Name: PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez un modèle in vitro de blessure par étirement utilisant des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines en format 96 puits. Cette méthode permet le criblage phénotypique à haut contenu pour la découverte de médicaments en neurotraumatisme.

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Ce travail est soutenu en partie par une subvention de la National Institutes of Health (R21NS098129). Nous tenons à remercier son aide technique SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng et Feng Yuan Bu, qui a conçu et construit une structure pour prendre en charge les lumières utilisées au cours d’expériences d’imagerie haute vitesse décrits dans ce manuscrit .

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La clé à l’obtention d’un accord, phénotype biofidelic dans ce modèle applique une insulte mécanique conforme biofidelic. Ce modèle peut générer des impulsions durée aussi brève que 10 à 15 ms, qui ressemblent aux durées d’impulsion pour tête anthropisation selon expériences cadavériques12,13. La cohérence de cette insulte dépend de l’alignement entre la plaque et le bloc de pénétrateur et lubrification cohérente des indenters. Lorsque le bloc de pénétrateur est bien aligné, il n’y aucune tendance dans la souche appliquée à travers des lignes ou des colonnes (Figure 2). Une mince couche de lubrifiant crée généralement moins de friction qu’une couche épaisse et visqueuses graisses ne sont pas recommandés parce qu’ils encrassent le silicone et obstruent le passage de la lumière au cours de la microscopie. L’amplitude de déplacement de la scène réelle peut parviendrait pas substantiellement l’amplitude de déplacement prescrite lorsque plusieurs indenters sont utilisés, et l’amplitude de déplacement de phase réglementaire est de grande taille (> 3 mm). Cependant, le déplacement réel est inférieur le déplacement prescrit à grande amplitude, mais il reste répétable (Figure 2 b). Par conséquent, amplitudes de déplacements grand, réelle peuvent être obtenues de fiable en entrant une valeur prescrite supérieure à la valeur souhaitée. Amplitude du déplacement des questions uniquement parce que c’est un proxy facilement enregistré pour la souche de membrane de pointe, qui mesure directement l’insulte mécanique qui induit la pathologie. Par conséquent, la procédure décrite pour déterminer la déformation de la membrane par déplacement de phase est essentielle. Ce processus doit être répété si importants changements sont apportés au système qui affectent l’interaction entre la plaque et les indenters, par exemple s’il est différent indenters de diamètre, avec pénétrateur différents matériaux ou revêtements ou différents types de silicone plaque de fond sont utilisés. Le processus de réalignement du bloc avec pénétrateur et de déterminer la position zéro doit être répété au début de chaque expérience. Une représentation schématique de l’appareil d’étirement est illustrée à la Figure 1. Modèles CAO nécessaires à la reproduction de l’appareil sont fournis à titre de matériaux supplémentaires : "lésion périphérique - assemblage complet - 3D génériques. ÉTAPE ' ; la nomenclature associée fournie commesupplémentaire tableau 1 : Custom construit des dispositifs - BOM.xlsx. Voir aussi complémentaire 2 96 bien plateau _loader – Diagram.xlsx de câblage de brochage, qui décrit les connexions de câbles qui relient les différents composants des systèmes. « Interconnector_circuit_board.dip » décrit un circuit imprimé qui interconnecte les câbles.
Si le périphérique est désactivé dans la scène vers le milieu de sa course, la scène se déplace après que l’alimentation électrique est coupée, parce que c’est à ressort. Lorsque le courant est rétabli, la boucle de rétroaction permet de détecter une différence importante entre la dernière position connue prescrite et la position effective. Cela entraînera la scène pour bouger brusquement au poste, qu'elle était avant de l’appareil a été désactivé. Ce mouvement brusque peut entraîner des erreurs dans la sortie de l’encodeur, donc il faut désactiver l’appareil que lorsqu’elle repose dans son non alimentés position au sommet de sa course.
La pince de fabrication vise à rassembler le bas de corps et silicone plaque d’une manière qui permet une adhérence optimale. À cette fin, il y a trois caractéristiques essentielles dans la conception présentée dans le fichier supplémentaire ' Die Presse - 3D génériques. ÉTAPE '. Tout d’abord, le support de corps de plaque de serrage est parallèle au fond silicone. Si c’est correctement construit, il ne faudra aucun ajustement après l’installation initiale. Deuxièmement, la couche de mousse en caoutchouc dans la pince fournit une petite quantité de conformité dans le cadre de la plaque, comme un système complètement rigide subirait théoriquement une augmentation soudaine de zéro force de serrage à l’infinie force de serrage lors de la fermeture de la pince. La position de la barre transversale et vis de réglage du collier sont réglables pour que la distance entre les deux côtés de la pince peut être affinée.
Tout doit être fait pour fournir un arrière-plan lumineux et blanc derrière le dot sur le fond du puits au cours d’expériences de caractérisation de la souche. Plus le contraste de ces images, il sera facile d’automatiser le processus de mesure de la hauteur et la largeur du point, qui peut devenir fastidieux pour un opérateur humain analyse une grande expérience. Vidéographie à grande vitesse du fond d’un puits dans une plaque à 96 puits pose des difficultés parce que les parois du puits ont tendance à projeter des ombres. L’utilisation d’un dôme de lumière ou lumière axiale diffuse qui peut éclairer le long de la ligne de mire de la caméra sans obscurcir l’image élimine les ombres ou les reflets spéculaires qui pourrait se poser avec une source lumineuse classique. La plus brillante source lumineuse disponible doit être utilisée parce que l’éclairage lumineux permet les images destinées à être absorbées avec un temps d’exposition court. Temps d’exposition court minimisent le flou de mouvement. La mise à niveau de l’éclairage des diodes électroluminescentes (del) à la lumière diffuse axiale permet des temps d’exposition plus courtes pendant l’acquisition vidéo à haute vitesse. La LED peut être amélioré en ouvrant le feu axial diffus, enlevant le stock LED, montage 4 haute puissance LED tableaux au volet arrière à l’aide de supports de LEDs, afin qu’ils connaissent une alimentation courant constant et du remontage de la lumière diffuse axiale (voir Table de Matériaux pour les numéros de catalogue). L’inconvénient de mettre à niveau les LEDs, c’est que les LED refroidies passivement ne peuvent être maintenus plus de quelques secondes en raison du risque de surchauffe. Par conséquent, un éclairage différent est nécessaire pour l’alignement de l’ajustement après bloc et caméra.
La méthode présentée de quantifier la déformation de la membrane en mesurant la dilatation d’un point estampillé sur la membrane est relativement grossière, mais il peut mesurer jusqu'à plusieurs puits de manière robuste. Le champ de déformation bien bas peut se caractériser plus en détail à l’aide de la corrélation d’images numériques. Cette technique consiste à pulvériser une moucheté sur la base du puits et ensuite d’imagerie à haute vitesse pendant la déformation. Logiciel commercial permet ensuite de quantifier la déformation à chaque point de l’image grâce au suivi de l’évolution de la moucheté.
Ce protocole produit un phénotype de blessures aux multiples facettes, cliniquement pertinentes et extensibles à hiPSCNs. La mort cellulaire, dégénérescence des neurites et perler de neurites sont tous bien documentés séquelles du TBI chez l’être humain et animal modèles15. La clé du succès de ce modèle est établir et maintenir des cultures en bonne santé. En général, un protocole de culture cellulaire développé avec des plaques rigides classiques est un point de départ utile pour la culture de plaque extensible. Toutefois, la possibilité que les cellules en question peuvent répondre différemment sur le silicone doit toujours être envisagée. Cela est particulièrement vrai de hiPSCNs, qui sont très sensibles aux conditions de culture. Quelques exemples d’optimisation de la concentration cellulaire laminine et de densité sont fournis dans la section Représentant résultats (Figure 3, Figure 4). Activation de la silicone avec traitement plasma est vitale. Silicone est hydrophobe et pas réactif ; dans son état naturel, il ne liera pas laminine ou autres molécules utilisées pour favoriser la fixation des cellules. Traitement au plasma rend la surface hydrophile et expose des groupes réactifs. Ces modifications permettent aux molécules d’adhérence à lier à la silicone et de promouvoir la fixation des cellules. Il est important de noter que l’effet du traitement plasma se dissipe dans les minutes, sauf si la surface est immergée dans un liquide, et donc les procédures qui impliquent la surface activée de séchage doivent être effectuées aussi rapidement que possible. Une méthode simple pour vérifier si l’effet du traitement plasma s’est dissipé doit verser une goutte d’eau sur la surface. Silicone non traitée, la gouttelette sera billes vers le haut alors que sur les plasma traité au silicone, il se répandrait. Avec le hiPSCNs que nous avons utilisé (voir Table des matières), le fabricant recommande d’ajouter la laminine avec la suspension cellulaire plutôt que le revêtement avant. Ce protocole a incorporé cette approche avec succès. Alors que la segmentation peut, en théorie, être accomplie avec des logiciels libres ou des langages de programmation généraliste, un haut degré de maîtrise de ces outils est nécessaire pour obtenir de bons résultats. Neurites sont souvent difficiles à distinguer du signal de fond parce qu’ils sont tellement minces. Par conséquent, nous recommandons l’utilisation d’outils logiciels commerciaux, distribués par les sociétés de microscopie contenu élevé avec des modules dédiés pour la segmentation et quantification des neurones, si elles sont disponibles. Même avec un logiciel commercial, il est sage d’exporter des images de la segmentation de vérifier visuellement l’exactitude.
Il y a certaines limites associés au travail en plaques étirables par rapport à travailler avec des plaques classiques, rigides. Les plaques extensibles peuvent être photographiées comme d’habitude avec les objectifs de l’air. Toutefois, l’imagerie avec les objectifs à immersion est très difficile. Huile de lentille peut endommager le silicone. En outre, l’objectif exerce une pression sur la membrane de silicone comme il se déplace vers le haut. Cette pression déplace la membrane verticalement, rendant difficile d’amener l’échantillon dans le foyer. Les membranes de silicone actuellement utilisés dans la fabrication des plaques sont environ 250 µm d’épaisseur. Cette épaisseur est supérieure à la distance focale de nombreux haute puissance, objectifs à immersion. Il faut en particulier à poser les membranes parfaitement plat avant serrage pour réaliser la planéité requise pour la microscopie. Systèmes autofocus peuvent compenser des écarts dans la platitude de la plaque finie dans une certaine mesure. Les versions futures du protocole peuvent pre tendre la membrane avant elle est collée sur le dessus de la plaque pour assurer la planéité. La procédure sans adhésif pour coller la membrane silicone au haut de la page plaque14 est considéré comme une force importante du protocole actuel. Il élimine le risque de neurotoxicité de l’adhésif ainsi que tout écart par rapport à la planéité en raison de l’épaisseur non uniforme de la couche de colle.
Rangées d’électrodes multiples sont utilisées dans des expériences avec hiPSCNs pour évaluer leur maturité et leur fonctionnalité. Malheureusement, ces systèmes sont incompatibles avec ce modèle, parce que le substrat de culture cellulaire est rigide. Il est possible de créer un tableau multi-électrode extensible, bien que cela a jusqu'à présent seulement été démontré dans un seul bien format16,17. Notez qu’indenters peuvent être retirés individuellement du bloc avec pénétrateur afin que certains puits ne sont pas en retrait et peuvent servir de couvre-oreillers. Enlever le pénétrateur empêche la mise en retrait, mais n’élimine pas complètement chargement mécanique puisqu’il n’y a toujours inertiel mouvement du fluide dans les puits alors que la scène se déplace. Il est intéressant de comparer ces puits puits dans les plaques qui ont jamais fait l’objet de mouvement étape pour mesurer toute influence pathologique d’un mouvement fluide. En outre, le tableau d’indenters dans le bloc devrait être bisymmetric (symétrique d’avant en arrière et latéralement). Cette précaution garantit que la plaque est chargée uniformément au cours de la mise en retrait, afin que le stade ne pas incliner latéralement et provoquer les tiges lier dans les paliers.
L’un des principaux défis pour l’innovation thérapeutique en neurotraumatologie est la complexité et l’hétérogénéité de la condition. Traumatisme s’applique stress multimodale pour chaque type de cellule dans le système nerveux central en même temps. Les neurones ont été sûrement générés à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et sont maintenant largement disponibles chez les revendeurs commerciaux. L’innovation progresse rapidement dans ce domaine, et autres types de cellules neuronales comme astrocytes18 et la microglie19 sont également étant dérivés de hiPSCs. Bientôt, il serait possible d’isoler les réponses cellulaires-autonome de chacun de ces types de cellules à trauma in vitro , puis à la co-culture différents types de cellules à comprendre comment ils communiquent après un traumatisme. De cette façon, il peut être finalement possible de recréer le défi clinique du bas vers le haut pour bien le comprendre dans un système humain. Cette approche se distingue de l’approche traditionnelle en s’appuyant sur les modèles de rongeurs et a le potentiel pour générer des idées nouvelles qui conduisent aux premières thérapies pour cette affection courante, dévastatrice et intraitable.

TBI est une cause majeure de mortalité et de morbidité dans les États Unis, provoquant le décès environ 52 000 et 275 000 hospitalisations chaque année1. Plus de 30 essais cliniques de produits thérapeutiques candidat pour TBI ont été menées sans un seul succès2. Cet échec uniform donne à penser que l’homme des processus séparer TBI humaine de la physio-pathologie observée dans des modèles précliniques couramment utilisés.
L’avènement de hiPSCNs a créé une occasion d’étudier la neurotraumatologie un modèle humain in vitro . Avec modèles axés sur les hiPSCN de dépistage de drogue peut produire des résultats qui sont plus prédictives du succès clinique que les modèles utilisant des cellules de rongeurs. En outre, hiPSCNs peuvent être génétiquement manipulés pour isoler et étudier l’effet des variants génétiques humains individuels sur la pathologie3.
La méthode décrite dans ce manuscrit est conçue pour apporter les avantages uniques de maladies hiPSCN modélisation de neurotraumatologie. In vitro le modèles de lésion extensibles de neurotraumatologie sont bien établis4,5,6 avec les cellules primaires de rongeurs et de lignées cellulaires cancéreuses neurales humaines. La plupart de ces modèles génère stretch par chargement pneumatique une membrane de silicone. Cette approche est efficace dans un format bien simple mais s’avère difficile à l’échelle jusqu'à un format multipuits7. En conséquence, il n’a jamais été un écran de haut débit pour les agents traiter des neurones lésés extensibles.
Dans ce modèle, la membrane s’étend en raison de la mise en retrait du dessous avec un pénétrateur rigide. Cette approche a été démontrée à plusieurs reprises pour générer une pathologie cliniquement pertinente in vitro dans les systèmes simples bien8,9,10. Nos travaux récents ont montré qu’il évolue facilement vers le haut pour un format 96 puits tout en conservant des durées d’impulsion sur l’ordre de plusieurs dizaines de millisecondes11, qui est la fois domaine de fermé le choc de la tête des événements12,13.
En résumé, les principaux avantages de ce modèle de blessures in vitro sont le format 96 puits, l’utilisation de hiPSCNs et le domaine temps cliniquement pertinente de l’insulte.

<table><tbody><tr><td>Feuille de silicone .010"</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS)</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>#12-565-600</td><td>Bottomless 96 Well</td></tr><tr><td>Plate Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>Papier sulfurisé</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation pour plafonnier</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’éclairage diffus axial&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Lumière axiale diffuse</td></tr><tr><td>Matrice de LED haute puissance&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>Réseau de LED haute puissance&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Support LED</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>Support LED&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation à LED</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Bloc d’alimentation à courant constant&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel FastCam Viewer&nbsp ;</td><td>Caméra photron</td><td></td><td>softeware</td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>Caméra haute vitesse</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>Objectif de caméra haute vitesse</td></tr><tr><td>0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Média iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Supplément iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>actionneur de bobine mobile&nbsp ;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>codeur linéaire optique&nbsp ;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>servovariateur</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Contrôleur PowerPC temps réel&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Châssis cRIO</td><td>National Instruments</td><td>Module d’entrée numérique cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>Châssis d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>Logiciel</td><td>de contrôle</td>d’instruments National Instruments <td></td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

procede de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un format 96 puits

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatisme crânien (TCC) est un défi clinique avec taux élevé de morbidité et de mortalité. Malgré des décennies de recherche pré-clinique, aucun traitements éprouvés pour TBI n’ont été développés. Cet article présente une nouvelle méthode pour la recherche pré-clinique neurotrauma destiné à compléter les modèles précliniques existants. Elle introduit la physiopathologie humaine grâce à l’utilisation de neurones de dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCNs). Il réalise des impulsions de chargement durée similaire pour les durées de chargement des cliniques fermées des blessures de choc de la tête. Il utilise un format de 96 puits qui facilite les expériences d’un débit élevé et fait un usage efficace des cellules coûteux et les réactifs de la culture. Membranes de silicone sont d’abord traitées pour supprimer neurotoxique polymère non polymérisée et ensuite collés aux organes de la plaque à 96 puits commerciaux pour créer des plaques de 96 puits extensibles. Un dispositif sur mesure est utilisé en retrait de tout ou partie des culs bien de dessous, induisant une déformation mécanique equibiaxial qui blesse mécaniquement les cellules en culture dans les puits. La relation entre la profondeur d’indentation et sollicitations mécaniques est déterminée empiriquement à l’aide de vidéographie de haute vitesse de fond bien au cours de la mise en retrait. Cellules, y compris hiPSCNs, peuvent être cultivées sur ces membranes de silicone à l’aide de versions modifiées des protocoles de culture de cellules conventionnelles. Fluorescents images microscopiques des cultures cellulaires sont acquis et analysés après blessure de façon semi-automatique pour quantifier le niveau de dommage dans chaque puits. Le modèle présenté est optimisé pour hiPSCNs mais pourrait, en théorie, être appliqué à d’autres types de cellules.

Le dispositif de la civière est capable de déplacer la scène répétable avec des durées d’impulsions aussi courtes que 10 à 15 ms selon l’amplitude de l’impulsion (Figure 2 a). Les amplitudes des impulsions sont hautement reproductibles, mais la durée de l’impulsion varie par environ 1 ms entre les répétitions. L’amplitude d’impulsion réelle s’écarte l’amplitude d’impulsion prescrits lorsqu’un grand nombre de puits est chargé et l’amplitude prescrite est élevé (voir la Figure 2 b). Comme l’amplitude du déplacement de la scène est augmentée au-delà de 3 mm, l’amplitude de déplacement réel inférieur plus en plus l’amplitude de déplacement prescrite (voir la Figure 2 b). Un alignement soigné du bloc post élimine toute tendance à la déformation de la membrane sur lignes ou colonnes (Figure 2). À la 3.5 mm prescrit l’amplitude de déplacement de phase (amplitude de déplacement réel de 3,3 mm) avec 52 puits mis en retrait, la souche de lagrangien moyenne dans l’ensemble de tous les emplacements de puits a été 0,451 (écart-type d’un dispositif de tous les emplacements = 0,051, moyenne des écarts-types pour tous les emplacements = 0,065, n = 5 mesures par puits). Ces résultats sont présentés ici par souci d’exhaustivité, bien que certains d'entre eux ont déjà été signalés11.
Une culture optimale, pas blessée aura peu ou pas de touffes de plus de 5 éléments. Neurites sera individuel, longue, mince et incurvée avec peu ou pas de signe de tension ou de perles (Figure 3 a). Dans des conditions idéales, la viabilité des cultures devrait approcher étroitement la viabilité spécifiée dans la fiche technique du fabricant (généralement de 60 à 70 %) et cultures sur silicone doivent ressembler à celles qui étaient maintenues sur des substrats de culture rigide conventionnelle ( Figure 3 b). Neurites peut ou peut ne pas apparaître sur un microscope de champ lumineux de faible puissance. Concentration de laminine et de densité cellulaire influencent les cultures au départ et après une blessure. L’augmentation de la densité cellulaire augmente le nombre et la taille des amas qui se forment dans la culture. Augmentation de la concentration de la laminine souvent contrecarré cet effet (Figure 3 a). Cependant, concentration augmentant la laminine trop émoussé la sensibilité des cultures à l’injure (Figure 4). La concentration optimale de laminine pour cultures blessés était de 50 µg/mL de laminine (Figure 3), mais la séparation optimale entre les populations sham et extensibles de blessés a été obtenue à 10 µg/mL de laminine (Figure 4). Des concentrations plus élevées de la laminine réduit la sensibilité des cultures pour les blessures aux points de courte période (Figure 4), mais aussi la viabilité cellulaire améliorée référence aux points de temps plus longues (par exemple, 7 jours). En résumé, il vaut la peine d’optimiser la concentration de la laminine pour chaque scénario expérimental.
Déformation de la membrane, imagerie point de temps après l’accident, concentration de laminine et densité cellulaire tous exercent un effet principal statistiquement très significatif sur la longueur des neurites par cellule (ANOVA, p &lt; 0,001). L’effet de la déformation de la membrane sur la longueur des neurites par cellule avait des interactions statistiquement très significatives avec après la lésion d’imagerie temps point et laminine concentration (ANOVA, p &lt; 0,001) et une interaction significative avec cellule densité (ANOVA, p &lt; 0,05). De même, déformation de la membrane, après l’accident point dans le temps, l’imagerie cellulaire densité et laminine concentration tous exercée un effet principal statistiquement très significatif sur la viabilité cellulaire (ANOVA, p &lt; 0,001). L’effet de la souche de la membrane sur la viabilité cellulaire a une interaction statistiquement très significative avec le point de temps après l’accident d’imagerie (ANOVA, p &lt; 0,001) et une interaction significative avec la densité des cellules (ANOVA, p &lt; 0,05). Ces résultats prouvent que les timing et densité cellulaire laminine concentration exercent une influence importante sur la relation entre les insulte appliquée et les résultats expérimentaux, afin que chacun devrait être optimisé avec soin.
Viabilité cellulaire faible et les neurites perlée, ainsi que de la croissance des neurites rabougris, indiquent des conditions de culture toxiques qui peuvent en découler mal préparé silicone. Sauter ou en raccourcissant le trempage à l’eau ou le four sec peut laisser absorbé l’éthanol ou l’eau dans la membrane, respectivement, qui peut diffuser dans les médias et souligner les cellules. Cultures bien blessés aura réduite viabilité cellulaire, raccourcie ou manquant de neurites, neurites perlée et neurites qui ont l’air tendus ou tendue. Peuvent provoquer des blessures s’agglutiner dans des cultures cellulaires qui ont été bien dispersé avant l’accident. Grosses touffes peuvent confondre l’analyse morphologique. Pour une analyse morphologique, le niveau du préjudice doit être accordé, telle que des modifications sont perceptibles, mais les cellules sont toujours présents avec des neurites.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figure 1 : A étiqueté schématique du dispositif blessure. (A) vue de dessus, vue isométrique (B), (C) vue de face, vue du côté droit (D). La barre d’échelle s’applique pour les vues orthogonales (A, B et D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figure 2 : La cinématique de l’insulte mécanique. (A), le déplacement du stade histoires sur 5 impulsions à une gamme des amplitudes prescrites (amplitudes prescrits sont répertoriés dans la légende) quand aucun puits ne sont chargés. (B) le déplacement du stade histoires sur 10 impulsions à une gamme des amplitudes prescrites (amplitudes prescrits sont répertoriés dans la légende) quand 52 puits sont chargés. (C), la souche moyenne dans chaque puits d’amplitude de déplacement du stade de 3,3 mm (n = 5 mesures par puits, moyenne écart-type / puits = 0,029). Notez que C4-F4 et C9-F9 sont les puits témoins non étiré. Ce chiffre a été modifié par Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figure 3 : Optimisation de la culture des conditions silicone. (A) l’effet de la variation de concentration cellulaire de densité et de la laminine sur hiPSCN cultures sur silicone. Agglutination augmente avec l’augmentation de la densité cellulaire et la diminution de concentration de la laminine. La concentration cellulaire laminine et de densité doit être optimisée pour atteindre des cultures mono dispersées. Mono-dispersé les cultures sont moins vulnérables aux artefacts au cours de la quantification. Notez que la plage dynamique a été ajustée pour optimiser la visualisation des neurites. En conséquence, beaucoup plus brillant soma sont saturés. Cette présentation est préférable à la solution d’optimisation de la gamme dynamique en ce qui concerne le soma, qui restitue bien les neurites gradateur presque invisible. L’État a mis en évidence par la place rouge était censé pour être optimale pour des expériences in vitro blessure extensibles. (B) dans des conditions optimales, cultures sur les membranes silicone semblent être similaires aux cultures sur substrats rigides classiques. Le panneau de gauche montre hiPSCNs cultivés à 33 750 cellules/cm2 avec 3,3 µg/mL de laminine sur une plaque à 96 puits conventionnelle, rigide (le substrat de culture cellulaire est un copolymère de culture de tissus traité d’oléfine cyclique). Le panneau de droite reproduit le panneau contour rouge de (A). Barreaux de l’échelle = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figure 4 : Le phénotype de la blessure et sa dépendance sur la concentration de la laminine. (A) culture saine, à l’aide de 10 µg/mL laminine et 67 500 cellules/cm2. Neurites sont longs avec aucun perles. Il y a peu de noyaux morts et quelques touffes. Culture (B) en utilisant les mêmes conditions de culture, blessé avec la souche de pic de 57 % et imagés après 4 h. Neurites sont raccourcies ou endommagées et certaines ont des perles (indiqués par des flèches). Il y a moins de cellules calcéine AM séropositifs et AM-négatif de calcéine plus noyaux (c.-à-d., morts). Blessure a augmenté agglomérante parmi les cellules survivantes. (C) 4 heures après l’accident, neurite longueur par cellule diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (D) 4 heures après l’accident, la viabilité des cellules diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (E) 24 heures après la lésion, neurite longueur par cellule diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (F) 24 h après la lésion, la viabilité cellulaire diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (n = 4 par barre, barres d’erreur sont ± 1 écart-type, barres d’échelle = 100 µm). Valeurs de déformation sont déduites par déplacement de phase à l’aide de données provenant d’une publication préalable par Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Supplémentaire Figure 1 : technique de dessin de la pénétrateur. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Supplémentaire tableau 1 : Custom construit dispositifs. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.</a>
Table supplémentaire 2:96 bien plaque-chargeur brochage diagramme de câblage. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.</a>
Supplémentaire 1 fichier de Code : dessins de conception assistée par ordinateur de l’appareil de la blessure. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaire 2 fichier de Code : dessins de conception assistée par ordinateur de la pince de fabrication plaque. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de Code supplémentaire 3 : représentation 3D de la géométrie de timbre, adaptée pour être utilisé avec une imprimante 3D. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaire 4 fichier de Code : sous-VI pour MuStLiMo_si_initialize.vi, qui est un sous-VI pour motion_control.vi. Convertit les entrées dans les boîtes de dialogue Paramètres de requête. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de Code supplémentaire 5 : sous-VI pour plusieurs Moves_simplified.vi de ligne droite, qui est un sous-VI pour motion_control.vi. Convertit les entrées dans les boîtes de dialogue Paramètres de requête. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires 6 fichier de Code : sous-VI pour position_tracker.vi. Déplacement de titres compteur entrée de codeur linéaire. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de Code supplémentaire 7 : Base projet LabVIEW. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaire Code fichier 8 : Top niveau VI qui se déplace le dispositif de. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de Code supplémentaire 9 : sous-VI pour motion_control.vi. Exécute le déplacement rapid qui s’étend de la plaque. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
10 de fichier Code supplémentaire : sous-VI pour motion_control.vi. Exécute le déplacement lent qui se déplace de la scène. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaire Code dossier 11 : sous-VI pour motion_control.vi. Trace une histoire de déplacement (généralement sous-échantillonnés) dans le panneau de contrôle motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaire 12 fichier de Code : Top niveau VI qui enregistre l’historique de déplacement. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier de Code supplémentaire 13 : contient Variable2, qui communique entre motion_control.vi et position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
14 de fichier Code supplémentaire : schématique pour circuit imprimé. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de Code supplémentaire 15 : mise en page pour circuit imprimé. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici une méthode pour un modèle humain in vitro de lésion extensible dans un format 96 puits sur une échelle de temps pertinent à l’impact d’un traumatisme. Cela inclut des méthodes de fabrication des plaques étirables, quantifier l’insulte mécanique, cultivant et blessant des cellules, l’imagerie et haute analyse de contenu pour quantifier le préjudice.

PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

L’objectif global de ce modèle est de créer un phénotype de neurotraumatisme cliniquement pertinent dans un format de 96 puits afin de faciliter la comparaison efficace et simultanée des lésions subies dans de multiples conditions expérimentales. L’objectif principal de ce modèle est de permettre des cribles de découverte de médicaments phénotypiques à haut contenu dans les neurotraumatismes, avec des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induits par l’homme. Les plaques utilisées dans ce modèle conservent la géométrie standard de l’industrie à 96 puits, en maintenant leur compatibilité avec les machines de criblage à haut contenu existantes, comme les bras robotiques et les microscopes automatisés.Pour commencer, placez une plaque sans fond à 96 puits, côté inférieur vers le haut, à l’intérieur d’un nettoyeur plasma de 200 watts pendant 60 secondes à haute puissance. Ensuite, placez la plaque dans 200 millilitres de 1,5 % APTES fraîchement préparé dans de l’eau déminéralisée, le fond vers le bas, pendant 20 minutes dans une hotte. 10 minutes après le début de l’incubation, à l’aide d’une pince, positionnez une membrane en silicone traitée au plasma sur un rectangle de papier sulfurisé de 7,5 x 11 centimètres et alignez une plaque d’aluminium de 7,5 x 11,05 centimètres sur la partie inférieure de la pince de fabrication de plaque.Ensuite, à l’aide d’une pince, alignez la membrane de silicone et le papier sulfurisé sur la plaque d’aluminium. À la fin de la période de revêtement, retirez la plaque sans fond du bain APTES et secouez l’excès de solution. Trempez la plaque sans fond dans deux bains-marie désionisés consécutifs de 200 millilitres pendant cinq secondes à chaque trempage et secouez l’excès d’eau.Après un séchage complet à l’air comprimé, placez la plaque sans fond dans la partie supérieure de la pince de fabrication de la plaque et fermez doucement la pince pour presser la plaque sans fond et le silicone ensemble. Pour aligner le bloc de pénétrateur, utilisez des pinces de platine pour fixer la plaque sur la platine de l’appareil d’étirement sous une caméra avec un flux en direct, et placez un plafonnier sur l’appareil. Lancez le logiciel de contrôle de l’instrument sur l’ordinateur connecté à l’appareil de blessure et cliquez sur la fenêtre de lancement pour exécuter le projet de neurotraumatologie in vitro.Dans la fenêtre du projet, double-cliquez sur les instruments virtuels Motion Control et suivi de position. Fermez la cage entourant l’appareil de blessure et cliquez sur la flèche dans l’instrument virtuel de contrôle de mouvement pour faire fonctionner l’instrument. Cliquez sur le bas pour abaisser la platine à moins de deux millimètres du contact avec les pénétrateurs, puis cliquez sur arrêter pour arrêter l’instrument virtuel.Dans la fenêtre du projet, faites un clic droit sur Axis One, puis cliquez sur Panneau de test interactif. Entrez 500 unités dans le champ Position cible de la fenêtre qui s’affiche pour définir la taille du pas sur 50 micromètres. Cliquez ensuite sur Aller à plusieurs reprises, jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec des pénétrateurs, en vérifiant le contact sur l’image en direct affichée par la caméra.La position verticale de la scène sera indiquée en haut à gauche de la fenêtre du panneau de test interactif. Abaissez davantage la plaque jusqu’à ce que chaque puits soit entré en contact avec les pénétrateurs, en déplaçant la caméra et la platine si nécessaire pour voir la plaque entière. Notez la position verticale de la scène signalée lorsque tous les poteaux sont en contact et fermez le panneau de test interactif.Ensuite, exécutez l’instrument virtuel de contrôle de mouvement et cliquez sur Haut pour soulever la scène, en utilisant le bouton d’arrêt pour arrêter l’instrument virtuel lorsque la scène est en position. Ouvrez la porte pour désactiver l’appareil, puis desserrez la vis seth sur le coin qui a fait le contact en premier pour abaisser le coin, et serrez la vis opposée pour relever le coin qui a fait durer le contact. Répétez l’abaissement du bloc, l’observation et le réglage jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec tous les pénétrateurs simultanément.Un alignement soigneux du bloc de pénétrateur est important pour obtenir une lésion uniforme sur tous les puits de la plaque. Ouvrez à nouveau la porte pour désactiver l’appareil et insérez les vis d’arrimage dans leurs trous sur le bloc de pénétrateur. Serrez ensuite les vis en position et notez la position de la platine signalée par le panneau de test interactif lorsque la plaque entre en contact.Pour étirer la plaque, remplacez le nom de fichier dans le champ Chemin d’accès au fichier de l’instrument virtuel de vérification de position par un nom de fichier unique, puis cliquez sur la flèche Exécuter. Définissez la profondeur et la durée de l’indentation et les champs Blessure et Durée de la blessure dans l’instrument virtuel du panneau de contrôle du mouvement. Avec la plaque en position zéro, exécutez l’instrument virtuel du panneau de contrôle de mouvement et cliquez sur Blessure pour mettre la plaque en retrait.Cliquez sur le haut pour déplacer la platine vers le haut, en cliquant sur arrêter lorsque la plaque est en position haute, et ouvrez la porte pour désactiver le dispositif de blessure. Inspectez ensuite l’historique de déplacement de l’étage présenté dans l’instrument virtuel de suivi de position pour confirmer que le déplacement maximal spécifié a été appliqué, puis exportez les données vers un tableur approprié. Pour évaluer l’étirement de la membrane de silicone, après le traitement au plasma, placez la plaque sur une surface douce et apprêtez la petite saillie sur un tampon avec de l’encre provenant d’un marqueur permanent.Insérez le tampon dans le premier puits à tester, et tapotez pour assurer un bon transfert d’encre. Lorsque tous les puits ont été estampillés, placez la caméra haute vitesse sur un support de perche au-dessus du dispositif de blessure avec l’objectif réglé sur le plus petit diaphragme numéroté de sorte que le champ de vision contienne 12 pénétrateurs dans une grille de trois par quatre. Avec l’endroit en position du point zéro, un clic sur le bouton d’enregistrement du logiciel de l’appareil photo pour qu’il lise le déclencheur et allume la lumière axiale diffuse brillante.Ensuite, indentez la plaque comme vous venez de le démontrer, et éteignez la lumière axiale. Pour endommager une culture cellulaire, ajoutez 100 microlitres de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme traités à la laminine dans chaque puits de la plaque traitée au plasma, et laissez les cellules se fixer au fond de la plaque pendant 15 minutes à température ambiante avant de placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après deux à trois jours de culture, fixez la plaque sur l’étage du dispositif de blessure et ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant.Ensuite, avec la plaque en position zéro, indentez la plaque comme nous venons de le démontrer. Une culture optimale non blessée aura peu ou pas d’amas de plus de cinq cellules, et les neurites seront individuels, longs, minces et courbés, avec peu ou pas de perles. Dans des conditions idéales, la viabilité des cultures devrait se rapprocher de la viabilité spécifiée dans la fiche technique du fabricant, et les cultures sur silicone devraient ressembler à celles maintenues sur des substrats de culture rigides conventionnels.L’augmentation de la densité cellulaire augmente le nombre et la taille des amas qui se forment en culture, tandis que l’augmentation de la concentration de laminine contrecarre généralement cet effet. Dans les cultures blessées avec une souche maximale de 57 %, quatre heures après la blessure, les neurites sont raccourcis ou manquants, et certains ont des billes avec un agglutination démontré par les cellules viables restantes. Notamment, les traitements à la laminine à dose plus élevée réduisent la gravité des lésions aux cultures cellulaires d’une manière dépendante de la concentration, comme en témoigne l’augmentation de la longueur des neurites et de la viabilité cellulaire dans les cultures traitées à la laminine à dose plus élevée.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de tenir compte des délais. Par exemple, la détoxification membranaire prend trois jours et les plaques fabriquées doivent durcir pendant la nuit avant d’être utilisées. N’oubliez pas que l’appareil de blessure contient une puissante bobine mobile pour piloter son mouvement, et il faut toujours rester à l’écart de l’appareil lorsqu’il est actif, et n’éteindre l’appareil que lorsque la scène est au sommet de sa course.

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