Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

L’objectif global de ce protocole est de générer des copies de haute qualité de la banque de mutants transposons ordonnés et non redondants de la souche PA14 de Pseudomonas aeruginosa, appelée ensemble PA14NR. Ce protocole préserve l’intégrité de l’ensemble PA14NR lors de la réplication, générant des copies de haute qualité de cette bibliothèque. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit une description détaillée de toutes les étapes impliquées dans la réplication de la bibliothèque, le contrôle de la qualité et le stockage approprié des mutants individuels.

Bien que ce protocole ait été conçu pour répliquer l’ensemble P14NR, il peut être adapté pour répliquer d’autres banques bactériennes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison du risque de contamination pendant le processus de réplication. Par conséquent, ce protocole fournit des instructions détaillées, étape par étape, pour réduire ce risque.

Notre laboratoire distribue l’ensemble PA14NR à la communauté scientifique mondiale. Et nous recommandons que les bibliothèques soient répliquées par l’utilisateur final. Pour vous guider, nous proposons un protocole détaillant comment générer des copies de haute qualité de la bibliothèque.

La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle, en particulier les étapes conçues pour prévenir la contamination croisée. Pour l’autoprotection, ainsi que pour la protection des cultures bactériennes, une blouse de laboratoire, des gants et un masque doivent toujours être portés lors de la manipulation de la bibliothèque de mutants d’insertion de transposon non redondante de la souche PA14 de P aeruginosa, désignée PA14NR. Préparez les plaques de gélose LB en versant environ 60 millilitres de gélose LB fondue dans des plaques rectangulaires.

Faites sécher les plaques dans une hotte stérile pendant environ une heure avant de les utiliser. Créez un champ stérile avec un bec Bunsen sur une paillasse essuyée à l’éthanol. Et mettez en place des conteneurs avec des solutions appropriées pour la stérilisation des broches de réplication.

Retirez une plaque maîtresse de l’ensemble PA14NR du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-la sur de la glace sèche dans une casserole à glace de 4 litres. Prenez la plaque maîtresse à 96 puits à reproduire à partir de la glace sèche et placez-la sur le banc pour permettre une brève décongélation. Alignez la plaque maîtresse et la plaque de gélose avec la coordonnée A1 des deux plaques dans le coin supérieur gauche.

Marquez la position de la coordonnée A1 sur la plaque de gélose rectangulaire. Pour stériliser les broches du réplicateur, plongez les broches dans 250 millilitres d’hypochlorite de sodium de 0,3 à 0,5 % pendant 30 secondes. Tapotez légèrement le réplicateur pour éliminer l’excès de liquide et plongez les broches dans 250 millilitres d’eau stérile ultrapure pendant 10 secondes, puis 250 millilitres d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes et 250 millilitres d’éthanol à 95 % pendant deux minutes.

Stérilisez à la flamme les broches du réplicateur en tenant le réplicateur perpendiculairement à la flamme du bec Bunsen, en vous approchant lentement de la flamme jusqu’à ce que l’éthanol s’enflamme, puis en le retirant immédiatement de la flamme. La flamme s’éteindra une fois que tout l’éthanol aura brûlé. Refroidissez les broches en les épinglant sur une plaque rectangulaire inutilisée contenant de la gélose LB stérile pendant 30 secondes.

Pendant que les broches du réplicateur refroidissent, réchauffez brièvement le joint en aluminium de la plaque maîtresse du jeu PA14NR avec votre main, puis décollez-le soigneusement, en vous assurant que le joint ne retouche pas la plaque. Utilisez une pince à épiler pour décoller les restes du joint en aluminium. Insérez les broches du réplicateur dans la plaque maîtresse, en poussant et en balançant doucement le réplicateur dans les quatre directions pour vous assurer que les broches entrent en contact avec les cultures bactériennes congelées dans chacun des 96 puits.

Portez une attention particulière aux puits situés dans le bord extérieur de la plaque en poussant les broches du réplicateur contre les cultures congelées dans les puits situés au bord de la plaque. Placez délicatement les broches du réplicateur sur la surface des plaques de gélose. Déplacez le réplicateur dans un léger mouvement circulaire pour former de nombreuses pelouses d’environ quatre à cinq millimètres pour chaque souche mutante.

Scellez la plaque maîtresse de l’ensemble PA14NR avec un nouveau joint en aluminium stérile. Utilisez un rouleau à plaque pour vous assurer que chaque puits et les bords de la plaque sont complètement scellés. Remettez la plaque maîtresse à 96 puits dans la glace sèche.

Après avoir manipulé l’ensemble PA14NR, essuyez toutes les surfaces de travail avec de l’éthanol à 70 %. Transférez la plaque de gélose répliquée dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incubez pendant la nuit. Avant de commencer cette procédure, assurez-vous que la hotte à flux laminaire est exempte d’équipements inutiles et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 minutes.

Essuyez les surfaces de la hotte et tous les articles placés dans la hotte avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pipette électronique à 12 canaux de 50 à 1200 microlitres, remplissez chaque puits d’un bloc de puits de 12 millilitres de profondeur avec 525 microlitres de bouillon liquide LB contenant des antibiotiques appropriés. Scellez ensuite le bloc de puits profond avant de le retirer de la hotte à flux laminaire.

Ensuite, transférez le bloc de puits profond rempli de média sur une paillasse essuyée à l’éthanol. Créez un champ stérile avec un bec Bunsen sur la paillasse et installez des conteneurs avec des solutions appropriées pour la stérilisation des broches de réplicateur. Immergez les broches du réplicateur dans chaque solution comme indiqué précédemment.

Stérilisez à la flamme les broches du réplicateur. Ensuite, refroidissez les goupilles en les épinglant dans une plaque rectangulaire inutilisée contenant de la gélose LB pendant 30 secondes. Placez délicatement les broches du réplicateur sur la plaque de gélose contenant les souches mutantes cultivées, et vérifiez que les broches sont en contact avec les 96 mutants sur la plaque de gélose.

Ensuite, plongez les broches dans les puits profonds contenant du bouillon liquide LB pendant cinq à 10 secondes. Évitez de toucher les côtés des puits avec les goupilles. Scellez le bloc de puits profond avec une membrane d’étanchéité stérile et respirante.

Utilisez un rouleau à plaque pour vous assurer que chaque puits est correctement scellé. Essuyez toutes les surfaces de travail avec de l’éthanol à 70 % après avoir manipulé l’ensemble PA14NR. Cultivez les cultures liquides inoculées dans un agitateur à grande vitesse à 37 degrés Celsius et 950 tr/min pendant 15 à 16 heures.

Commencez par dégager la hotte à flux laminaire et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 minutes. Essuyez toutes les surfaces de la hotte et tous les articles placés dans la hotte avec de l’éthanol à 70 %. Retirez les plaques à 96 puits de la pellicule plastique.

Décollez l’étiquette de chaque plaque et placez-la le long du bord de la plaque le plus proche des puits A1 à H1 de la plaque de destination. Soulevez légèrement le couvercle de la plaque de destination et placez l’étiquette sur le bord inférieur pour afficher l’étiquette lorsque la plaque est recouverte d’un couvercle. Retirez le bloc de puits profond de l’agitateur à grande vitesse et transférez le bloc dans la hotte à flux laminaire stérile.

Retirez avec précaution la membrane d’étanchéité respirante et remplacez-la par un joint en aluminium. Faites tourner le bloc de puits profond à très basse vitesse pour recueillir la condensation. Étant donné que le transfert des cultures vers les plaques de destination présente le plus grand risque de contamination potentielle entre les puits, il est essentiel de suivre attentivement toutes les procédures pour maintenir la stérilité.

Remettez le bloc de puits profond dans le capot stérile. À l’aide d’une pipette électronique à 12 canaux de 50 à 1200 microlitres et d’embouts filtrés stériles, ajoutez 525 microlitres de mélange de bouillon liquide de glycérol LB dans chaque puits. Mélangez en pipetant doucement 300 microlitres de haut en bas trois fois avec une pipette électronique.

Touchez les pointes sur le côté des puits, avant d’injecter les pointes pour éviter les gouttes. Remplissez la pipette avec de nouveaux embouts filtrés stériles et remplissez la rangée suivante de puits avec le mélange de bouillon liquide de glycérol LB. Une fois que tous les puits ont été remplis avec le mélange de bouillon liquide de glycérol LB, utilisez la pipette électronique à 12 canaux et les pointes filtrées pour prélever 900 microlitres de mélange de culture de mutant de glycérol de chaque rangée du bloc de puits profonds, et distribuez 150 microlitres dans les puits de la rangée correspondante dans les plaques de destination pour générer six copies de la plaque de bibliothèque.

Utilisez le joint en aluminium stérile pour couvrir chaque plaque de destination de 96 puits, et utilisez un rouleau à plaque pour sceller complètement les bords de la plaque et tous les puits. Assurez-vous de ne pas couvrir l’identificateur de l’étiquette avec le sceau en aluminium. Retirez les plaques scellées de la hotte et placez-les sur une surface plane et plane dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Essuyez toutes les surfaces de travail avec de l’éthanol à 70 % après avoir manipulé la bibliothèque. À l’aide du protocole démontré dans cette vidéo, 12 copies de l’ensemble PA14NR, y compris les plaques de contrôle composées de puits de type PA14 inoculés et de puits non inoculés intercalés selon un modèle prédéfini, ont été reproduites. Les plaques témoins ont été inspectées visuellement après la réplication sur des plaques de gélose LB pour s’assurer de la présence des modèles de croissance attendus.

38 souches mutantes ont été sélectionnées au hasard à partir de l’une des copies nouvellement générées de l’ensemble PA14NR, et une amplification PCR à l’aide d’amorces arbitraires a été effectuée pour confirmer l’identité des mutants transposons. Le séquençage ultérieur des fragments d’ADN a confirmé l’identité mutante de 35 des 38 mutants testés. Une fois masterisée, la réplication de l’ensemble de la bibliothèque prend environ 80 heures.

Lors de l’utilisation de ce protocole, il est important de garder à l’esprit la stérilité de la zone de travail à tout moment. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des copies de haute qualité de l’ensemble P14NR ou d’autres banques bactériennes. N’oubliez pas que travailler avec Pseudomonas peut être dangereux et qu’un équipement de protection individuelle doit toujours être porté lors de l’exécution de ce protocole.

Ce protocole préserve la banque de mutants non redondants PA14 de Pseudomonas aeruginosa qui continue d’être une ressource importante, non seulement pour le criblage à haut débit, mais aussi comme source de mutations individuelles dans la plupart des gènes de Pseudomonas aeruginosa.