PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

L’objectif global de ce modèle est de créer un phénotype de neurotraumatisme cliniquement pertinent dans un format de 96 puits afin de faciliter la comparaison efficace et simultanée des lésions subies dans de multiples conditions expérimentales. L’objectif principal de ce modèle est de permettre des cribles de découverte de médicaments phénotypiques à haut contenu dans les neurotraumatismes, avec des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induits par l’homme. Les plaques utilisées dans ce modèle conservent la géométrie standard de l’industrie à 96 puits, en maintenant leur compatibilité avec les machines de criblage à haut contenu existantes, comme les bras robotiques et les microscopes automatisés.

Pour commencer, placez une plaque sans fond à 96 puits, côté inférieur vers le haut, à l’intérieur d’un nettoyeur plasma de 200 watts pendant 60 secondes à haute puissance. Ensuite, placez la plaque dans 200 millilitres de 1,5 % APTES fraîchement préparé dans de l’eau déminéralisée, le fond vers le bas, pendant 20 minutes dans une hotte. 10 minutes après le début de l’incubation, à l’aide d’une pince, positionnez une membrane en silicone traitée au plasma sur un rectangle de papier sulfurisé de 7,5 x 11 centimètres et alignez une plaque d’aluminium de 7,5 x 11,05 centimètres sur la partie inférieure de la pince de fabrication de plaque.

Ensuite, à l’aide d’une pince, alignez la membrane de silicone et le papier sulfurisé sur la plaque d’aluminium. À la fin de la période de revêtement, retirez la plaque sans fond du bain APTES et secouez l’excès de solution. Trempez la plaque sans fond dans deux bains-marie désionisés consécutifs de 200 millilitres pendant cinq secondes à chaque trempage et secouez l’excès d’eau.

Après un séchage complet à l’air comprimé, placez la plaque sans fond dans la partie supérieure de la pince de fabrication de la plaque et fermez doucement la pince pour presser la plaque sans fond et le silicone ensemble. Pour aligner le bloc de pénétrateur, utilisez des pinces de platine pour fixer la plaque sur la platine de l’appareil d’étirement sous une caméra avec un flux en direct, et placez un plafonnier sur l’appareil. Lancez le logiciel de contrôle de l’instrument sur l’ordinateur connecté à l’appareil de blessure et cliquez sur la fenêtre de lancement pour exécuter le projet de neurotraumatologie in vitro.

Dans la fenêtre du projet, double-cliquez sur les instruments virtuels Motion Control et suivi de position. Fermez la cage entourant l’appareil de blessure et cliquez sur la flèche dans l’instrument virtuel de contrôle de mouvement pour faire fonctionner l’instrument. Cliquez sur le bas pour abaisser la platine à moins de deux millimètres du contact avec les pénétrateurs, puis cliquez sur arrêter pour arrêter l’instrument virtuel.

Dans la fenêtre du projet, faites un clic droit sur Axis One, puis cliquez sur Panneau de test interactif. Entrez 500 unités dans le champ Position cible de la fenêtre qui s’affiche pour définir la taille du pas sur 50 micromètres. Cliquez ensuite sur Aller à plusieurs reprises, jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec des pénétrateurs, en vérifiant le contact sur l’image en direct affichée par la caméra.

La position verticale de la scène sera indiquée en haut à gauche de la fenêtre du panneau de test interactif. Abaissez davantage la plaque jusqu’à ce que chaque puits soit entré en contact avec les pénétrateurs, en déplaçant la caméra et la platine si nécessaire pour voir la plaque entière. Notez la position verticale de la scène signalée lorsque tous les poteaux sont en contact et fermez le panneau de test interactif.

Ensuite, exécutez l’instrument virtuel de contrôle de mouvement et cliquez sur Haut pour soulever la scène, en utilisant le bouton d’arrêt pour arrêter l’instrument virtuel lorsque la scène est en position. Ouvrez la porte pour désactiver l’appareil, puis desserrez la vis seth sur le coin qui a fait le contact en premier pour abaisser le coin, et serrez la vis opposée pour relever le coin qui a fait durer le contact. Répétez l’abaissement du bloc, l’observation et le réglage jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec tous les pénétrateurs simultanément.

Un alignement soigneux du bloc de pénétrateur est important pour obtenir une lésion uniforme sur tous les puits de la plaque. Ouvrez à nouveau la porte pour désactiver l’appareil et insérez les vis d’arrimage dans leurs trous sur le bloc de pénétrateur. Serrez ensuite les vis en position et notez la position de la platine signalée par le panneau de test interactif lorsque la plaque entre en contact.

Pour étirer la plaque, remplacez le nom de fichier dans le champ Chemin d’accès au fichier de l’instrument virtuel de vérification de position par un nom de fichier unique, puis cliquez sur la flèche Exécuter. Définissez la profondeur et la durée de l’indentation et les champs Blessure et Durée de la blessure dans l’instrument virtuel du panneau de contrôle du mouvement. Avec la plaque en position zéro, exécutez l’instrument virtuel du panneau de contrôle de mouvement et cliquez sur Blessure pour mettre la plaque en retrait.

Cliquez sur le haut pour déplacer la platine vers le haut, en cliquant sur arrêter lorsque la plaque est en position haute, et ouvrez la porte pour désactiver le dispositif de blessure. Inspectez ensuite l’historique de déplacement de l’étage présenté dans l’instrument virtuel de suivi de position pour confirmer que le déplacement maximal spécifié a été appliqué, puis exportez les données vers un tableur approprié. Pour évaluer l’étirement de la membrane de silicone, après le traitement au plasma, placez la plaque sur une surface douce et apprêtez la petite saillie sur un tampon avec de l’encre provenant d’un marqueur permanent.

Insérez le tampon dans le premier puits à tester, et tapotez pour assurer un bon transfert d’encre. Lorsque tous les puits ont été estampillés, placez la caméra haute vitesse sur un support de perche au-dessus du dispositif de blessure avec l’objectif réglé sur le plus petit diaphragme numéroté de sorte que le champ de vision contienne 12 pénétrateurs dans une grille de trois par quatre. Avec l’endroit en position du point zéro, un clic sur le bouton d’enregistrement du logiciel de l’appareil photo pour qu’il lise le déclencheur et allume la lumière axiale diffuse brillante.

Ensuite, indentez la plaque comme vous venez de le démontrer, et éteignez la lumière axiale. Pour endommager une culture cellulaire, ajoutez 100 microlitres de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme traités à la laminine dans chaque puits de la plaque traitée au plasma, et laissez les cellules se fixer au fond de la plaque pendant 15 minutes à température ambiante avant de placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après deux à trois jours de culture, fixez la plaque sur l’étage du dispositif de blessure et ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant.

Ensuite, avec la plaque en position zéro, indentez la plaque comme nous venons de le démontrer. Une culture optimale non blessée aura peu ou pas d’amas de plus de cinq cellules, et les neurites seront individuels, longs, minces et courbés, avec peu ou pas de perles. Dans des conditions idéales, la viabilité des cultures devrait se rapprocher de la viabilité spécifiée dans la fiche technique du fabricant, et les cultures sur silicone devraient ressembler à celles maintenues sur des substrats de culture rigides conventionnels.

L’augmentation de la densité cellulaire augmente le nombre et la taille des amas qui se forment en culture, tandis que l’augmentation de la concentration de laminine contrecarre généralement cet effet. Dans les cultures blessées avec une souche maximale de 57 %, quatre heures après la blessure, les neurites sont raccourcis ou manquants, et certains ont des billes avec un agglutination démontré par les cellules viables restantes. Notamment, les traitements à la laminine à dose plus élevée réduisent la gravité des lésions aux cultures cellulaires d’une manière dépendante de la concentration, comme en témoigne l’augmentation de la longueur des neurites et de la viabilité cellulaire dans les cultures traitées à la laminine à dose plus élevée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de tenir compte des délais. Par exemple, la détoxification membranaire prend trois jours et les plaques fabriquées doivent durcir pendant la nuit avant d’être utilisées. N’oubliez pas que l’appareil de blessure contient une puissante bobine mobile pour piloter son mouvement, et il faut toujours rester à l’écart de l’appareil lorsqu’il est actif, et n’éteindre l’appareil que lorsque la scène est au sommet de sa course.