 2 × 104 molécules par endroit (Figure 2c), IgG modifié IONPs (IgG-IONPs) ont pu déceler aussi bas que 2 molécules de7 × 10 par spot (Figure 2e) et IgG modifiés n’étaient pas en mesure de fournir un signal visuel ( de SiNPs (IgG-SiNPs) Figure 2g).
En incubant les puces avec la solution de mise en valeur, il était possible d’augmenter le signal de 100 fois dans les différents types de nanoparticules utilisées. Dans le cas de SiNPs, la solution d’amélioration a permis d’observer un signal lorsqu’aucun signal visuel a été observée sans la solution de mise en valeur (Figure 2b, 2d, 2f et 2 h).
On a évalué la possibilité d’application de la méthode à un immuno-essai commercial existant. L’amélioration a été réalisée sur un immunodosage de microarray de composant allergène axée sur le verre. Un ensemble de 4 validé et caractérisé de sérum prélevés chez les patients allergiques ont été évalués avec le microarray (échantillons ont été désignés comme a, b, c et d). La détection fluorimétrique standard de ce test a été comparée aux taches avec anti-IgE marqué AuNPs suivie de la mise en valeur du signal (Figure 3). Avant la mise en valeur, sans taches ont été détectées sur les puces à ADN où la détection a été réalisée avec anti-IgE marqué AuNPs. Après amélioration, plusieurs points ont été visibles à le œil nu et leur intensité a été enregistrée par la numérisation de l’image (Figure 3). Avec la détection de la fluorescence, une variété de spots ont été détectés (Figure 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Figure 1 . Illustration des étapes un microspot subit d’analyte détection de signal amélioré. (a) deux anticorps modifiés NANOSONDES après la détection d’un analyte immobilisé sur un microspot, (b) d’incubation de la biopuce avec le protocole de mise en valeur et semences-croissance subséquente de l’anticorps modifiés NANOSONDES et () microspot c) où la taille de la NANOSONDES augmentée après incubation de 5 min avec la solution de mise en valeur. Ce chiffre a été dapted de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Figure 2 . Image numérisée de puces à ADN pour la détection de la protéine G. Sur la gauche de chaque « microarray » sont les microspots observées avant l’amélioration de la détection réalisée avec (un) IgG-AuNPs, (c) (e), IgG-AgNPs IgG-IONPs et (g), IgG-SiNPs. Sur la droite de chaque « microarray » sont le microspots après la mise en valeur de (b), IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs et (h), IgG-SiNPs. Chaque concentration de la protéine G a été déposée sur la biopuce en triple exemplaire. Un calcul du nombre de protéine que g se faisait selon la concentration de la protéine imprimés dans chaque microspot. Ce chiffre a été adapté de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Figure 3 . Corrélation entre l’intensité de fluorescence et intensité colorimétrique obtenue pour les tests effectués avec le test de diagnostic commercial allergie. Intensité de fluorescence (MFI) moyenne et moyenne intensité colorimétrique (MCI) mesurée pour la détection des allergènes dans les échantillons a, b, c et d. EISN est les données du journal 10 transformé dans les intervalles où nous observons une corrélation linéaire entre les deux méthodes. L’intensité de la microspots observée pour la détection basée sur l’anticorps modifiés fluorophore (Fluorophore-Ab) est émission de fluorescence. La luminosité de la microspots observée pour la détection basée sur le dosage de l’Ab-AuNPs a été obtenue après la numérisation de la biopuce et en inversant l’image avec le logiciel d’imagerie. Microarrays sont conçus pour avoir réanalysés verticales avec témoins positifs pour la détection de la fluorescence sur le fond de l’extrême-droite. Les trois autres coins sont utilisés pour l’évaluation du logiciel. Des images ont été analysés en niveaux de gris 16 bits. Ce chiffre a été adapté de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Mise en valeur préalable R2</td>
			<td>R2 après la mise en valeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. R2 valeurs pour la détection de la protéine G, avant et après la mise en valeur, à l’aide de différents jeux de nanoparticules. Les valeurs de2 R ont été obtenues après corrélation entre l’intensité des taches avec la concentration de l’analyte mesuré.

Dans ce travail, est présenté un protocole pour la mise en valeur de signal de biodétection axée sur les nanoprobe. Le protocole est basé sur la réduction de l’acide chloraurique sur la surface de NANOSONDES existants qui consistent en or, argent, silice ou nanoparticules d’oxyde de fer.

Signal Nanoprobe rapide amélioration de la synthèse de nanoparticules or In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

L’objectif global de cette procédure est d’amplifier les signaux des sondes à base de nanoparticules dans des tests effectués sur des supports en papier ou en verre. En utilisant cette méthode, vous pouvez acquérir un signal colorimétrique pour des taches contenant aussi peu que 10 nanoparticules. Le principal avantage de cette technique est sa polyvalence.Il peut être appliqué sans modification majeure à différentes nanoparticules sur du papier, du verre et potentiellement d’autres supports. Pour commencer la procédure, préparez au moins 10 millilitres d’une solution de MES de 10 millimolaires dans de l’eau désionisée. Ajustez le pH de la solution à six avec une solution d’hydroxyde de sodium à quatre molaires.Ensuite, combinez un millilitre d’une suspension molaire de 1,2 fois 10 à moins neuvième molaire de nanoparticules d’or de 40 nanomètres avec un milligramme d’alpha mercapto omega carboxy PEG et vortex le mélange. Ajustez le pH du mélange à 12 avec une solution d’hydroxyde de sodium à quatre molaires. Remuez doucement le mélange à température ambiante pendant la nuit.Ensuite, centrifugez le mélange à 3, 800 fois G pendant 15 minutes et jetez le surnageant. Remettre en suspension la pastille de nanoparticules d’or modifiées au PEG dans 500 microlitres d’eau désionisée par pipetage doux. Ensuite, dissolvez cinq micromoles d’EDC dans 250 microlitres du tampon MES de 10 millimolaires de pH six.Dissoudre 7,5 micromoles de sulfo-NHS dans 250 microlitres supplémentaires du tampon MES. Combinez ces solutions avec les nanoparticules d’or modifiées au PEG et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifugez le mélange pendant cinq minutes et jetez le surnageant.Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres du tampon MES. Ajouter à la suspension une quantité suffisante d’anticorps IgG pour une concentration d’anticorps de 100 picogrammes par millilitre. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Centrifugez le mélange pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres du tampon MES et répétez la centrifugation. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres d’un tampon de pH 7,5 de phosphate de sodium de 10 millimolaires et de chlorure de sodium de 0,3 molaire dans de l’eau déminéralisée.Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifugez le mélange pendant 10 minutes deux fois, comme décrit précédemment. Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de 1 % BSA dans un tampon MES de 10 millimolaires de pH six et incubez le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Centrifugez le mélange pendant 10 minutes deux fois. Enfin, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon MES pour obtenir les nanoparticules d’or modifiées aux IgG. À l’aide d’une imprimante robotisée, déposer des microréseaux d’un gradient de concentration en protéine G sur des membranes de nitrocellulose.Ensuite, chargez une puce dans un porte-filtre en acier inoxydable de taille appropriée. Connectez une seringue contenant une suspension de huit picomolaires de nanoparticules d’or modifiées aux IgG à l’entrée du porte-filtre. Montez la seringue sur un pousse-seringue.Installez un tube de 50 millilitres pour recueillir le débit de sortie du porte-filtre. Ensuite, faites passer la suspension à travers le porte-filtre à raison d’un millilitre par minute. Ensuite, laissez la puce sécher pendant 30 minutes à température ambiante.Nettoyez et séchez le porte-filtre avec de l’eau et du papier filtre. Numérisez la puce à écran sec dans un scanner à plat à 4 800 ppp et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF couleur 24 bits. Ensuite, préparez une solution d’acide chloroaurique de cinq millimolaires et une solution de peroxyde d’hydrogène de 1,027 molaire dans un tampon MES de pH six de 10 millimolaires.Pour prémélanger la solution d’amélioration, placez des valeurs égales des solutions d’acide chloroaurique et de peroxyde d’hydrogène dans un tube de microcentrifugation et mélangez soigneusement les solutions. Appliquez la solution d’amélioration prémélangée sur la surface du capteur de la puce à électricité. Vous pouvez également appliquer des volumes égaux de solutions d’acide chloroaurique et de peroxyde d’hydrogène sur la surface du capteur et les mélanger soigneusement directement sur le capteur.Incuber le capteur avec la solution d’amélioration pendant cinq minutes maximum, puis immerger la puce dans de l’eau déminéralisée pendant cinq secondes pour rincer la solution d’amélioration. Laissez la puce à air libre sécher à température ambiante. Répétez ce processus pour chaque micropuce à améliorer.Scannez les microréseaux améliorés et enregistrez les images. Dans un immunodosage standard sur papier, des nanoparticules d’or, d’argent et d’oxyde de fer modifiées aux IgG ont détecté des concentrations de protéine G à deux fois 10 à la cinquième, deux fois 10 à la quatrième et deux fois 10 à la septième molécule par point, respectivement. Aucun signal visuel n’a été observé à partir de nanoparticules de silicium modifiées aux IgG.L’incubation des microréseaux dans une solution d’amélioration a permis d’augmenter de 100 fois le signal à travers les nanoparticules d’or, d’argent et d’oxyde de fer. Dans le cas des nanoparticules de silicium, cette amélioration a permis d’observer un signal visuel. Cette amélioration a été appliquée à un test immunologique commercial à base de composants allergènes à base de verre de quatre échantillons de sérum humain.La coloration avec des nanoparticules d’or marquées anti-IgE et l’amélioration du signal ont donné des résultats comparables à ceux du test fluorométrique standard. La corrélation linéaire moyenne entre l’intensité moyenne de fluorescence et l’intensité colorimétrique moyenne était de 0,79. Une fois apprise, cette technique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est exécutée correctement.

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