Protocole pour la toxicité aiguë et chronique écotoxicité Testing de la Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les effets des substances toxiques sur le killifish turquoise Nothobranchius furzeri. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écotoxicologie, telles que les effets à long terme des facteurs de stress sur des traits importants du cycle biologique, à savoir le temps de maturation, la croissance ou la fécondité. Le principal avantage de cette expérience est que nous utilisons un vertébré avec un cycle de vie très rapide, ce qui permet des expériences rapides et rentables.

Ces fondules sont des modèles idéaux pour étudier l’impact des effets à long terme et multigénérationnels des facteurs de stress. À terme, ils contribueront à une meilleure compréhension de l’impact environnemental des substances toxiques. Bien que cette méthode puisse fournir de nouvelles informations sur les effets combinés des toxiques et de la température, elle peut également être appliquée à d’autres facteurs de stress tels que les rayons UV, la privation de nourriture et les altérations du PH.

Il est difficile de travailler avec les killips, parce qu’ils constituent un nouveau système modèle en écotoxicologie, et parce que leur sensibilité à de nombreux polluants est encore inconnue. Nous avons développé l’idée de cette méthode expérimentale lorsque nous avons découvert pour la première fois la courte durée de vie exceptionnelle du fondule et sa capacité à produire des œufs dormants qui peuvent être conservés pendant des années sur l’étagère. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le type d’expérience, ainsi que la manipulation des individus, peuvent modifier les résultats.

Pour commencer, sélectionnez les œufs de zoo de raies gona, ou GRZ, au stade D3, qui sont reconnaissables à la présence d’yeux dorés. Et utilisez une pince à épiler souple pour les transférer doucement dans un réservoir en plastique de deux litres. Ajoutez un centimètre de milieu d’éclosion à 12 degrés Celsius et laissez la température de l’eau s’ajuster progressivement à la température ambiante.

Après 24 heures, donnez aux nouveau-nés une dose concentrée de nauplies d’artémias fraîchement éclos, et augmentez la profondeur de l’eau à cinq centimètres en ajoutant du milieu pour poissons. 48 heures après l’éclosion, transférez les larves saines et flottantes dans des récipients individuels avec un milieu d’exposition et des concentrations toxiques comme décrit dans le protocole de texte. Chaque matin et chaque soir, vérifiez que les poissons ne sont pas morts, stressés et malades, et calculez les valeurs CL50 selon le protocole textuel.

Effectuez un essai d’exposition chronique en remplissant des récipients individuels avec le bon milieu d’exposition et ajoutez un tube d’air pour aérer le pot. Transférez le poisson dans les bocaux pour le reste de l’expérience. De deux à 23 jours après l’éclosion ou DPH, nourrissez les poissons avec des nauplii d’artémias deux fois par jour à volonté.

Ensuite, après avoir complété avec des larves de chironomus hachées jusqu’à 37 DPH, utilisez des larves de chironomus congelées pour nourrir le poisson à volonté deux fois par jour, tous les jours, à l’avenir. Pour déterminer la croissance, mesurez la taille du corps sur une base hebdomadaire, en transférant le poisson dans une boîte de Pétri remplie de milieu du réservoir. Prenez quatre à cinq photos en vue dorsale calibrée de taille du poisson à une hauteur fixe.

Et utilisez un programme de mesure spatiale pour les analyser numériquement. À partir de 15 DPH, inspectez visuellement la coloration du poisson mâle, afin de déterminer la maturation. Vérifiez les nageoires pour les premiers signes de coloration nuptiale et utilisez le jour où la coloration du poing était visible comme indicateur du temps de maturation du mâle.

À partir de 30 DPH, vérifiez la fécondité en mettant en place un bassin de ponte d’un litre pour les couples mâles et femelles matures au sein de chaque traitement, en utilisant le milieu d’exposition de l’aquarium du mâle, et complétez-le avec du substrat de frai. Transférez le mâle et la femelle dans le bassin de frai. Et tout en minimisant l’activité humaine ou les perturbations autour des conteneurs de frai, laissez-les frayer pendant deux heures.

Ensuite, sans mélange inutile de l’eau, qui ferait tourbillonner les œufs dans le substrat de frai, transférez doucement les poissons dans leurs contenants d’hébergement. Filtrez les œufs en versant le substrat de frai sur une maille de 500 micromètres. Comptez les œufs et utilisez une pipette pour les transférer dans de la tourbe humide dans des boîtes de Pétri.

Retirez les œufs morts tous les jours. Après une semaine, utilisez un film d’étanchéité pour sceller la boîte de Pétri. Et rangez-le dans un incubateur à température contrôlée à 28 degrés Celsius, avec un cycle de 14 à 10 degrés clair-foncé, pour un développement immédiat vers la phase D3.

Pour une conservation à long terme, conservez les œufs dans une obscurité constante à 17 degrés Celsius, après quoi les œufs entrent en phase de dormance et restent viables pendant plusieurs années. Pour recruter des poissons à partir des œufs dormants, transférez les œufs à 28 degrés Celsius et un cycle de 14 à 10 degrés lumineux à foncé, pendant environ trois semaines, pour leur permettre de se développer jusqu’à la phase D3. Pour mesurer le maximum thermique critique, ou CT max des poissons adultes, commencez par un bain d’eau à circulation continue, chauffé à un taux constant de 0,33 degré Celsius par minute.

Ajoutez plusieurs aquariums d’un litre, pour chaque poisson. Commencez le parcours en ajoutant les poissons dans l’aquarium, lorsque l’eau a atteint la température d’élevage expérimentale des poissons. À l’aide d’un thermomètre numérique, vous pouvez surveiller la température dans les aquariums d’un litre du bain CT max, toutes les cinq minutes.

Lorsque le poisson ne parvient pas à maintenir une position verticale dorsale ventrale ou commence à se contracter fortement, mesurez la température dans l’aquarium d’un litre, qui est la température maximale critique. Ensuite, transférez le poisson dans son logement expérimental pour le récupérer. Comme le montre ce graphique, l’exposition aiguë à l’enfurzeri à différentes concentrations de cuivre a provoqué une augmentation de la mortalité avec l’augmentation de la concentration de substances toxiques.

valeurs CL50 diminuent avec le temps, ce qui signifie qu’avec des concentrations décroissantes, plus de temps s’écoule avant que 50 % des répétitions ne meurent. Dans les essais d’exposition chronique, utilisant du cuivre d’origine hydrique, les poissons sont plus petits, comme mesurés après trois semaines lorsqu’ils sont élevés à la concentration la plus élevée testée. Dans cette expérience utilisant du chlorpyrifos d’origine hydrique ou CPH, lorsqu’ils étaient élevés à 28 degrés Celsius, les poissons produisaient moins d’œufs lorsqu’ils étaient exposés à la concentration la plus élevée de CPF, cependant, à 30 degrés Celsius, les poissons témoins produisaient plus d’œufs que les poissons exposés à l’une ou l’autre concentration de CPF, ce qui indique que la combinaison de CPF et d’une augmentation de la température affectait la fécondité plus que chaque facteur de stress séparément.

Il s’agit de l’âge moyen auquel les premiers signes de coloration sont apparus chez les mâles enfurzeri, exposés au CPF à 28 et 30 degrés Celsius. Après une exposition à quatre microgrammes par litre de CPF, les poissons mâles ont mis 18 % plus de temps à atteindre la maturité que les poissons témoins. La mesure de la CT max des poissons élevés à 24 ou 28 degrés Celsius et de l’exposition au polluant 3,4-DCA a révélé que la nage erratique, l’augmentation des mouvements operculaires et la perte de la capacité de rester en position verticale dorso-ventrale se produisaient à une température plus basse lorsque les poissons étaient élevés à 24 degrés Celsius.

Une fois maîtrisé, ce protocole, incluant les effets sur la fécondité, peut être mesuré en deux mois. Pour mesurer les effets sur l’ensemble de la période de reproduction ou même sur une génération suivante, le protocole peut être étendu, mais peut toujours être réalisé en six mois.