Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

L’objectif global de cette méthodologie est de visualiser l’une des premières étapes de l’activation d’un initiateur de caspases. Cette étape est appelée proximité induite et se produit lorsque les molécules de caspase se rassemblent pour former des dimères actifs pendant la mort cellulaire apoptotique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des caspases, telles que quand, où et avec quelle efficacité des caspases initiatrices spécifiques peuvent être activées.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser en temps réel l’assemblage des complexes d’activation des caspases dans les cellules vivantes. Cette méthode de complémentation par fluorescence biomoléculaire utilise des fragments de la protéine thyroxine, Venus, qui ont été infusés à une caspase. Les fragments ne sont pas fluorescents par eux-mêmes, mais lorsque la caspase subit une proximité induite, cela rapproche les deux moitiés de Vénus et elles s’allument.

Pour transfecter les cellules, ajoutez d’abord 12 microlitres de réactif de transfection à 750 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube de stéroïde. Incuber le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 10 nanogrammes d’un plasmide rapporteur dans un tube de steryle de 1,5 millilitre pour chaque puits à transfecter.

Ajoutez 20 nanogrammes de chaque plasma de caspase BiFC dans chaque tube. Amenez chaque tube à un volume total de 100 microlitres en ajoutant un milieu sérique réduit. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de solution de réactif de transfection au mélange plasmidique de manière goutte à goutte.

Après avoir incubé le mélange de réactifs de transfection plasmidique pendant 20 minutes à température ambiante, aspirez le milieu des cellules à l’aide d’une pipette ou par aspiration. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, pipetez doucement 800 microlitres de milieu sans sérum sur le côté du puits. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 200 microlitres du complexe lipidique de l’ADN goutte à goutte dans chaque puits.

Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, prélever le milieu exempt de sérum contenant les complexes lipidiques de l’ADN par aspiration ou à la pipette en prenant soin de ne pas perturber la monocouche. Pipetez doucement deux millilitres de milieu de croissance complet préchauffé sur le côté de chaque puits avant d’incuber les cellules comme décrit dans le protocole de texte.

Avant l’acquisition des données, effectuez l’induction de l’activation de la caspase comme décrit dans le protocole texte. Allumez le microscope en suivant les instructions du fabricant et lancez le logiciel d’acquisition. Sélectionnez l’objectif à huile 60x ou 63x et placez une goutte d’huile sur l’objectif.

Placez ensuite la boîte de culture sur la platine du microscope à l’aide du porte-plaque approprié. Allumez le chauffage et réglez la température à 37 degrés Celsius. Concentrez-vous sur la fluorescence du rapporteur à l’aide du laser RFP ou du filtre.

Entrez le pourcentage de puissance laser à 50 % et le temps d’exposition à 100 millisecondes pour Vénus et RFP comme point de départ pour déterminer les paramètres optimaux à utiliser pour l’expérience. Activez la capture en direct et inspectez l’image résultante et les histogrammes affichés pour les deux canaux. Si le signal est faible et que l’image est difficile à distinguer, augmentez le pourcentage de puissance laser et/ou le temps d’exposition par incréments jusqu’à ce que le signal et l’image soient bons.

Ensuite, sélectionnez ou ouvrez le module Z stack dans le logiciel du microscope. Ajustez la mise au point dans une direction jusqu’à ce que la cellule ne soit plus visible. Sélectionnez cette position en haut.

Ajustez la mise au point dans la direction opposée jusqu’à ce que la cellule ne soit plus visible et sélectionnez-la comme position basse. Choisissez la taille de pas optimale et lancez l’acquisition. Si nécessaire, ajustez l’histogramme d’affichage pour améliorer l’aspect visuel du signal fluorescent.

Enfin, utilisez un logiciel de rendu tridimensionnel pour reconstruire l’image 3D. Si une source de dioxyde de carbone est disponible, placez le dispositif d’administration de dioxyde de carbone sur le dessus du support de plaque. Réglez le niveau de dioxyde de carbone sur 5 % et allumez le contrôleur de dioxyde de carbone depuis le logiciel.

Accédez à un champ de cellules transfectées. Visualisez l’image en direct des cellules telle qu’acquise par la caméra et affichée par le logiciel d’acquisition sur l’écran de l’ordinateur à l’aide du laser RFP. Ensuite, entrez les paramètres de pourcentage de puissance laser et de temps d’exposition pour le laser RFP.

Ensuite, entrez le paramètre de pourcentage de puissance laser et de temps d’exposition pour la lumière laser YFP. Pour chaque puits de la plaque, choisissez un certain nombre de positions différentes qui contiennent une ou plusieurs cellules exprimant le rapporteur. Entrez l’intervalle de temps entre chaque image des tours de temps et le nombre total d’images à prendre.

Revenez sur chaque position et corrigez et mettez à jour la mise au point si nécessaire. Commencez le time lapse et enregistrez les données. Enfin, analysez les données à l’aide du logiciel d’imagerie disponible, comme décrit dans le protocole texte.

Voici un exemple de caspase-2 BiFC suite à des dommages à l’ADN. Les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de la topoisomérase : la camptothécine. La protéine fluorescente rouge, mCherry, a été utilisée comme rapporteur pour montrer que les cellules expriment la sonde BiFC et aident à visualiser le nombre total de cellules.

La fluorescence de Vénus est indiquée en vert et les grands points représentent la proximité induite par la caspase-2. Pour fournir une visualisation à haute résolution de la localisation subcellulaire du complexe d’activation de la caspase, les cellules uniques peuvent être imagées en trois dimensions. L’activation de la caspase-2 est représentée ici en vert et le noyau est représenté en rouge.

La vue en tranches orthoganales de la cellule est illustrée où le plan xy, le plan yz et le plan xz peuvent être visualisés côte à côte. L’image tridimensionnelle peut également être affichée dans un film où la cellule est tournée autour de l’axe y. Pour fournir des données cinétiques de caspase, l’imagerie en accéléré BiFC peut être utilisée.

Cette vidéo montre l’activation de la caspase-2 en vert après un traitement avec l’inhibiteur du protéasome : Bortezomib. Les mitochondries sont indiquées en rouge. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la caspase BiFC pour suivre l’assemblage des complexes d’activation de la caspase en temps réel et pour déterminer distinctement la taille, la forme et la localisation des complexes produits.

Ce protocole décrit quelques approches basées sur le microscope pour recueillir les résultats de l’expérience de caspase BiFC ; Cependant, il convient de noter qu’un certain nombre de variantes et de combinaisons de ces approches peuvent être utilisées pour interroger de manière créative les voies d’activation des caspases. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’inclure des contrôles provenant d’artefacts induits par la microscopie tels que la phototoxicité et le photoblanchiment. Le protocole textuel qui l’accompagne comprend des conseils pour y parvenir.

Le choix de la méthode d’acquisition et d’analyse à utiliser sera déterminé par les périmètres à explorer et la disponibilité des logiciels d’instrumentation et d’imagerie. À la suite de cette procédure, des approches d’analyse d’imagerie peuvent être utilisées pour interpréter les données. Vous pouvez mesurer les changements d’intensité de fluorescence au fil du temps ou le pourcentage de cellules fluorescentes.

Le nombre de foyers ou la taille de l’objet peuvent également être calculés.