Name: Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Découvrez un test de perles in vitro intégrant les péricytes pour modéliser l'angiogenèse par bourgeonnement. Cette méthode permet d'étudier les interactions cellules endothéliales-péricytes dans un modèle physiologiquement pertinent.

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Nous remercions les Drs Victoria Bautch et Joshua Boucher de discussions utiles et des conseils sur l’optimisation standard perle germination conditions d’essais et un test de germination souillant le protocole. S.H.A. a été financée en partie par une subvention de la National Institute of General Medical Sciences sous prix 5T32 GM007092.

<ol><li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li>
<li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurorestorative+therapies+for+stroke%3A+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li>
<li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li>
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<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+angiogenesis+and+its+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Basic+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li>
<li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li>
<li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole présente une méthode permettant de caractériser les étapes complexes et des interactions cellulaires hétérotypiques de germination angiogenèse en permettant au chercheur d’employer des approches génétiques et d’imagerie, de mener des enquêtes approfondies mécanistes. Lorsque vous effectuez le test, il est essentiel qu’efficace revêtement endothélial des perles se déroule pendant le talon étapes d’agitation. Revêtement endothélial pauvres seront évidente, si les perles ne semblent pas avoir une surface rugueu...

L’angiogenèse est vital à l’embryogenèse approprié et la cicatrisation des plaies, et il joue aussi des rôles clés dans nombreuses maladies, incluant les cancer progression des maladies coronariennes et1 . 2 , 3 avoir une meilleure compréhension de comment l’angiogenèse se produit au cours du développement normal, et comment elle est réactivée dans des contextes pathologiques, est critique pour le développement du roman, thérapeutique efficace. Fidèle à vitro modèles qui récapitulent les étapes importantes et les types cellulaires impliqués dans l’angiogenèse in vivo sont nécessaires pour permettre aux chercheurs de mieux caractériser les mécanismes moléculaires conduisant l’angiogenèse et faire de nouvelles découvertes dans le règlement endothélial.
Nakatsu et Hughes ont optimisé un test de germination perle subit les nombreuses étapes connues de germination angiogenèse ont démontré que. 4 , 5 l’objectif de la méthode présentée ici est de s’appuyer sur le dosage optimisé par Nakatsu et Hughes en intégrant des perictyes à l’essai, afin que les rôles paracrine et juxtracrine des cellules murales dans les cellules endothéliales de germination peuvent être incorporés dans angiogenèse nouvelles études. Péricytes sont des cellules murales qui sont définies par leur rôle plus près de cellules qui maintiennent un contact physique avec des cellules endothéliales en raison de leur être incorporé dans les membranes basales vasculaires. 6 péricytes et les cellules endothéliales s’engagent dans la diaphonie complexe via les voies y compris Notch de signalisation signalisation, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ et bien d’autres. 7 , 8 modèles de souris déficientes dans ces voies de signalisation démontrent pericyte mauvaise couverture de développer un système vasculaire dans l’embryogenèse, conduisant à un remodelage vasculaire pauvre et système vasculaire dysfonctionnel. 7 en outre, le rôle des péricytes dans l’angiogenèse pathologique est importante mais souvent sous-estimée. Par exemple, une caractéristique unique du système vasculaire tumoral est que les navires sont plus immatures, qui fuit et dysfonctionnelle en raison de la couverture de mauvaise pericyte. 9 il a été suggéré que la présence ou l’absence des péricytes dramatiquement incidence sur le phénotype de la tumeur des vaisseaux sanguins et est un médiateur important de réponses aux anti-angiogéniques et thérapies antitumorales. 9 ainsi, y compris le rôle des péricytes dans des essais in vitro sont la clé pour saisir plus complètement les importants mécanismes de régulation endothéliale.
Bien qu’il existe de nombreux essais in vitro et ex vivo , actuellement utilisés pour étudier l’angiogenèse, il y a des lacunes à considérer dans chacun. Certains, comme la prolifération endothéliale et des essais de migration endothéliale, sont trop simplifiées et de se concentrer sur une seule fonction endothéliale en milieu isolé sur le plastique de culture de tissus. 10 autres épreuves se produisent en plus 3 Dimensions (3D) milieu, tels que le dosage de la formation du tube Matrigel,10 mais ces dosages sont encore trop simpliste et se concentrent davantage sur la capacité des cellules endothéliales à migrer et à former de novo vasculaire Ouvrages d’art, par opposition à la germination de vaisseaux préexistant. En outre, aucun de ces tests intègrent des types cellulaires murales. Il y a ex vivo modèles tels que l’essai d’aorte de bague qui incorporent des péricytes présents dans l’organe hôte, mais les manipulations génétiques de ces modèles sont beaucoup plus difficile en raison de la nécessité de générer des modèles de souris knock-out ou transgéniques de la voies d’intérêt. Le talon du test de germination est idéal car il modélise la germination endothéliale, prolifération, migration et formation même anastomose et lumen dans une matrice 3D. 4 le test permet fidèlement pour évaluation mécaniste des différentes étapes de la germination, tout en permettant la modification génétique directe des cellules endothéliales ou péricytes dans un milieu contrôlé plus nombreux. Les caillots de fibrine contenant les billes de germination peuvent être facilement fixés, colorés et imagés à différents stades de germination ; ces germes peuvent également être placés dans une chambre d’imagerie direct pour effectuer une imagerie en temps réel de la germination. La méthodologie présentée ici est idéale pour l’étude des mécanismes fondamentaux de l’angiogenèse par le biais de phénotypage de profondeur et une analyse approfondie des voies activées au cours de l’angiogenèse.

<table><tbody><tr><td>Pointes de pipette stériles</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC Media</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11095114</td><td>10T1/2 Media</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>NHLF</td></tr><tr><td>Media PBS de qualité culture tissulaire Gibco</td><td></td><td>14190-144</td><td>Sans magnésium ni calcium</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Pour le levage HUVEC</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>Pour le levage 10T 1/2 et NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNAs</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T 1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 3 billes de microsupport</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 6 et 10 cm recouvertes de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène de plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Thrombine</td><td>Sigma</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Tubes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur et capot</td><td></td><td></td><td></td>de culture tissulaire</tr><tr><td>Plaques à fond en verre à 24 puits</td><td>MatTek</td><td>P24G1.513F</td><td>Les plaques à fond en verre ne sont nécessaires que si les germes doivent être imagés. Sinon, le plastique de culture tissulaire est également acceptable.</td></tr><tr>Dispositif <td></td><td></td><td></td><td>de filtration stérile</td></tr></tbody></table>

incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

L’angiogenèse est la croissance de nouveaux vaisseaux du système vasculaire préexistante et est un élément important de nombreux processus biologiques, y compris l’embryogenèse et développement, la cicatrisation, la croissance tumorale et les métastases et les maladies cardiovasculaires et oculaires. Modèles efficaces in vitro qui récapitulent la biologie de l’angiogenèse sont nécessaires pour bien étudier ce processus et identifier les mécanismes de régulation qui peuvent être ciblés en fin de compte, de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le dosage de l’angiogenèse perle a été démontré précédemment pour récapituler les étapes multiples de germination endothéliales in vitro. Toutefois, une limitation de ce test est un manque d’endothéliales – interactions cellule murale, qui sont essentiels à la régulation moléculaire et phénotypique des cellules endothéliales function in vivo. Le protocole donné ici présente une méthodologie pour l’intégration de cellules murales dans le dosage de l’angiogenèse perle et montre une association étroite des cellules endothéliales et péricytes au cours de la germination in vitro. Le protocole détaille également une méthodologie de silençage efficace des gènes de cible à l’aide de siARN dans les cellules endothéliales pour études mécanistes. Au total, ce protocole prévoit un test in vitro qui mieux modélise les types de cellules différents impliqués dans l’angiogenèse de germination et fournit une plate-forme plus physiologiquement pertinents pour l’évaluation thérapeutique et découverte de mécanismes de régulation de l’angiogenèse.

Ce protocole permet une association étroite de la deux cellule types in vitro, et la présence de la péricytes vient compléter l’occurrence de germination (Figure 1 a, B). Le protocole permet également efficace silencieux (par exemple via l’interférence ARN) d’un gène d’intérêt dans un type de cellule d’intérêt comme (VEGFA spécifiquement dans les cellules endothéliales) ou PDGFRβ en péricytes7,</...

Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.

Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

L’objectif global de ce test est d’incorporer des interactions cellulaires hétérotypiques in vitro qui encapsulent la complexité de l’angiogenèse in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire sur l’importance des interactions entre les cellules endothéliales péricytaires au cours de l’angiogenèse. Le principal avantage de cette technique est qu’elle intègre les différentes étapes de la germination de l’angiogenèse, notamment la prolifération, la migration et l’anastomose, tout en permettant d’étudier les interactions entre les péricytes des cellules endothéliales.Commencez par reconstituer les billes de microsupport à une concentration de six fois 10 à quatre billes par millilitre de PBS, puis stérilisez la suspension de la bille de microsupport à l’autoclave. Ensuite, aliquotez un millilitre de milieu complet dans le nombre approprié de tubes FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) à fond rond, et ajoutez 20 microlitres de suspension de microporteurs stérilisés en autoclave refroidis à température ambiante dans chaque tube. Ajoutez un millilitre de cellules dans chaque tube.Agitez les tubes et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 2 1/2 à trois heures avec une légère agitation toutes les 20 minutes. À la fin de l’incubation, laissez reposer les cellules dans des billes à température ambiante pendant cinq minutes pour permettre aux cellules et aux billes de se déposer au fond des tubes. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, remplacez 0,5 millilitre de milieu de chaque tube par deux fois 10 à un cinquième péricytes et 0,5 millilitre de milieu complet.Agitez la suspension cellule-bille et remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius en les agitant doucement toutes les 20 minutes jusqu’à ce que les billes aient été agitées pendant un total de quatre heures. À la fin de l’incubation, agitez doucement les tubes une dernière fois et transférez immédiatement la totalité du volume de deux millilitres de solution de chaque tube dans des plaques individuelles de six centimètres. Ensuite, ajoutez trois millilitres supplémentaires de milieu complet dans chaque assiette et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin, examinez les boîtes de billes recouvertes de microsupports au microscope à un grossissement de 20 fois pour confirmer que toutes les billes ont été suffisamment recouvertes par les cellules endothéliales. Transférez les plaques dans une hotte à flux laminaire et utilisez une pipette P1000 pour aspirer vigoureusement et distribuer les solutions de billes enrobées afin de détacher les cellules du fond des plaques et de transférer les surnageants dans des tubes individuels. Laissez les billes se déposer au fond des tubes pendant trois minutes.Utilisez ensuite la pipette P1000 pour prélever autant de surnageants que possible sans déranger les grappes de billes. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de milieu complet par tube et laissez les billes se déposer pendant 30 à 60 secondes. Utilisez la pipette P1000 pour aspirer à nouveau le surnageant et lavez deux fois de plus les cellules endothéliales flottantes de la suspension de billes avec un milieu complet frais, comme nous venons de le démontrer.Après le troisième lavage, suspendez à nouveau les billes dans 2,5 millilitres de solution de fibrinogène. Ajouter 13 microlitres de solution de thrombine par puits dans une plaque à fond en verre de 24 puits. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de la solution de fibrinogène en billes dans chaque puits, en prenant soin de pipeter soigneusement les billes directement dans la thrombine, et de pipeter lentement de haut en bas deux à trois fois pour bien mélanger les solutions.Lorsque tous les puits ont été ensemencés, laissez la solution de thrombine-fibrinogène précoaguler dans la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à deux heures supplémentaires. Lorsque le gel s’est complètement solidifié, mettez à nouveau en suspension les fibroblastes pulmonaires humains normaux à une concentration de deux fois 10 à quatre cellules par millilitre dans un milieu complet, et ajoutez un millilitre de fibroblastes dans chaque puits.Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le strict respect du protocole d’enrobage se traduira par des billes enduites de cellules avec un aspect rugueux, semblable à celui d’une balle de golf, comme illustré dans cette image représentative de billes suffisamment enrobées qui sont prêtes pour l’implantation de gel de fibrine. De plus, ce protocole facilite une association étroite des deux types de cellules in vitro avec la présence des péricytes complétant l’apparition de la germination.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de recouvrir complètement les billes de cellules pendant les étapes d’agitation et d’intégrer soigneusement les billes dans le gel de fibrine sans introduire de bulles lors de l’implantation du gel. Suite à cette procédure, d’autres analyses comme des études d’angiogenèse chez la souris peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que quelle est la pertinence in vivo des mécanismes et des phénotypes explorés dans le test de germination des billes de péricytes in vitro ? Cette technique sera utile aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer et de l’exploration des interactions et des fonctions des péricytes des cellules endothéliales dans un modèle in vitro de l’angiogenèse plus pertinent sur le plan physiologique.

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