CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

L’objectif global de cette approche de transfert de gènes in vivo basée sur l’électroporation est d’évaluer les rôles des gènes d’intérêt dans la différenciation des cellules granulaires cérébelleuses à l’aide d’analyses de perte de fonction médiées par CRISPR. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les neurosciences du développement et les neuro-oncologies, telles que l’identification des molécules importantes pour le développement cérébelleux normal et la formation des tumeurs cérébrales. La procédure d’électroporation in utero sera démontrée par le Dr Lena Herbst, post-doc du laboratoire du professeur Peter Lichter, puis l’immunohistochimie suivante sera réalisée par le Dr Weijun Feng, post-doctorant du laboratoire du Dr Haikun Di.

Le principal avantage de cette méthode est de s’efforcer d’inactiver les gènes d’intérêt dans les cellules cérébelleuses, en utilisant les technologies CRISPR-cas9, au lieu de générer la combinaison d’animaux knock-out. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des fonctions des gènes au cours du développement cérébelleux normal, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que le développement d’autres régions physiques du cerveau et la modélisation des tumeurs cérébrales. Commencez par charger un capillaire en verre borosilicaté dans un extracteur de micropipette et tirez pour créer une pointe fine.

Étiquetez l’embout capillaire avec de l’encre noire pour une meilleure visualisation lors de l’injection, et dessinez un détartrage sur le verre. En travaillant sous un stéréomicroscope, utilisez une règle et une pince à épiler à aiguille pointue pour couper la pointe à une longueur d’environ six millimètres et créer un bord biseauté tranchant et unilatéral. Filtrez une solution de pâte verte rapide à 1 % à travers un filtre à point zéro de 22 microns pour éliminer les particules de colorant de la solution.

Mélangez les plasmides d’ARN à guide unique à parts égales avec le plasmide rapporteur de la luciférase jusqu’à une concentration finale d’au moins un microgramme par millilitre pour chaque plasmide. Colorez la solution plasmidique en vert rapide à une concentration finale de 0,5 %Après avoir anesthésié une souris CD-1 enceinte avec de l’isoflurane, placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et administrez un analgésique. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie.

Fixez la lentille avec du ruban adhésif et stérilisez l’abdomen avec un désinfectant. Couvrez la souris avec de la gaze, en ne laissant que la zone chirurgicale exposée. Après avoir fait une incision cutanée d’environ deux centimètres de longueur, localisez la linea alba et utilisez des ciseaux à tissus à bout émoussé pour faire une deuxième incision légèrement plus petite à travers le péritoine.

Humidifiez la cavité abdominale ouverte avec du PBS stérile préchauffé. Ensuite, utilisez une pince à anneau pour extraire soigneusement les cornes utérines de la cavité abdominale. Saisissez la paroi utérine au niveau de l’espace entre les sacs vitellins de deux embryons voisins et tirez doucement.

Évitez toute pression sur l’embryon tout en le tirant à travers l’incision. Une fois les cornes utérines extraites, aspirez environ 10 à 15 microlitres de solution plasmidique colorée avec le capillaire de verre préparé. Évitez les bulles d’air pendant ce processus.

Tenez doucement l’embryon à l’aide d’une pince à anneau et localisez la zone du cou. Pénétrer lentement le cerveau postérieur dorsal avec l’extrémité du capillaire de verre et se déplacer dans le quatrième ventricule. Injectez environ un microlitre du mélange plasmidique.

Confirmez que l’ADN coloré n’a pas fui du cerveau et qu’il est visible sous la forme d’une structure en forme de diamant. Ici, il est très important de remplir toute la région du quatrième ventricule avec une solution plasmidique, pour délivrer de l’ADN également à la partie distale du primordium cérébelleux. Dans le même temps, assurez-vous de ne pas provoquer de saignement pendant ce processus.

Placez une pince à épiler en platine, équipée de plaques d’électrodes de cinq millimètres de diamètre, latéralement sur la tête de l’embryon, avec le pôle négatif couvrant l’oreille et le pôle positif positionné sur le primordium cérébelleux au-dessus de la paroi utérine, et appliquez des impulsions électriques carrées. Lorsque tous les embryons ont été électroporés, replacez soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale et remplissez-les de PBS stérile. Laissez les cornes utérines glisser dans une position naturelle.

Éteignez l’anesthésie et placez l’animal sur le ventre dans une nouvelle cage pour récupérer. Avant la cryosection, fixez le cervelet pendant la nuit dans cinq millilitres de 4 % de PFA en PBS par cerveau, à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez le cervelet fixe à dix millilitres de 30 % de saccharose dans PBS par cerveau, et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, une fois que le tissu a coulé au fond du tube, retirez les cerveaux du saccharose et absorbez la solution de saccharose restante avec un morceau de papier filtre en cellulose. Ensuite, plongez chaque cervelet dans un composé à température de coupe optimale dans un moule en plastique jetable et congelez-le sur de la glace sèche. Coupez le bloc cryogénique en sections de 10 microns d’épaisseur, à l’aide d’un cryostat, et maintenez les sections à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation.

Lorsque vous êtes prêt à procéder à l’immunomarquage, séchez d’abord les lames à température ambiante pendant 30 minutes, puis lavez-les deux fois pendant 10 minutes à chaque fois dans du PBS. Encerclez les sections avec un stylo bloqueur de liquide et incubez les sections dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Ajoutez des anticorps primaires contre les molécules d’intérêt dans la solution bloquante et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez les lames avec du Triton à 0,1 % contenant du PBS trois fois pendant 10 minutes chacune. Ajoutez ensuite un anticorps secondaire conjugué au fluorophore dilué dans une solution bloquante contenant du DAPI, et incubez les sections pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les lames dans PBS-T trois fois pendant 10 minutes à chaque fois, puis montez les lames et maintenez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.

Les lymphocytes T hek293T exprimant de manière stable streptococcus pyogenes cas9 ont été transfectés avec des plasmides exprimant et ciblant l’ARNsg. L’expression de la GFP dans les cellules vivantes a été surveillée à l’aide d’un imageur cellulaire fluorescent 48 heures après la transfection. Cette image montre une séquence d’ARNsg affectée basée sur l’expression de la GFP.

Cette image montre l’absence d’expression de la GFP résultant d’une séquence d’ARNsg inefficace. Ces images montrent l’immunocoloration de GFP, Ki67 et p27 dans le cervelet à partir d’une souris knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 avec une cassette d’arrêt floxée et des séquences bicistroniques cas9 et EGFP en aval, qui a été soumise à une électroporation à E13.5 avec un plasmide Cre exprimant l’ARNsg témoin. La section est contre-teintée avec du DAPI.

Notez les cellules exprimant la GFP dans la couche cellulaire granulaire externe marquée par Ki67. Une fois maîtrisée, cette chirurgie peut être réalisée en moins de 30 minutes par souris. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler l’embryon avec beaucoup de soin, de toujours utiliser des capillaires à pointe pointue et de positionner les électrodes dans un angle précis pour assurer la transmission des impulsions électriques au toit du quatrième ventricule.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences médicales pour explorer les facteurs causaux des troubles neurologiques, y compris les tumeurs cérébrales dans le cervelet de la souris.