Name: Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez Gel-seq, une méthode innovante pour préparer simultanément des bibliothèques de séquençage ADN et ARN à partir de petites populations cellulaires. Cette technique économique facilite l'étude des variations structurelles de l'ADN et de leur impact sur l'expression génique.

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Financement de ce travail a été fourni par l’Université de San Diego, la National Science Foundation recherche Fellowship programme d’études supérieures, accorder des NIH R01-HG007836 et par le ministère coréen des sciences, de TIC et de la planification Future.
Les versions antérieures d’une plusieurs personnalités ont été tout d’abord publiées dans « Hoople, G. D. et al. Gel-seq : génome entier et séquençage de transcriptome de faibles intrants ADN et l’ARN bibliothèque préparation simultanée à l’aide de barrières semi-perméables hydrogel. Laboratoire sur une puce 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). » Laboratoire sur une puce a sanctionné la réutilisation des figures dans cette publication.

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</ol>

KZ est membre fondateur et conseiller scientifique de Singlera Genomics Inc.

Il y a plusieurs étapes critiques associées à la fabrication de dispositifs de Gel-seq ainsi que le protocole lui-même. Pendant la fabrication, nous vous recommandons de commencer avec les épaisseurs de couche prescrite pour les différentes régions du gel. Nous avons passé beaucoup de temps test options de fabrication différente et le protocole décrit ici produit les meilleurs dispositifs pour les cassettes répertoriés dans Table des matières et réactifs. Si les chercheurs utilisent un système de cassett...

Prochaine génération séquençage (NGS) a eu un impact profond sur le déroulement de la recherche en génétique. Là où autrefois, chercheurs se sont penchés sur le séquençage du génome d’une espèce entière, il est maintenant possible de séquencer le génome d’une tumeur unique ou même une seule cellule dans une expérience. 1 NGS a également rendu rentable pour séquencer les transcriptions d’ARN présentes dans une cellule, une collection de données appelées le transcriptome. La capacité d’amplifier et de séquences d’ADN ou ARN de petits échantillons de départ est parvenue seulement dans les cinq dernières années. 2 , 3 , 4 malheureusement, protocoles standard sont incompatibles et chercheurs doivent choisir de séquence d’ADN ou ARN pour un échantillon donné. Lorsqu’un échantillon de départ est assez grand, il peut être divisé en deux. Toutefois, à des échelles plus petites, perte de matériel en raison de la séparation des échantillons peut affecter la qualité de la bibliothèque et mise en commun des échantillons peut moyenne des variations intéressantes entre les cellules. 5 par ailleurs, les chercheurs sont plus en plus intéressés à l’examen d’échantillons qui ne peut pas être divisés, comme des cellules individuelles ou des biopsies de petite tumeur hétérogène. 6
Pour résoudre ce problème, trois protocoles ont récemment été mis au point pour séquencer l’ADN et l’ARN de l’échantillon de départ même : Gel-seq7, G &amp; T-seq8et9de la DR-seq. Cet article présente un protocole détaillé pour Gel-seq, qui peut être utilisé pour générer simultanément bibliothèques d’ADN et d’ARN à partir d’aussi peu que 100 cellules au surcoût négligeable. La nouveauté de Gel-seq est la capacité de séparer l’ADN et l’ARN fondée exclusivement sur la taille à l’aide de matrices de faible coût hydrogel. L’innovation de base du protocole Gel-Seq est la séparation physique de l’ADN de l’ARN. Cette séparation se fait par électrophorèse en utilisant une combinaison des membranes de polyacrylamide qui tirent parti de la différence de taille entre ces molécules. Pour mettre ces différences de taille en contexte, examiner comment l’ADN et l’ARN sont imagés : alors que l’ADN existe sur l’échelle de micron et peut être consulté à l’aide de microscopes traditionnels, ARN existe à l’échelle du nanomètre et doit être copié à l’aide de techniques complexes comme cryo-electron microscopie. 10
L’approche à la séparation de l’ADN et l’ARN dans le présent protocole est illustré à la Figure 1. Le panneau de gauche montre l’ADN et l’ARN libre flottant dans la solution près d’une membrane. Lorsqu’un champ électrique est appliqué, comme indiqué dans le panneau de droite, ADN et l’ARN l'expérience une force électrophorétique qui induit la migration à travers la membrane. En ajustant les propriétés de la membrane, nous avons créé une membrane semi-perméable qui sépare l’ADN de l’ARN. Les molécules d’ADN sont poussés contre la membrane, mais sont accrocher au bord à cause de leur grande taille. En revanche, les petites molécules d’ARN, peuvent reconfigurer et tissent leur chemin à travers la membrane. Ce processus, connu comme la reptation, est semblable à la manière de qu'un serpent se déplace dans l’herbe. Finalement, ces molécules d’ARN sont arrêtés par une deuxième membrane haute densitée qui est trop difficile pour les polymères encore plus petits (&gt; 200 paires de bases) de se soustraire à travers. Une fois physiquement séparés, l’ADN et l’ARN peuvent être récupérées et traitées pour générer des informations sur le génome et le transcriptome. Alors que nous pouvons séparer les ADN et ARN, nous avons identifié les meilleurs résultats sont obtenus si l’ARN est inverse, transcrit d’ADNc avant la séparation. Les hybrides de cDNA/ARN sont plus stables que RNA seule et peuvent toujours passer à travers la membrane de faible densitée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Figure 1 . Principe de fonctionnement de gel-seq. Le principe sous-jacent utilisé pour séparer physiquement les ADN et ARN. Dans un champ électrique appliqué, petites molécules d’ARN migrent à travers la membrane de faible densitée, mais grosses molécules d’ADN sont pris au piège à la surface. Ce chiffre a été reproduit de Réf. 7 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Cet article décrit en détail les deux la fabrication de l’appareil de Gel-seq et le protocole biologiques pour générer jumelé bibliothèques d’ADN et d’ARN. Un aperçu des deux est illustré à la Figure 2. Le dispositif est fabriqué par marcottage trois densité différente des gels de polyacrylamide uns sur les autres dans un processus similaire à la création des gels empilables standard. 11 le protocole biologique commence par 100-1000 cellules suspendues dans du PBS. Les cellules sont lysées et l’ARN est convertie en ADNc avant que l’appareil est utilisé pour séparer l’ADN génomique des hybrides cDNA/ARN. Après la séparation et de récupération, génomique et transcriptomique bibliothèques sont préparés à l’aide d’un processus qui suit de près le protocole de kit de préparation de bibliothèque standard du génome entier. Plus de détails sur le développement et la validation de Gel-seq peut être lu dans son laboratoire sur une publication de la puce « Gel-seq : génome entier et le séquençage de transcriptome de faibles intrants ADN et l’ARN bibliothèque préparation simultanée à l’aide de barrières semi-perméables hydrogel ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Figure 2 . Protocole gel-seq. Une vue d’ensemble des étapes pour fabriquer le dispositif Gel-seq et le protocole à généré jumelé bibliothèques d’ADN et d’ARN. Certaines parties de cette figure ont été reproduits à partir Réf. 7 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour générer des bibliothèques de l’ADN et l’ARN de cellules individuelles, les chercheurs doivent envisager d’utiliser soit G &amp; T-seq ou DR-suiv. G &amp; T-Seq, comme Gel-seq, repose sur une séparation physique de l’ARN de l’ADN génomique. Cette approche s’appuie sur l’ARN messager (ARNm) 3′ polyadénylé queue comme une menu déroulant cible. L’ARNm est capturée sur une pastille magnétique utilisant une amorce d’oligo-dT biotinylé. Une fois l’ARNm a été capturée, les perles sont maintenus en place avec un aimant et le surnageant contenant l’ADN genomic peut être enlevé et transféré dans un autre tube. Après que cette séparation physique est terminée, bibliothèques distinctes peuvent être générés de l’ARNm et l’ADN. 8 cette approche fonctionne bien si l’ARN d’intérêt est polyadénylé, cependant il ne peut pas servir à étudier non polyadénylé transcriptions, tels que les ARN ribosomiques, ARNt ou l’ARN des procaryotes.
DR-seq s’appuie sur une étape de pré amplification où l’ADN et ADNc dérivé de l’ARN sont amplifiés dans le même tube. L’échantillon est alors divisé en deux et traitée en parallèle de préparer des bibliothèques d’ADN - et RNA-seq. Pour distinguer l’ADN génomique et l’ADNc dérivé de RNA, DR-seq adopte une approche computationnelle. Séquences où se trouvent seulement les exons sont supprimés par le calcul dans les données d’ADN génomiques, comme ceux qui pourraient provenir de l’ADN ou ARN. 9 un avantage de cette approche est que l’ADN et l’ARNC/ARN ne doivent pas être physiquement séparés comme cela se fait en Gel-seq et G &amp; T-suiv. L’inconvénient, cependant, est que DR-seq nécessite une connaissance a priori du génome et du transcriptome (c.-à-d., les exons et introns) et qu’il n’est peut-être pas idéal pour des applications telles que le séquençage de noyaux, dans lequel plusieurs transcriptions ne sont pas encore pleinement épissé et contiennent encore des introns. 12
La nouveauté de Gel-seq est la capacité de séparer l’ADN et l’ARN dans des centaines de cellules basées exclusivement sur la taille. Cette méthode nécessite aucune connaissance a priori du génome ou du transcriptome, est robuste contre l’épissage incomplète et n’est pas limitée aux transcriptions de poly-adenylated. Pour les applications où un chercheur peut commencer avec au moins 100 cellules, Gel-seq offre une approche simple à l’aide de matériaux bon marché et largement disponible.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide Monomère</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Perles Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Désigné dans le texte comme billes d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI)</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel d’ADN (6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Désigné dans le texte sous le nom de 6X loading dye</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST ONE-STEP QRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Désigné dans le texte par 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&prime ;-Methylenebis(acrylamide)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Aussi connu sous le nom de bis-acrylamide</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (désigné dans le texte comme kit de préparation de bibliothèque)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Comprend : TD (désigné dans le texte comme tampon de transposase), ATM (appelé dans le texte tampon de transposase), NT (appelé dans le texte tampon d’arrêt de transposase) et NPM (appelé dans le texte mélange PCR de préparation de bibliothèque)</td></tr><tr><td>Eau</td> <td>sans nucléaseMillipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (appelé dans le texte kit d’amplification de transcrits entiers (WTA)Takara</td><td>/Clontech</td><td>634888</td><td>Comprend : Tampon de lyse, inhibiteur de RNase, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (appelé dans le texte amorce RT), 5X Ultra Low First strand Buffer (appelé dans le texte premier brin buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (désigné dans le texte par le nom d’oligonucléotide de commutation de modèle (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (appelé transcriptase inverse dans le texte) et PCR Primer II A (appelé dans le texte amorce PCR d’ADNc)</td></tr><tr><td>Hexamère aléatoire avec adaptateur WTA&nbsp ;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime ;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime ;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Décontaminant de surface</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Désigné dans le texte comme produit de prélèvement d’ADN</td></tr><tr><td>Tampon Tris-Borate-EDTA (concentration 10X)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (concentré 10,000X dans DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific S11494</td><td>Désigné dans le texte sous le nom de gel stain</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp ; aiguilles de seringue, jauge 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons série Branson CPX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Cassettes de gel vides, mini, 1,0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Plaque filtrante à mailles - Corning&nbsp ; Supports perméables aux puits HTS Transwell 96 - 8.0 & micro ; m taille des pores</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Désigné dans le texte comme 8 um mesh filter plate</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Concentrateur Vacufuge</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Système XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Système de détection PCR en temps réel Bio-Rad CFX96 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp ;</td><td>Tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Discontinué, tout matériel équivalent est acceptable</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Désigné dans le texte comme gel</td></tr><tr><td>imager Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Désigné dans le texte comme transilluminateur UV</td></tr><tr><td>&nbsp ; Ultrasons&nbsp ; Bain</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Tout bain à ultrasons équivalent est acceptable.</td></tr></tbody></table>

gel-seq : procede de preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’adn et l’arn à l’aide de matrices d’hydrogel

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

La capacité d’amplifier et de séquences d’ADN ou ARN de petits échantillons de départ est parvenue seulement dans les cinq dernières années. Malheureusement, les protocoles standard pour la production génomique ou bibliothèques de transcriptomique sont incompatibles et chercheurs doivent choisir de séquence d’ADN ou ARN pour un échantillon donné. Gel-seq résout ce problème en permettant aux chercheurs préparer simultanément des bibliothèques pour les ADN et d’ARN à partir de 100-1000 cellules à l’aide d’un dispositif simple hydrogel. Cet article présente une approche détaillée pour la fabrication de l’appareil ainsi que le protocole biologiques pour générer des bibliothèques appariés. Nous avons conçu le Gel-seq afin qu’il pourrait être facilement mis en œuvre par d’autres chercheurs ; de nombreux laboratoires de génétique ont déjà l’équipement nécessaire pour reproduire la fabrication de dispositifs de Gel-seq. Notre protocole emploie couramment utilisé des kits pour les deux ensemble-transcription amplification (WTA) et préparation de bibliothèque, qui sont également susceptibles d’être familière aux chercheurs déjà versé dans la génération génomique et transcriptomique bibliothèques. Notre approche permet aux chercheurs de mettre à profit la puissance du séquençage de l’ADN et l’ARN sur un seul échantillon sans le découper et avec surcoût négligeable.

La séparation physique des hybrides ADNg et cDNA/ARN dans le dispositif de Gel-seq peut être visualisée par l’imagerie gel fluorescent ; un résultat représentatif est illustré à la Figure 3. Paroi A montre le dispositif fabriqué de Gel-seq ; fausses couleurs a été ajouté pour distinguer les gel de différentes régions. Panneau B apparaît une fermeture de quatre départs différents utilisés pour la validation. La troisième voie, un contrôle négatif, représente à...

Gel-seq permet aux chercheurs de préparer simultanément les bibliothèques pour les deux ADN - et RNA-seq au surcoût négligeable à partir de 100-1000 cellules à l’aide d’un dispositif simple hydrogel. Cet article présente une approche détaillée pour la fabrication de l’appareil ainsi que le protocole biologiques pour générer des bibliothèques appariés.

Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

L’objectif global de cette expérience est de générer des banques de séquençage de nouvelle génération à partir de l’ADN et de l’ARN de petites populations de cellules sans diviser l’échantillon à aucun point. Cette méthode offre aux chercheurs une nouvelle approche pour étudier les variations structurelles de l’ADN sur l’expression des gènes. Lorsque nous avons imaginé Gel-seq pour la première fois, il n’y avait pas de protocoles pour séquencer simultanément l’ADN et l’ARN du même échantillon.Heureusement, il existe maintenant trois approches publiées qui résolvent ce problème. Le principal avantage de cette technique est que les informations génomiques et transcriptomiques peuvent être obtenues à partir du même ensemble de cellules pour un coût supplémentaire négligeable. Gel-seq a été développé à l’origine avec des cassettes verticales, cependant, ce protocole peut être adapté pour fonctionner avec n’importe quelle cassette d’électrophorèse sur gel standard.Préparez les mélanges de remplissage, de haute densité et de précurseurs de faible densité dans trois tubes. Ajouter les réactifs dans l’ordre décrit et agiter le mélange. N’ajoutez prématurément ni APS ni Temed.Attendez jusqu

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

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Dans cet article, nous présentons et discutons de nouveaux développements dans la synthèse et les applications des microarrays d'acide nucléique fabriqués in situ. Plus précisément, nous montrons comment les protocoles de synthèse de l'ADN peuvent être étendus à l'ARN et comment les microréseaux peuvent être utilisés pour créer des bibliothèques d'acide nucléique récupérables.

Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

Un goulot d’étranglement dans le cycle de «conception-construction-test» de l’ingénierie microbienne est la vitesse à laquelle nous pouvons effectuer des écrans fonctionnels de souches. Nous décrivons une méthode à haut débit pour le criblage des souches appliquée à des centaines à des milliers de cellules de levure par expérience qui utilise le séquençage à base d’ARN à base de gouttelettes.

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d'ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Découvrez Gel-seq, une méthode innovante pour préparer simultanément des bibliothèques de séquençage ADN et ARN à partir de petites populations cellulaires. Cette technique économique facilite l'étude des variations structurelles de l'ADN et de leur impact sur l'expression génique.

Gel-seq : PROCEDE de Preparation de bibliothèque simultanée de séquençage de l’ADN et l’ARN à l’aide de Matrices d’Hydrogel

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