Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel

L’objectif global de cette expérience est de générer des banques de séquençage de nouvelle génération à partir de l’ADN et de l’ARN de petites populations de cellules sans diviser l’échantillon à aucun point. Cette méthode offre aux chercheurs une nouvelle approche pour étudier les variations structurelles de l’ADN sur l’expression des gènes. Lorsque nous avons imaginé Gel-seq pour la première fois, il n’y avait pas de protocoles pour séquencer simultanément l’ADN et l’ARN du même échantillon.

Heureusement, il existe maintenant trois approches publiées qui résolvent ce problème. Le principal avantage de cette technique est que les informations génomiques et transcriptomiques peuvent être obtenues à partir du même ensemble de cellules pour un coût supplémentaire négligeable. Gel-seq a été développé à l’origine avec des cassettes verticales, cependant, ce protocole peut être adapté pour fonctionner avec n’importe quelle cassette d’électrophorèse sur gel standard.

Préparez les mélanges de remplissage, de haute densité et de précurseurs de faible densité dans trois tubes. Ajouter les réactifs dans l’ordre décrit et agiter le mélange. N’ajoutez prématurément ni APS ni Temed.

Attendez jusqu’à ce que l’on vous le dise. Ensuite, dégazez chaque solution de gel monomère en insérant d’abord une aiguille à travers le capuchon. Ensuite, connectez l’aiguille à une conduite d’aspiration domestique et immergez cet ensemble dans un bain à ultrasons.

Attendez environ une minute jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles qui sortent du liquide. Ensuite, au mélange de précurseurs de remplissage, ajoutez brièvement le Temed et l’APS et le vortex. Dans les trois minutes, utilisez une pipette d’un millimètre pour ajouter six millimètres à chaque cassette de gel sans renverser.

Assurez-vous que le liquide est de niveau en positionnant les cassettes à la verticale sur une table de niveau. Ensuite, complétez progressivement les cassettes avec de l’eau ionisée dégazée, en prenant soin de minimiser le mélange de polymérisation avec l’eau. Ensuite, laissez le polymère durcir pendant une heure à toute la nuit.

Une fois le polymère durci, videz le revêtement d’eau et, à une distance de six pouces, utilisez un léger jet d’air comprimé pour sécher la surface du gel. Ensuite, ajoutez Temed et APS au précurseur de gel haute densité, et vortex brièvement. En trois minutes, transférez 320 microlitres dans chaque cassette et étalez-le sur la couche de gel de remplissage en balançant la cassette d’avant en arrière plusieurs fois.

Ensuite, remplissez les cassettes avec de l’eau déminéralisée et dégazée et laissez le polymère durcir pendant environ une heure. Une fois durci, séchez le polymère comme précédemment. Enfin, ajoutez Temed et APS au mélange de précurseurs de gel de faible densité et vortex-le.

Ensuite, remplissez rapidement le reste des cassettes avec ce mélange et insérez les peignes de gel avant qu’il ne commence à durcir. Maintenant, ajoutez l’excédent de précurseur de réserve sur le rayon à adsorber lors de la polymérisation. Après durcissement, la cassette est prête à l’emploi.

Après avoir converti l’ARN en ADNc, utilisez un gel pour récupérer la fraction d’intérêt. Tout d’abord, nettoyez soigneusement la chambre d’électrophorèse à l’aide de plusieurs millilitres d’un produit d’élimination de l’ADN et d’une lingette non pelucheuse. Ensuite, remplissez la chambre d’XTBE propre et de point zéro cinq, placez l’ensemble de l’appareil dans un four de réticulation UV de 254 nanomètres et stérilisez-le pendant 15 minutes.

Maintenant, insérez une cassette Gel-seq dans la chambre d’électrophorèse et verrouillez-la en place. Ensuite, retirez lentement le peigne à gel en tirant doucement vers le haut sans déchirer le gel. Maintenant, chargez les échantillons à l’aide d’une pipette.

Insérez complètement l’embout dans les puits lors du chargement des échantillons afin de minimiser les risques de contamination entre les puits. Appliquez un champ électrique de 250 volts sur la cassette Gel-seq pendant 30 minutes pour séparer l’ADNg des hybrides ADNc/ARN. Après avoir chargé, exécuté et collecté le gel, utilisez un scalpel pour couper le gel en deux juste en dessous de la couche haute densité et jetez la moitié du gel de remplissage.

Ensuite, décollez délicatement le gel restant de la cassette en utilisant soigneusement un outil de grattage. Après avoir vérifié la séparation à l’aide d’un document en gel, utilisez un transilluminateur pour exciser les bandes. L’ADNg doit être situé au début du gel de faible densité, et l’ADNc doit être à l’interface des régions de faible et de haute densité.

Maintenant, utilisez un scalpel pour découper les régions du gel contenant l’ADNg et l’ADNc. Retirez également les mêmes sections de la voie de contrôle négatif. À l’aide d’une pince à épiler émoussée, transférez doucement les sections du gel dans des tubes à bandelettes.

Si le gel se brise, trouvez et transférez tous les morceaux cassés dans le tube. Ensuite, broyez chaque gel en effectuant des mouvements circulaires et en appuyant avec une pointe de pipette. Avant de retirer les pointes, ajoutez 40 microlitres d’eau sans nucléase à l’ADNg et 80 microlitres aux échantillons d’ADNc.

Ensuite, retirez et jetez soigneusement les pointes. Maintenant, fixez les tubes de bande à un mélangeur vortex à 37 degrés Celsius et secouez-les pendant huit à 12 heures. L’ADN va ainsi s’échapper du gel.

Après l’agitation, pipetez les échantillons dans une plaque filtrante à mailles de huit microns. Ensuite, faites tourner l’assiette à 2 600 g pendant cinq minutes pour filtrer les fragments de gel. Ensuite, soulevez la plaque filtrante à mailles de la plaque de logement et utilisez une pipette pour transférer les échantillons sans gel de la plaque vers de nouveaux tubes à bandelettes de 200 microlitres.

À chaque échantillon contenant de l’ADNg, ajoutez un microlitre de protéase et pipetez de haut en bas pour bien mélanger. Ensuite, incubez les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes. Poursuivez avec une activation de chauffage à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Cette étape de déplétion des nucléosomes est cruciale. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 pour percer un trou dans le capuchon de chaque tube d’échantillon. Ensuite, utilisez un aspirateur pour réduire les échantillons d’ADNg à cinq microlitres et les échantillons d’ADNc à 10 microlitres.

Si le volume descend en dessous de la cible, ajoutez de l’eau exempte de nucléases au besoin. Les hybrides d’ADNg et d’ADNc/ARN ont été physiquement séparés à l’aide du dispositif Gel-seq. Le contrôle négatif n’a pas d’auto-fluorescence du gel aux interfaces.

Les échelles d’ADN ne montrent qu’une bande sombre à l’interface entre les membranes de faible et de haute densité, révélant que de petits fragments peuvent passer à travers le gel de faible densité. Un échantillon biologique de 500 cellules PC3 montre la séparation souhaitée de l’ADN génomique et des hybrides ADNc/ARN. Une bande sombre au sommet de la membrane de faible densité est de l’ADN génomique à l’échelle de la mégabase, tandis que les hybrides ADNc/ARN sont empilés à l’interface des régions de faible et de haute densité.

Les petits fragments de paires de bases inférieures à 100 sont des produits hors cible générés par des oligonucléotides d’amorce pendant la transcription inverse et sont à prévoir. Les banques ont été générées à partir de 500 cellules PC3 ou 750 cellules HeLa. Les distributions de fragments des banques appariées générées à partir de Gel-seq ont été comparées à des échantillons non appariés générés avec des protocoles standard.

La distribution des fragments de nucléotides était similaire avec les deux méthodes. Les résultats de séquençage de la banque de cellules PC3 ont été comparés aux méthodes traditionnelles. Les variations du nombre de copies à l’échelle du génome ont été comparées.

Statistiquement, les deux méthodes ont obtenu des résultats similaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des banques de séquençage de nouvelle génération appariées pour l’ADN et l’ARN à partir du même échantillon de départ. Comme pour toute expérience de séquençage à faible entrée, il est impératif de ne pas oublier de maintenir un environnement de travail propre.

Vous devez faire très attention à la stérilisation des tubes et des gants de nettoyage. Même avec ces précautions, les expériences échouent parfois en raison de la contamination. Une note importante, l’omniprésence et la sécurité des gels de polyacrylamide font qu’il est facile d’oublier que les précurseurs de fabrication sont des neurotoxines dangereuses.

Vous devez toujours travailler avec ces réactifs dans une hotte et nettoyer immédiatement tout déversement. Nous avons conçu Gel-seq pour qu’il soit simple à mettre en œuvre par les chercheurs dans leurs propres laboratoires, et nous espérons que cela facilitera l’adoption rapide de cette technologie.